Biologia molecolare

Il DNA viene fatto correre sul gel di agarosio posto su un campo magnetico con cariche opposte; in

questo modo si ha la separazione dei frammenti in base alla loro grandezza infatti la molecola più

grande corre sul gel più velocemente.

Però, oltre ad ottenere bande di circa 200, nucleosoma singolo, ottiene anche frammenti di 400-

600-800 a seconda che siano rimasti legati due, tre o quattro nucleosomi. Non è quindi necessario

che la nucleasi tagli tutto il DNA linker. Noil nota quindi che, facendo delle digestioni sempre più

controllate, ma sempre parziali, si hanno dei filamenti di circa 146 paia-basi, unità singole di

protezione della parte proteica. Più piccoli di questi non potevano essercene. Oltre a quelli già visti,

c’è un ulteriore istone definito H1, che tuttavia non appartiene al core (ottamero); l’istone H1 si

posiziona all’esterno per bloccare l’entrata e l’uscita del DNA legandolo ulteriormente.

Gli istoni hanno una grande quantità di amminoacidi Lys e Arg perché il DNA è un poli-anione

perché carico negativamente sulla sua superficie.

Dal momento che Lisina (Lys) e Arginina (Arg) sono gli unici amminoacidi che portano una carica

positiva sulla catena R laterale perchè hanno pKa molto alta dunque sono sempre protonati; sono

dette proteine basiche perché prendono protoni, assumono carica positiva per attrarre la carica

negativa del DNA e stabilizzarla.

Associazione istone: due monomeri ciascuno dell’istone H3 e H4 interagiscono tra loro a formare

un tetramero, mentre gli istoni H2A e H2B formano un eterodimero (unione di due sub-unità di

natura chimica differente). L’ottamero istonico completo si assembla sul DNA in un processo attivo

favorito da differenti proteine. Il tetramero H3-H4 viene assemblato sul DNA a partire da due

dimeri H3-H4; segue poi l’associazione di due eterodimeri H2A-H2B a formare l’ottamero istonico

completo. Questo ha un asse di simmetria di due volte ovvero appare lo stesso quando viene

ruotato di 180°.

La specificità di sequenza del nucleosoma deve essere molto bassa per poter legare ogni sequenza

di DNA; queste proteine quindi cercheranno di fare legami con lo scheletro del DNA che è tutto

uguale, evitando i legami con le basi che richiederebbero molta più specificità e più difficoltà a

legarsi. Per questo motivo l’associazione del DNA con il nucleosoma è mediata da circa 40 ponti H

la maggior parte dei quali si instaura tra gli ossigeni dei fosfati vicino al solco minore. Solo 7 legami

vengono formati da con le basi del solco minore, ma nessuno di questi è in grado di distinguere le

coppie G-C e A-T per non essere sequenza-speficici e fare legame con tutte. Le cariche positive

degli istoni schermano i fosfati favorendo il piegamento del DNA e il contatto delle sue eliche

adiacenti necessario per avvolgere il DNA più volte intorno all’ottamero istonico. Il DNA è un

polimero più rigido rispetto agli altri perché è ricoperto da cariche negative che, quando viene

piegato, lo riportano subito in assetto a causa delle cariche negative opposte che lo respingono.

Questo processo non succede durante il ripiegamento sull’ottamero istonico perché si ha la

neutralizzazione dei fosfati da parte degli idrogeni delle lisine e delle arginine tipiche degli istoni;

fanno ‘sì che il DNA spontaneamente di pieghi sul’ottamero permettendo l’instaurarsi di

un’interazione di carca.

L’istone H1 si lega sia al DNA linker sia nella zona centrale del DNA nucleosomico conferendo

maggiore adesione del DNA all’ottamero istonico. L’aggiunta di H1 determina un aumento della

protezione del DNA di 20 bp. L’aggiunta dell’istone H1 determina un posizionamento a zig-zag dei

nucleosomi. Il DNA comincia quindi a formare un

solenoide, una fibra molto più spessa avvolta

su se stessa. Questi solenoidi si compattano

ulteriormente formando una fibra da 30 nm

che a sua volta forma dei loop.

Questi loop cominciano a formare un’altra fibra ancora più spessa che però necessita di uno

scaffold proteico (impalcatura); contenente loop di DNA sistemati a rosetta fino a creare dei coil

(spirale, molla, avvolgimento) ed infine dei cromatidi.

Due stati diversi di cromatina: l’eucromatina, vista in bianco, che è quella meno compattata e più

accessibile alle proteine, e l’eterocromatina invece è la più densa dunque meno trascrivibile;

questo avviene perché ogni cellula necessita di un determinato gene da trascrivere. La cromatina

non serve solamente come scatola per contenere il DNA, ma anche come repressore di una parte

di DNA non necessaria per la trascrizione. Quando questi geni serviranno, devono esserci degli

enzimi che trasformano l’eterocromatina in eucromatina; l’accesso alla doppia elica dipende dal

grado di compattazione.

Ci sono delle proteine che possono controllare dove si debba iniziare il legame tra il DNA ed il

nucleosoma lasciando del DNA linker libero; queste proteine sono DNA specifiche. Le coppie di

basi A-T si piegano meglio sul solco minore dunque si avvolgono con maggior preferenza.

Le code amino-terminali che fuoriescono dal nucleosoma sono importanti perché determinano la

struttura della cromatina e decidono se deve essere eucromatina o eterocromatina. Si creano

quindi delle modificazioni della parte proteica del nucleosoma, queste modificazioni sono post-

traduzionali; sono più o meno complesse e riguardano la catena laterale dell’amminoacido come

ad esempio metilazione o acetilazione. Così facendo cambiano il modo esterno di vedere la

proteina; in alcuni casi c’è l’attacco di un’altra proteina come l’ubiquitina generando il processo di

ubiquitinazione.

Fino ad ora l’informazione dipendeva solamente dalla sequenza di basi contenute nel DNA; ora

però sulla parte proteica è possibile distinguere i gruppi che hanno subito modificazioni definendo

quali sono le parti da trascrivere e quali no. Si ha quindi l’epigenetica: genetica che non si basa

sulla sequenza delle basi, ma su com’è impacchettata la cromatina e sulle sue modificazioni.

Queste modificazioni rappresentano un livello ulteriore di informazioni, il codice viene scritto sopra

all’informazione.

• Metilazione = aggiungo un -CH₃ ad un azoto

• Acetilazione = la lisina prende un COCH₃ sull’NH; questo non consente al doppietto

elettronico di prendere un H+ rendendola carica positivamente.

Si crea così una perturbazione chimica notevole dal momento che era proprio la carica positiva

della molecola ad attrarre la carica negativa del DNA. Queste modificazioni chimiche servono a

richiamare altre proteine, diventano punti d’aggancio per queste proteine che vanno a modificare

la struttura della cromatina. Quindi le modificazioni non vanno a modificare direttamente il

nucleosoma, ma sono le proteine che si attaccano a causare una modificazione della cromatina.

Le rimanenti modificazioni necessitano un OH; il fosfato lo vanno a prendere dall’ATP e lo attaccano

con una batteria di enzimi.

Esistono delle proteine chiamate Bromodomini e Cromodomini, i cui domini si legano a parti

specifiche degli istoni (ad esempio il bromo dominio alla lisina acetilata di H3); queste

modificazioni sono in grado di essere trasmesse alle estremità vicine, ad esempio la fosforilazione

della serina 10 dell’istone H3 promuove l’acetilazione della lisina 14. Le modificazioni quindi

facilitano o impediscono altre modificazioni su altre code amino-terminali che vanno poi a definire

un ulteriore codice. Queste modificazione possono anche cambiare la carica istonica e modificare il

legame con il DNA, questo è un cambio diretto; solitamente però la modificazione sull’istone è

indiretta ovvero avviene per richiamare enzimi che poi causeranno modificazioni sulla strutture.

Ubiquitinazione e Sumoilazione sono dei procedimenti in cui vengono attaccate altre proteine

tramite un legame peptidico covalente; si crea così un isopeptide (peptide che ha un legame tra il

gruppo carbossi-terminale di un amminoacido e l’ammino-terminale di un altro).

Per esempio, enzimi chiamati istone acetiltransferasi (HAT) legano gruppi acetile alle catene laterali

delle lisine, mentre le istone deacetilasi (HDAC) li rimuovono. Gli istoni sono metilati da enzimi noti

come istone metiltransferasi (HMT) e demetilati da istone demetilasi; le reazioni enzimatiche sono

reversibili. È il riconoscimento di specifiche modificazioni degli istoni da parte delle proteine che

rimodellano la cromatina, e non i cambiamenti chimici dell’istone stesso, a determinare le

conseguenze funzionali della modificazione. Queste proteine sono dette “di rimodellamento”

perché cambiano le strutture istoniche dove sono state richiamate, queste proteine.

Il movimento dei nucleosomi è facilitato da complessi di rimodellamento della cromatina:

I complessi di rimodellamento

contengono sub-unità con

attività ATPasica; vengono

indirizzati verso particolari siti

del cromosoma grazie a sub-

unità che riconoscono fattori di

trascrizione oppure specifiche

modificazioni delle code N-

terminali degli istoni.

La parte delle modificazioni

istoniche non fanno parte del

DNA trascritto e copiato;

dunque teoricamente non dovrebbe essere trasmesso. Però quando la forca replicativa della

Polimerasi passa distrugge gli istoni, li disassembla; questi però devono ricrearsi quando viene

prodotto il secondo filamento se no il DNA non sarebbe in grado di raggrupparsi in cromatina. Di

conseguenza, quando si devono ricreare gli ottameri, si uniscono istoni vecchi disassemblati e

istoni nuovi di nuova sintesi. Gli istoni nuovi non hanno modificazioni epigenetiche quindi è

necessario che gli istoni premodificati richiamino proteine a carico di quelli nuovi così da

modificarli. LA REPLICAZIONE DEL DNA

Meselson e Staal hanno fatto un esperimento determinante che ha confermato la replicazione

semi-conservativa.

I substrati necessari per poter replicare il DNA sono:

• Un filamento che serva da stampo per costruire il filamento successivo; visto che nell’elica i

due filamenti sono antiparalleli si hanno le estremità del desossiribosio 5’ e 3’ con legato un

fosfato. Se si ha un solo filamento il secondo deve essere sintetizzato in direzione

antiparallela.

• Innesco o primer ovvero il punto di aggancio per i nucleotidi che verranno inseriti copiando

il filamento stampo. La sintesi è obbligatorio che avvenga in una sola direzione perché la

polimerasi ha bisogno di un attacco nucleofilo presente solamente nella direzione dell’3’,

caratterizzato da un gruppo OH. Questo innesco deve creare un piccolo tratto con cui

formare un piccolo tratto di doppia elica con un OH libero all’estremità 3’.

• Deossinucleotidi: sono senza l’OH sul carbonio 2, hanno il gruppo ossidrile solo sul

carbonio3. Necessitano di nucleosidi trifosfato così da poter invertire il ΔG (+25 Kj/mol) da

positivo a negativo. L’enzima che si occupa della polimerizzazione del DNA si chiama DNA-

Polimerasi. Il nucleoside trifosfato deve attaccarsi al primer tramite un attacco nucleofilo

compiuto dal gruppo alcolico (OH) che verrà protonato e reso ancora più nucleofilo dalla

polimerasi. L’alcool è nucleofilo per via dei doppietti elettronici dell’ossigeno; l’attacco

nucleofilo avviene sul primo fosfato liberano di PP (pirofosfato), l’aumento del PP però

aumenta finchè non inverte il senso della reazione. Per evitare che questo avvenga l’enzima

pirofosfatasi scinde il pirofosfato in due molecole di fosforo rendendo la reazione

irreversibile e rendendo negativo il ΔG della reazione. Con l’attacco del nucleotide si ha

comunque un’estremità OH che può a sua volta compiere un attacco nucleofilo.

Un’altra funzione della polimerasi è quella di legarsi al filamento stampo così da creare il legame

corretto tra le basi; tutti i nucleotidi possono entrare, ma solo quello giusto riesce a creare delle

interazioni sufficientemente stabili. La Polimerasi è in grado di “leggere” il filamento stampo e di

“capire” qual è la base corretta da inserire perché crea delle interazioni chimiche specifiche. Il

2’deossiribosio (non ha l’OH sul carbonio 2), nel caso si crei un appaiamento corretto tra le basi

(quella inserita e quella stampo), si trova molto vicino all’OH in 3’ del nucleotide precedente il

quale fa un attacco nucleofilo al primo P del nucleoside trifosfato in entrata creando un legame

covalente; si stacca quindi un pirofosfato. Nel caso entri il nucleoside trifosfato sbagliato le

interazioni tra le basi non funzionano correttamente quindi non avvicinano sufficientemente lo

zucchero che non fa in tempo a legarsi quindi è costretto ad uscire. Inoltre questo non riesce a

legarsi correttamente al sito attivo della polimerasi. Il nucleoside trifosfato viene distinto dal

2’nucleoside trifosfato, nella cellula inoltre c’è sia ATP che dATP, grazie ad amminoacidi

discriminatori che sentono la presenza dell’OH del ribosio e li respingono facendo uscire il

nucleoside trifosfato. L’estremità in 3’ con OH è lievemente nucleofilo e quindi aumenta la velocità

di reazione; la polimerasi a questo punto deve facilitare l’entrata della carica dell’OH che viene

respinta dalle cariche negative dell’ossigeno del fosforo. Aspartato e glutammato sono

amminoacidi con una carica negativa. La polimerasi quindi ha nel sito attivo usa due aspartati per

creare un’interazione con il Mg, caratterizzato da due cariche positive, che a sua volta è in grado di

stabilizzare le cariche negative degli ossigeni del fosforo. Oltre al Mg2+ c’è lo Zn2+ vicino all’OH, il

gruppo alcolico si può trovare a pH 7 in forma neutra o protonata anche se l’equilibrio della

reazione è spostata verso la forma neutra. Appena il gruppo si protona lo zinco va a stabilizzarlo

rendendo fissa la carica negativa, si ha un abbassamento della pK ed il risultato è che l’estremità 3’

diventa estremamente nucleofila. Avviene quindi la reazione.

La polimerasi ha anche un’attività esonucleasica perché, nel caso essa commetta un errore che

non le permetta di proseguire la duplicazione, ha la possibilità di eliminare l’ultimo nucleotide per

continuare.

Le interazioni di steaking sono interazioni di Van der Waals che si creano tra una base e quella

sopra o quella sotto; quando questa avviene significa che nel sito attivo è entrata la base corretta;

è un ulteriore controllo del nucleotide inserito. La polimerasi è un enzima processivo ovvero è in

grado di rimanere attaccato al DNA per moltissimo tempo; viene inoltre aiutato dalla sliding

clamp: proteina (in italiano chiamata pinza scorrevole) che si aggancia al DNA e alla Polimerasi

tenendoli uniti. Si crea quindi un complesso inscindibile fino al termine della duplicazione.

La DNA polimerasi possiede quindi attività esonucleasica. Nella cellula la DNA polimerasi compie

un errore ogni base. La complementarietà delle basi nel sito attivo garantisce un’accuratezza pari

ad un errore ogni base; l’attività esonucleasica di correttore di bozze abbassa la frequenza di errore

a uno ogni. L’accuratezza della replicazione osservata nelle cellule viene raggiunta con l’ausilio di

meccanismi enzimatici di riparazione del DNA. La polimerasi deve essere sia fedele che veloce; non

potendo diminuire la velocità della replicazione, è ovvio che si creino più errori.

Ci sono due tipi di attività esonucleasica:

3’→5’ esonucleasica, è in grado di tornare indietro togliendo l’ultimo nucleotide aggiunto

5’→3’ esonucleasica, apparentemente non serve, in realtà è comunque fondamentale.

Si riferiscono all’estremità in cui la polimerasi è il grado di tagliare; per capire il senso di direzione

ricordati che i filamenti sono antiparalleli e che la polimerasi aggiunge nucleotidi all’estremità 3’.

Dal punto di vista chimico la polimerasi si accorge di aver sbagliato perché, essendo l’appaiamento

sempre purina-pirimidina, la lunghezza di legame, maggiore con due purine e minore con due

pirimidine, è diversa. Di conseguenza la deformazione rallenta la sintesi consentendo con maggiore

probabilità l’entrata del legame sbagliato nella tasca esonucleasica della polimerasi che, essendo

ricca di acqua, idrolizza subito il legame. Si tratta di un problema sterico.

Essendo il DNA a doppio filamento, è necessaria una separazione dei due sui quali

successivamente verrà fatta la duplicazione. I filamenti però non vengono separati per intero

perché sono troppo lunghi quindi, una volta separati, si attorciglierebbero in strutture troppo

complesse che non sarebbero più leggibili. La polimerasi quindi divide solamente la zona in cui

avviene la duplicazione; si formano delle forcelle di replicazione molto più piccole rispetto alla

lunghezza del DNA.

Ci sono due diverse polimerasi che si occupano dei due differenti filamenti:

una sintetizza in modo continuo perché può aggiungere nucleotidi singoli all’estremità 3’;

l’altra invece ha l’estremità 5’ libera quindi deve sintetizzare in modo discontinuo creando vari

piccoli frammenti detti “filamenti di Okazaki” lunghi 200-300 nucleotidi. Con i frammenti si ha

quindi una limitazione del DNA a singolo filamento.

Si creano quindi due frammenti, uno continuo e uno interrotto. Si attiva quindi la DNA primasi che

non è una DNA polimerasi, ma una RNA polimerasi; questo sintetizza i primer necessari alla DNA

polimerasi per sintetizzare i frammenti. Le RNA polimerasi sintetizzando RNA e possono iniziare a

trascrivere senza la necessità di un’estremità 3’-OH. La cellula ha fatto in modo che la DNA-

polimerasi non fosse in grado di inserire un nucleotide senza estremità OH così da evitare

replicazioni non necessarie; è necessaria una primasi che si attiva solamente durante il ciclo

cellulare. La primasi, essendo RNA-polimerasi aggiunge ribonuceotidi, non deossiribonuceotidi;

RNA e DNA sono legati tra loro tramite un legame covalente fosfodiesterico. La polimerasi aggiunge

nucleotidi fino all’estremità 5’ creata in precedenza dall’RNA primer; non si lega, lascia uno spazio

detto NICK.

Ci sono quindi due problemi: L’RNA primer che deve essere eliminato e i nick che vanno saldati.

Per togliere l’RNA devo avere una DNA-polimerasi con attività 5’→3’ che stacchi il ribonucleotide.

Si crea quindi un GAP, spazio in cui la DNA-polimerasi aggiunge un desossinucleotide.

Si va avanti così finché non finisco il primer a RNA e non completo la sostituzione. Il nick però

rimane, viene spostato, ma rimane; questa reazione si chiama nick-translation.

Si ha alla fine una reazione tra due nucleosidi monofosfati, questa non può avvenire perché il

ΔG>0. Si ha quindi bisogno della DNA-LIGASI, enzima che attiva il fosfato; nel suo sito attivo ha una

Lys-(CH₂)₄-ṈH₂.

Il doppietto elettronico fa un attacco nucleofilo al NAD rompendo il legame fosforico. La carica

negativa del P del DNA fa un attacco nucleofilo al P dell’ADP che è rimasto attaccato al sito attivo

della ligasi creando così un legame di-fosfato attivando l’estremità del DNA. Questa, avendo un

legame energetico molto forte, è il grado di fare un attacco nucleofilo all’estremità 3’ del secondo

pezzo di DNA a cui doveva attaccarsi; si crea così il legame completando il processo e producendo

AMP. →

La DNA elicasi apre la doppia elica e le proteine SSB si legano al ssDNA in modo cooperativo per

non farle richiudere; le topoisomerasi rimuovono gli avvolgimenti positivi introdotti

dall’avanzamento della forca replicativa.

La sliding clamp viene posizionata sul DNA in corrispondenza del complesso stampo: innesco dal

posizionatore delle sliding clamp con l’utilizzo di ATP. Rilasciata la polimerasi, la sliding calmp

richiama altre proteine come quelle coinvolte nella ripartizione dei frammenti di Okazaki o per

l’assemblaggio dei nucleosomi (PCNA fa interazione con CAF-1: Proliferating Cell Nuclear Antigen;

stabilisce un legame molecolare tra l'assembramento della cromatina e i processi di replicazione e

riparo del DNA).

La sliding calmp viene rimossa dal DNA quando non è più utilizzata.

C’è quindi bisogno di un’elicasi che separi i due filamenti, con questa separazione però si creano

dei superavvolgimenti positivi a cui provvederanno le topoisomerasi. I filamenti guida e ritardato

sono accoppiati grazie alla formazione di un’ansa. Il filamento ritardato è strutturato ad ansa

unitamente ad un frammento di Okazaki completo e ad una molecola di polimerasi III che sta

completando la sintesi del successivo frammento di Okazaki. Un nuovo innesco è in via di sintesi da

parte della primasi nell’ansa del filamento ritardato. Il filamento guida viene sintetizzato in modo

continuo e l’intera forcella si muove verso destra. Il replisoma (complesso multi proteico-

enzimatico) che si muove con la forcella contiene due molecole di DNA polimerasi III legate ad una

pinza scorrevole e tenute assieme da una proteina τ.

C’è quindi una proteina τ che tiene collegate le due DNA polimerasi al cui centro c’è l’elicasi; le SSB

(proteine in grado di legarsi al DNA a singolo filamento così da evitare che si riformi l’elica)

mantengono stabile il lungo filamento singolo che aspetta di essere duplicato dalla polimerasi con i

frammenti di Okazaki. L’attività della elicasi è stimolata dal contatto con la DNA polimerasi. Tutto

questo complesso (elicasi, polimerasi, proteine) è detto replisoma.

modello del replicone.

Fase di inizio replicazione: il

Caratteristica particolare dei batteri è quella di avere un DNA circolare il che consente facilmente di

creare e svolgere superavvolgimenti. La replicazione di questo genoma avviene partendo da un

punto preciso detto Ori-C, è l’origine della replicazione. La sequenza del DNA in questo caso è

anche segnale ovvero non è semplicemente portatore dell’informazione. Il DNA di Coli è composto

da 4x10⁶ paia di basi.

La replicazione di E.Coli può avvenire in una sola direzione (unidirezionale)o in due direzioni

opposte (bidirezionale). Quest’ultima dovrà creare una bolla replicativa con due forcelle di

replicazione caratterizzata ognuna da due polimerasi. Ci sono quindi in totale 4 polimerasi uguali a

2 a 2. Per capire quale delle due replicazioni usa il batterio è stato fatto un esperimento con

nucleotidi radioattivi: questi vengono inseriti nel DNA durante la replicazione. Si mettono all’inizio

nucleotidi radioattivi, poi vengono inseriti quelli normali e alla fine del processo (20’) si inseriscono

nuovamente nucleotidi radioattivi. In questo modo, se avessimo una replicazione monodirezionale,

avremmo dNTP radioattivi solo all’inizio e alla fine mentre al centro sarebbe DNA non radioattivo.

Se invece, con lo stesso esperimento, la replicazione fosse bidirezionale avremmo DNA radioattivo

vicino a Ori-C e dalla parte opposta del cerchio dove dovrebbe terminare la replicazione.

ORI-C è una sequenza di 250 basi con delle sequenze in tandem (ripetute) che costituiscono un

segnale per l’inizio della replicazione. È presente la DNA-A che non taglia il filamento, ma consente

l’avvolgimento sinistrorso attorno ad essa; questo facilita l’apertura della doppia elica creando una

bolla di denaturazione. A questo punto è necessaria l’elicasi, proteina che separa i due frammenti

di DNA formando la struttura su cui si legheranno le polimerasi e le primasi. Entrambi i filamenti

hanno bisogno della primasi, anche il filamento continuo necessita di un innesco iniziale;

successivamente si inserisce la sliding clamp e si procede con la replicazione.

Per la fine replicazione ci sono dei segnali detti “terminatori” messi in fondo i quali sono

caratterizzati da una polarità; una delle due polimerasi si blocca e attende che l’altra la raggiunga,

quando si incontrano finisce la replicazione.

Il tempo necessario per sintetizzare tutto il genoma si trova facendo il numero di basi rapportato al

tempo impiegato per la replicazione. Interessante è il fatto che il genoma che viene dato alla

cellula figlia è già parzialmente duplicato perché la seconda replicazione era iniziata poco dopo

l’inizio della prima. Si ha quindi la creazione di altre forme di replicazione dai due Ori-C che

vengono a crearsi dopo la prima duplicazione; in totale si hanno quindi 6 coppie di polimerasi che

lavorano contemporaneamente: 2 durante la prima, 4 per la divisione del genoma delle due cellule

figlie originatesi dalla prima replicazione. Con questo meccanismo si ha l’aumento della velocità di

replicazione; si potrebbe però avere un problema con la formazione continua di tutte queste

forcelle di replicazione. Teoricamente, a livello chimico-fisico, il filamento nuovo non si distingue

dal filamento stampo; questo però succede perché sul filamento nuovo sono presenti delle

modificazioni sulle basi che vengono considerate dei segnali.

Gli atomi nel solco maggiore possono subire, dopo essere stati sintetizzati, delle modificazioni che,

essendo sul solco maggiore, non vanno ad interferire l’accoppiamento delle basi. Ad esempio la

metilazione dell’adenina può avvenire su sequenze palindromiche (GATC) su cui agisce un enzima,

la dam-metilasi: questa attacca un metile su entrambe le adenine di entrambi i filamenti. La

polimerasi non inserisce nucleotidi metilati, questi vengono metilati successivamente; quando

viene sintetizzato il nuovo DNA, questo non viene metilato subito quindi le sequenze GATC

template sono metilate mentre quelle nuove no. Si ottiene quindi un DNA emi-metilato fino a

quando una Dam-metilasi riconosce la sequenza e metila anche il filamento nuovo. Questo fa ‘sì

che ci sia una finestra temporale in cui i filamenti siano emi-metilati permettendo che i due Ori-C

nuovi siano emi-metilati. La DNA-A quando si lega ad DNA incomincia la replicazione, però questa

è in competizione con un’altra proteina, la Seq-A che si lega alle origini di replicazione emi-

metilate. La DNA-A quindi non può legarsi finché c’è la Seq-A che blocca le origini di replicazione e

di conseguenza anche la replicazione stessa. Il distacco della Seq-A permette l’arrivo della Dam-

metilasi che metila anche l’altro filamento impedendo nuovamente il legame di Seq-A e

permettendo il legame della DNA-A. La metilazione del DNA permette il ritardo dell’inizio della

replicazione così che non si creino infinite forcelle e che si intralcino tra loro.

I cromosomi degli eucarioti hanno più inizi di replicazione se no impiegherebbero moltissimo.

Dalla replicazione del DNA umano ottengo due filamenti duplicati a cui però manca un gap iniziale

che non posso riempire perché mi manca un 3’; alla seconda duplicazione quindi mancherà un

pezzo di coda perché non ci stava più il primer. Andando avanti con le duplicazioni, si ripresenta il

problema delle sub-unità lineari che porterebbe alla progressiva diminuzione del DNA. I procarioti

hanno quindi risolto il problema rendendo il DNA circolare; gli eucarioti invece hanno il DNA

lineare quindi devono risolvere in altro modo. Utilizzano quindi una proteina (tirosina, serina e

treonina) con un’estremità OH che viene usato come 3’ e come primer alternativo. La strategia

usata invece dal genoma umano è quello di creare delle false estremità con informazioni casuali

che possono tranquillamente essere tralasciate durante la replicazione. Ogni duplicazione quindi la

cellula ha il compito di ricreare, tramite una proteina, queste false estremità dette telomeri che

possono essere private di alcune basi senza che l’informazione complessiva ne risenta. Il risultato è

che l’estremità 3’ è sempre più lungo rispetto al 5’; i telomeri vengono aggiunti dalla telomerasi:

una particolare polimerasi che necessita in ogni caso del 3’. Manca tuttavia lo stampo, questo è

intrinseco all’enzima stesso; è formato da una molecola proteica e da un filamento di RNA che avrà

una direzione antiparallela rispetto al filamento nuovo da allungare; viene quindi copiata la

sequenza dell’RNA contenuto nella telomerasi. Questa pian piano si sposta permettendo di copiare

ripetutamente la sequenza tramite un processo di trascrittasi inversa: polimerasi che usano l’RNA

come stampo. A questo punto si può aggiungere un primer che copi sia la sequenza in 5’

dell’informazione, che prima non era possibile copiare, sia la sequenza “inutile” copiata dallo

stampo di RNA.

La lunghezza dei telomeri viene regolata da proteine che si legano al telomero ed inibiscono

l’azione della telomerasi; maggiore è la lunghezza del telomero, maggiore è il numero di proteine

legate e quindi maggiore è l’inibizione della telomerasi.

Coloro che hanno rivoluzionato l’approccio alla biologia sono stati:

• Frederick Sanger (1977) che permise di perfezionare una metodologia per sequenziare il

DNA; si ha quindi la possibilità di scrivere la sequenza.

• Steve Jobs (1976), associato a Sanger per quanto riguarda la memorizzazione automatica a

computer della sequenza a cui è possibile risalire anche dal personal computer. Diventa

quindi possibile avere sequenze complete di DNA.

• Mullis (1985) che mette a punto una possibile applicazione della sequenza a catena della

polimerasi; non scopre nulla, ma riesce ad assemblare dei concetti base essenziali. Lui è

l’inventore della PCR.

Reazione a catena della PCR:

Per fare dei match di parentela basta concentrarsi su delle sequenze altamente variabili diverse tra

individui diversi, ma molto simili tra parenti; c’è da prendere una determinata sequenza dall’intero

genoma di 6.4 miliardi di pb. Si sceglie un primer (oligonucleotide) la cui sequenza non è casuale,

deve infatti essere complementare, sempre considerando che i filamenti devono essere

antiparalleli, al filamento singolo templato che ho scelto di considerare. Questi li metto in

soluzione assieme ad acqua e sale per neutralizzare le cariche negative dei due filamenti; devono

essere minimo 20 amminoacidi. Il filamento più piccolo, una volta che si è legato, funziona da

innesco; posso quindi aggiungere deossinucleosidi trifosfati liberi e una polimerasi così da

catalizzare la sintesi dell’elica. Nella sintesi cellulare il primer viene prodotto dalla primasi quindi

solitamente è RNA; il filamento comprato invece ha il primer costituito da DNA, non è quindi

necessario sostituirlo alla fine della sintesi.

Se invece si prende un filamento a doppia elica, invece di avere un solo oligonucleotide ne

prendiamo due complementari alle parti opposte dei filamenti così da avere sempre l’estremità 3’-

OH libero. Per dividere i filamenti di una doppia elica è sufficiente aumentare la temperatura

causando un aumento della denaturazione: denaturazione termica a 95°C. Portando

successivamente la temperatura totale al valore di Melding si dà la possibilità agli oligonucleotidi di

legarsi ai filamenti stampo; con l’azione della polimerasi si ottengono quindi due doppie eliche

uguali a quella iniziale. Il problema è che a 50°, se riescono ad appaiarsi i due oligonucleotidi, è più

probabile che si riuniscano i due filamenti grandi che creano un composto molto più stabile. Per

favorire la reazione tra l’oligonucleotide e il DNA a singolo filamento (ssDNA) è necessario usare

una concentrazione altissima di oligonucleotide che a temperature minima si lega molto più

velocemente. Per evitare che i due filamenti si ricolleghino è necessario rialzare la temperatura

così da sfavorire la formazione dell’elica e favorire il legame con l’oligonucleotide. A questo punto si

incomincia con la polimerasi a sintetizzare i nuovi filamenti. Una volta finita la duplicazione si può

nuovamente scaldare la temperatura così da staccare i due filamenti complementari di neosintesi

dai rispettivi stampi per permettere un nuovo legame con gli oligonucleotidi messi in abbondanza

all’inizio. Rifacendo questo processo da due eliche ne ottengo quattro e da quattro ne ottengo otto

e da otto poi sedici. In questo modo ho la possibilità di amplificare in modo esponenziale il DNA

iniziale.

Ulteriore problema è l’inattivazione della polimerasi quando si scalda il composto poiché essa è

una proteina; la soluzione è o rimetterla tutte le volte che si abbassa la temperatura (ma la

polimerasi costa molto) o inserire delle proteine dei batteri termofili in grado di sopravvivere ad

alte temperature.

La duplicazione avviene quindi ad una temperatura media 72° per un minuto circa visto che la

polimerasi fa circa 800 basi al secondo, una volta terminata rialzo la temperatura a 90° per dividere

le eliche di neosintesi, riabbasso a 50° per pochi secondi per permettere il legame con

l’oligonucleotide e poi rialzo a 72°. I cicli che si possono fare sono infiniti.

Per duplicare un filamento è sufficiente conoscere la sequenza iniziale e finale complementare ai

primer; ci basta sapere la sequenza delle estremità.

Nel 2001 è stato interamente sequenziato il genoma umano quindi sono a conoscenza delle

sequenze delle estremità che mi permettono di conoscere i legami di parentela.

Al terzo ciclo di duplicazione compare un frammento a doppia elica che è uguale al segmento

cercato; dal terzo ciclo in poi incominciano a formarsi filamenti in modo esponenziale mentre

quelli lunghi ad un certo punto si arrestano. Dopo svariati cicli si ha quindi che il 90% del DNA in

provetta è costituito dalla sequenza desiderata.

Principali applicazioni della PCR:

• Identificazione di agenti patogeni nell’uomo, negli animali e negli alimenti (batteri e virus).

• Identificazione di organismi geneticamente modificati (OGM).

• Analisi del DNA in medicina legale (es. test di paternità).

• Diagnosi pre-natale di malattie genetiche

• Diagnosi di malattie tumorali

• Clonaggio e sequenziamento di prodotto PCR

Sequenziamento:

La metodica principalmente utilizzata finora si basa sul metodo della terminazione della

catena sviluppato da Frederick Sanger. Questa tecnica si basa sull'utilizzo di nucleotidi modificati

(dideossitrifosfato, ddNTPs) per interrompere la reazione di sintesi in posizioni specifiche lungo la

sequenza.

I dideossinucleotidi o ddNTP, sono deossiribonucleotidi sintetici che presentano lo

zucchero desossiribosio privo del gruppo ossidrilico in posizione 3'. Il deossiribosio manca già del

gruppo ossidrilico in posizione 2'. La mancanza di questo gruppo ossidrilico 3' comporta che, dopo

essere stato aggiunto da una DNA polimerasi ad una catena nucleotidica crescente, non possono

essere aggiunti ulteriori nucleotidi dato che nessun legame fosfodiesterico può essere formato.

Il metodo sviluppato da Frederick Sanger e collaboratori (il cosiddetto metodo della terminazione

della catena, chain termination method) è un metodo cosiddetto enzimatico, poiché richiede

l'utilizzo di un enzima. Il principio della tecnica sviluppata da Fred Sanger si basa sull'utilizzo

di nucleotidi modificati (dideossitrifosfato, ddNTPs) per interrompere la reazione di sintesi in

posizioni specifiche. Nella reazione di sequenziamento, l'estensione è iniziata in un sito specifico

del DNA utilizzando un oligonucleotide primer complementare alla regione del DNA ed avviene ad

opera di una DNA polimerasi che utilizza i quattro deossinucleotidi (dATP, dCTP, dGTP, dTTP).

Insieme a questi, vengono introdotti i dideossinucleotidi i quali, una volta incorporati dalla DNA

polimerasi nella sintesi del filamento, ne provocano il blocco. Introducendo questi "bloccanti" in

quantità basse, si avrà una serie di filamenti di diversa lunghezza, in base a dove tali bloccanti sono

stati incorporati. Questi ddNTPs sono solitamente anche marcati (radioattivamente o

per fluorescenza) in modo da poterli visualizzare successivamente.

I frammenti vengono poi separati in base alla loro lunghezza su di un gel, si utilizza il gel di agarosio

che ci permette di separare frammenti che differiscono come lunghezza anche di una singola base,

quindi vengono visualizzati su lastra fotografica o su gel (a seconda del tipo di marcatura). Se i

ddNTPs sono stati marcati radioattivamente sono presenti bande scure che corrispondono ai vari

frammenti di lunghezza diversa. Le posizioni relative delle bande nelle quattro corsie sono

utilizzate per leggere la sequenza (dal basso verso l'alto).

In base alla lunghezza del filamento trovato posso trovare la posizione di quella determinata base.

Ovvero: se inserisco ddGTP, la replicazione si bloccherà sulla base G interrompendo il filamento

neo sintetizzato; sul filamento stampo si sa quindi che in quella posizione c’è la base

complementare. (se blocco la G, sullo stampo c’è la C). La lunghezza dei frammenti corrisponde alla

posizione della base ddNTP complementare; per determinare quale dei due filamenti sto

guardando uso basi diverse mentre per la lunghezza uso l’elettroforesi su gel. Non serve la

lunghezza assoluta, basta partire dal punto più corto e per capire che base è guardo in che provetta

l’ho inserita. Il sequenziamento che il problema opposto rispetto alla PCR: bisogna cercare di

interromperlo. Il filamento deve essere suddiviso in tutti i possibili filamenti tutti uno più corto

dell’altro di una singola base. Devo avere una strategia per formare tutti quelli che finiscono con

una determinata base: basta fare una reazione con tutti i nucleotidi (4dNTP dove N sono ATGC) e

tutti i dideossinucleotidi che portano modificazioni (4ddNTP dove N sono ATGC).

MUTABILITÁ E RIPARAZIONE DEL DNA:

Il DNA però può essere malleabile quindi possono originarsi delle variazioni o mutazioni

cambiando così la sequenza delle basi; non tutte le mutazioni causano malattie.

Mutazione: cambiamento della sequenza, si ha un cambiando nel significato dell’informazione

trasmessa; queste mutazioni spesso derivano da delle modificazioni. Il DNA può subire molte

modificazioni ovvero dei cambiamenti di base, queste però possono essere riparate; diventano

mutazioni delle modificazioni che non vengono riparate. Generalmente il DNA esposto all’ambiente

(ad esempio dai raggi UV) subisce svariate modificazioni che la cellula non sarebbe in grado di

sopportare come cambiamento di informazione. C’è quindi una batteria di enzimi che permette di

riparare il DNA cancellando la modificazione rimettendolo a posto com’era prima impedendo che

queste mutazioni avvengano. La modificazione diventa mutazione quando avviene la replicazione;

ogni tanto le polimerasi sbagliano e la frequenza d’errore aumenta se ci sono delle modificazioni

sulla informazione iniziale. Quando la base modificata entra nel sito attivo della polimerasi, questo

non la riconosce e ci sarà una probabilità più alta che la DNA polimerasi inserisca la base sbagliata.

Il sistema di riparo deve sistemare le modificazioni prima che arrivi la DNA polimerasi se no questa

non riconosce la base e sbaglia.

I vari gruppi delle basi possono subire delle modificazioni come, ad esempio, l’acidificazione del

DNA che favorisce il distaccamento delle basi le quali sono appaiate per una complementarietà di

forma e di carica, ma, se qualcosa si interpone tra le due, si creano degli ingombri che non

permettono il corretto appaiamento. All’interno del solco minore e del solco maggiore possono

arrivare dei composti che reagiscono con le basi, visibili dall’esterno, o che si infilano nei solchi;

questi sono detti composti intercalanti e vanno ad alterare la struttura del DNA. Alcune polimerasi

sono fatte apposta per avere una selezione del nucleotide corretto diminuita permettendo così di

continuare la duplicazione riuscendo in questo modo a duplicare interamente il genoma anche se

con degli errori. Le polimerasi tendono, infatti, a non fermarsi a costo di inserire degli errori; per

questi ci sono degli enzimi che hanno la capacità biochimica di andare a riparare dei nucleotidi.

MODIFICAZIONI:

• Depurinazione: Viene mantenuto lo zucchero ma si stacca una base (purina)

• Deaminazione: della citosina da parte dell’acqua che cambia il gruppo amminico in un

gruppo chetonico. È una modifica chimica diretta che consente la trasformazione della

citosina in uracile; ma la timina sostituisce nel DNA l’uracile quindi quando la polimerasi lo

riconosce sa per certo che è una deaminazione. Il problema avviene quando si ha la 5metil-

citosina che, se viene deaminata diventa 5metil-uracile e quindi una timina.

• Alchilazione: come ad esempio la metilazione di una guanina sulla faccia 5’-3’

Mismatch: Si ha un’incorporazione errata di una base. Diventa un problema alla duplicazione

successiva perché un filamento verrà duplicato correttamente mentre nell’elica che avrà il

filamento che ha subito modificazione avrà una coppia di basi differente. Questo può essere

riparato sapendo che il filamento stampo è metilato mentre quello di neosintesi non ancora. Gli

enzimi riparatori vedono l’errato appaiamento, vedono che un filamento non è metilato quindi

sanno che è quello di neosintesi e quindi capiscono che la base inserita sbagliata è quella poiché la

polimerasi si è probabilmente sbagliata.

Meccanismi di riparo:

→

-mismatch quando gli enzimi riparatori vedono che c’è un errore tagliano interamente un

frammento di DNA così che si possa legare nuovamente la polimerasi per risintetizzare il filamento

in modo probabilmente corretto. Alla fine si crea un nick poi colmato da una Ligasi. L’errore viene

riconosciuto dalla proteina MUTS-DNA che va a controllare l’ampiezza dell’elica; nel caso ci sia un

errore MutS si blocca e richiama altre proteine (MutL e MutH) che guardando la metilazione

capiscono il filamento da correggere (quello non metilato di neo-sintesi). MutH è un’esonucleasi in

grado di togliere e tagliare nucleotidi partendo dal cento, crea quindi un gap che poi viene ripreso

e sistemato dalla polimerasi e dalla ligasi. MutL stabilisce quale dei due filamenti sia metilato.

→

-Sequenze ripetute Possono creare delle forcine il che causa lo slittamento dell’intero filamento

di alcune basi. →(ad

-mutazioni dovute al danno idrolitico esempio la depurinazione). La metilazione non può

aiutarci, l’enzima che si occupa della riparazione deve riconoscere in modo specifico il mismatch

specifico per l’appaiamento, sono dette glicosidasi. Questi rompono il legame tra la base e lo

zucchero, lo fanno per far vedere che manca la base, viene creato un nick dove poi la DNA

polimerasi e la ligasi risolveranno. Anche l’appaiamento T:G viene tolto perché derivato da una

deaminazione della 5metil-citosina. Questi enzimi spostano la base nella loro tasca dove la

tagliano.

Molecole poco reattive che, essendo planari possono diventare degli intercalanti: entrano nel DNA

dove si mettono tra una molecola e l’altra. Quando il DNA deve duplicare con gli intercalanti sposta

delle basi quindi o la polimerasi salta la base o ne aggiunge altre non necessarie.

Per correggere una trasformazione chimica la cellula deve produrre una proteina (metiltransferasi

con un gruppo –SH) che fa una singola reazione per togliere un metile alla O6-metilguanina e poi

viene degradata; la spesa energetica è alta, ma necessaria. Questa è una riparazione diretta senza

che vengano degradati interi segmenti di DNA.

Molecola forte mutageno: 5bromo uracile. È un uracile con un bromo in posizione 5 che può

essere scambiato per una timina che ha il Br invece che il metile; differenza sostanziale è

l’elettronegatività maggiore nel Br che tende a dare tautomeria. Il bromo in forma chetonica è

donatore di ponte idrogeno, invece la forma enolica è accettore; preferisce la forma enolica quindi

invece di legarsi all’adenina si lega alla guanina. Se questi mismatch sono in numero elevato allora i

sistemi di riparo non riescono a correggerli tutti causando mutazione puntiforme nella successiva

replicazione. Tutto questo è causato dallo sbilanciamento della carica verso il bromo (δ+δ-).

Altre sostanze sono:

Il bromuro di etidio che aumenta la sua fluorescenza quando intercalata nel DNA; può intercalarsi

facilmente perché è planare. Questo non altera la struttura chimica delle basi, ma causa un

mancato collegamento tra le due basi rendendo difficile alla polimerasi di riconoscere la distanza

delle basi causando inserimento o delezioni delle stesse. Se ci sono gli intercalanti la probabilità di

sbagliare aumenta.

La 8oxoGuanina è causata dalle radiazioni ionizzanti che generano forme di ossigeno reattive (O2,

H2O2, OH°) che ossidano la guanina. Un nucleotide può avere conformazione sin se la base è girata

verso il fosfato o anti se è girata dalla parte opposta; quest’ultima è la conformazione più stabile

perché ha minor ingombro sterico. Pur non andando a modificare gli atomi coinvolti

nell’appaiamento Watson e Crick poiché avviene nella faccia opposta, la 8oxoGuanina ha un

doppio legame di ossigeno, molto

elettronegativo, che va a respingersi con la

carica negativa dello zucchero.

Questo causa una rotazione

della base da anti a sin

causando il cambio totale

della faccia Watson e Crick.

Nella forma sin la maggior

parte dell’ingombro della

guanina viene portato fuori

facendo sì che nel sito attivo

si leghi meglio un’adenina

invece di una citosina. Si creano quindi degli appaiamenti di Hoogsteen che alla replicazione

successiva diventerà una mutazione puntiforme.

Un altro danno, che ora non riguarda più gli agenti chimici, riguarda delle radiazioni UV che

possono essere assorbiti dalle basi del DNA. Questo assorbimento causa la formazione di dimeri di

timina ovvero ci sono due timine sullo stesso filamento. La lunghezza di legame C-C è 1,5 Å mentre

la distanza tra le basi su uno stesso filamento è 3,4Å; per crearsi quindi un legame covalente tra

due timine sullo stesso filamento le basi si avvicinano. A questo punto la DNA polimerasi non ha il

sito attivo corretto quindi si blocca, pericolo molto grande per la cellula

Sistemi di riparo:

• Fotoriattivazione: i dimeri di timina vengono riconosciuti da un enzima che li fa reagire

rompendo il legame C-C. Questo enzima usa il FADH e la luce che riesce a far retrocedere la

reazione riportando le due basi nella posizione corretta.

• Escissione di basi: usata per la 8oxoGuanina. Agisce un enzima glicosidasi specifica per la

8oxoluanina che va a rompere il legame glicosidico tra zucchero e base togliendo

quest’ultima. Quando però si ha un DNA a-purinico o a-pirimidinico agisce un’endo-nucleasi

che rompe i nucleotidi prima e dopo creando un gap riempito poi dalla polimerasi e dalla

ligasi. In questo caso però, se le endo-nucleasi non avvengono in tempo prima della

replicazione e questa avviene, si ha una glicosidasi particolare, definita di sicurezza, che

toglie la A inserita nel nuovo filamento inserendo la C e poi la glicosidasi precedente va a

togliere la 8oxoguanina inserendo la guanina giusta.

• Escissione nucleotidica: usata per i dimeri di timina. Il dimero di timina determina sul DNA

uno schiacciamento del filamento che viene riconosciuto da enzimi (non c’è bisogno di

riconoscere la metilazione) chiamati UVR (A-B-C-D) che sono delle endo-nucleasi e tagliano

pochi nucleotidi a destra e a sinistra. Il frammento di DNA va staccato quindi ci sono delle

elicasi che rompono i legami idrogeno creando un GAP riempito poi da una polimerasi, una

ligasi per sistemare il Nick.

• Rotture a doppio filamento: se si perde un frammento di doppio filamento, viene persa

dell’elica. Molte cellule, essendo diploidi, possiedono l’informazione sia su due filamenti

che sui due filamenti del cromosoma omologo.

Questo avviene grazie ad alcuni enzimi che processano le estremità diventando sfalsate e

creando l’opportunità di avere ricombinazione. Si crea quindi uno stampo copiato dall’altro

cromosoma da cui si può prendere l’informazione per completare il tratto mancante

dell’altro filamento. (guarda foto). Nel caso estremo in cui non ci sia un cromosoma

omologo si legano le due estremità nella speranza che non sia stato perso nulla di vitale.

Proprietà ricombinativa dei dimeri di timina: la forca di replicazione, se incontra una lesione, si

blocca; gli enzimi di ricombinazione promuovono lo scambio dei filamenti consentendo alla

polimerasi di saltare il dimero. Sintesi translesione: Se c’è molto DNA a singolo

filamento la cellula lo recepisce come danno quindi si

attiva la proteina Rec-A attivando i sistemi di riparo. Tra

queste ci sono le DNA-polimerasi translesione: sono

normali polimerasi che però hanno la caratteristica di

avere un sito attivo più permissivo rispetto alle

polimerasi III che fanno la replicazione. Questo significa

che nella polimerasi normali, dette ad alta accuratezza,

si può fare solamente un legame; nelle polimerasi più

permissive, dette a bassa fedeltà, non riescono a

definire esattamente il nucleotide corretto. Quando la

polimerasi III si blocca a causa del dimero di timina

viene sostituita dalla polimerasi translesione che

permette di passare di dimero, ma che probabilmente

inserisce un errore che se non corretto causa una

mutazione puntiforme. Le DNA polimerasi della famiglia

Y permettono di effettuare la sintesi translesione: l’attività di pol IV e pol V è dipendente dallo

stampo, ma i nucleotidi vengono incorporati in modo indipendente dall’appaiamento delle basi.

Ciò implica che la sintesi translesione introduca molto spesso degli errori. Data l’elevata frequenza

di errori, le polimerasi translesione non sono presenti nella cellula in condizioni normali ma

vengono espresse durante la risposta SOS.

Tomas Lindahl (scopre l’escissione delle basi), Paul Modrich (riparazione dei mismatch), Aziz Sancar

(scopre l’escissione dei nucleotidi); hanno preso il nobel tutti e tre insieme. Questi tre sistemi di

riparo, nel caso non funzionino, causano anche tumori.

LA TRASCRIZIONE:

La trascrizione è quel processo per cui da un segmento di DNA si produce un filamento di RNA; la

prima grossa differenza tra i due è che l’RNA è a singolo filamento dunque non è più necessario

portare avanti una bolla di replicazione. Si ha quindi la produzione di RNA per sintetizzare

successivamente le proteine.

La trascrizione è più semplice della duplicazione perché si deve produrre solo un filamento; si

devono sempre usare nucleosidi attivati quindi c’è bisogno di nucleosidi trifosfati, ma non saranno

deossinucleotidi ma semplicemente ribonucleotidi. Viene trascritto solo una parte quindi i

nucleotidi necessari sono molto meno, si usa una RNA polimerasi e sono necessari imput d’inizio e

di terminazione. Oltre alle sequenze dell’informazione ci possono essere segnali d’inizio e di

terminazione; la polimerasi riconosce questi segnali e produce l’RNA messaggero.

La trascrizione è la sintesi di RNA DNA-dipendente. La trascrizione è chimicamente ed

enzimaticamente molto simile alla replicazione del DNA; le differenze più importanti sono:

• Nella trascrizione la nuova catena è costituita da ribonucleotidi anziché

deossiribonucleotidi

• La RNA polimerasi non ha bisogno di un innesco per iniziare la sintesi.

• Il prodotto non rimane accoppiato alle basi dello stampo, ma viene rilasciato come acido

nucleico a singolo filamento. La polimerasi ha una specie di “rostro” che passando stacca gli

amminoacidi dal DNA

• La trascrizione è molto meno accurata (circa 1000 volte) della replicazione.

L’unica doppia elica che l’RNA può creare è di tipo A; questi errori però sono poco significativi

perché l’RNA viene degradato in un momento successivo dunque l’errore ci sarà solamente per le

proteine prodotte da quell’RNA.

I filamenti di DNA possono essere entrambi utilizzati per la trascrizione; nel caso si formino 2 RNA

complementari e creino una doppia elica, le proteine prodotte sono diverse tra loro. La RNA

polimerasi deve quindi stare attenta anche al verso di trascrizione. Alcuni virus sono in grado, per

compattare il DNA, sovrapporre la trascrizione di entrambi i filamenti. Il 3’sta sempre nel sito

attivo della polimerasi!

Nella trascrizione il segnale d’inizio si chiama promotore e può cambiare da organismo ad

organismo; negli eucarioti è più complicato perché, a differenza dei procarioti, non si lega

direttamente. La RNA polimerasi riconosce il segnale d’inizio e forma il complesso chiuso ovvero il

DNA non è ancora stato aperto. Una volta legata, la RNA polimerasi è in grado da sola di aprire

l’elica (10/13 basi) per creare una bolla che si sposta in avanti proseguendo la trascrizione. Il

complesso d’inizio ci sono quindi diverse fasi in cui si ha un complesso chiuso ed un complesso

aperto.

Inizio abortivo: per motivi ancora non chiari, all’inizio si producono dei piccoli RNA di 7-8

nucleotidi che poi vengono eliminati; a questo inizio sussegue la fase vera e propria di

allungamento.

Il promotore ha -10 e -35 che riflettono la posizione rispetto ad un +1 ovvero indico in questo

modo la direzionalità della polimerasi; sono il numero di aminoacidi mancanti al +1. Dopo questo

+1 si incomincia a trascrivere, si trova quindi la sequenza di nucleotidi che portano l’informazione.

Questa sequenza porta l’O.R.F. (open reading frame) cornice aperta di lettura: sono le triplette che

codificano gli amminoacidi. Questa ORF è aperta ovvero non presenta triplette di stop; termina con

segnali di stop o con amminoacidi non senso. Il segnale di fine trascrizione è detto terminatore.

Il messaggero però è sempre un po’ più lungo rispetto al’ORF sempre per evitare la perdita di

informazione in caso di delezione della coda.

La struttura dell’mRNA è lineare mentre il tRNA è a trifoglio; quest’ultimo però non necessita di un

ORF perché il suo compito non è di codificare per gli amminoacidi. ORF è solamente nell’mRNA che

ha lo scopo di produrre amminoacidi. Tutte le possibili combinazioni danno un amminoacido,

qualunque sia il codone c’è sempre un amminoacido eccetto che per i tre codoni di stop; se quindi

leggo l’informazione posso sempre produrre una proteina. Importante è specificare che si parla di

ORF solo quando quella sequenza non contiene codoni di stop ed è utilizzata per produrre una

proteina.

Gli operoni sono zone del cromosoma dei batteri in cui si osservano le ORF separate tra loro da un

codone di stop, queste ORF hanno tutte lo stesso interruttore quindi possono essere attivate e

disattivate tutte contemporaneamente come accade ad esempio nell’operone Lac.

Con l’evoluzione la polimerasi è diventata sempre più complessa; solamente nei batteri è composta

da 5 diverse sub unità: αββ’σω

Subunità PM Numero Funzione

Α 40 kDa 2 Assemblaggio dell’enzima e legame del promotore

Β 155 kDa 1 Legame dei nucleotidi

β’ 160 kDa 1 Legame al DNA templato

Σ 32-92 kDa 1 Riconoscimento del promotore. Sono di molti tipi e servono

per la sintesi di templati differenti. Sono essenziali per la

regolazione della RNA-polimerasi.

Alcuni esempi di operoni sono:

• Rrnβ: ribosomi

• Trip: triptofano

• Lac: lattosio

• Rec A: proteina

Alcuni promotori hanno anche UP (up stream): sequenza a monte a cui si lega la proteina UBF che

in associazione con SL1 aiuta la RNA-polimerasi a legarsi maggiormente; altri ancora non hanno

-35, ma un -10 esteso. I promotori di diversi geni possono essere allineati per -35 e -10 poiché le

sequenze sono simili in tutti i genomi con poche variazioni.

La sequenza -10 è ricca in A-T (TATA box) perché è un legame più semplice da aprire visto che tra A

e T ci sono solamente 2 interazioni.

La sequenza del promotore potrebbe essere correlata al livello dell’espressione; se il promotore è

debole quel gene verrà trascritto meno. La polimerasi riconosce la di sequenza; a seconda della

sequenza del promotore si può stabilire la forza di legame con la polimerasi. Più il legame è forte

più la sintesi di RNA è veloce.

Fattore σ:

Il fattore σ che codifica per la proteina σ riconosce il promotore in modo specifico le sequenze

delle regioni a -10 e a -35. Le proteine sono costituite da 4 domini ovvero ripiegamenti separati da

uno spazio lineare che formano strutture indipendenti. Il motivo invece è l’elica o il foglietto di una

sezione del dominio. Σ è suddivisa in quattro domini che interagiscono con diverse parti del

promotore, ad esempio σ2 e σ3 interagiscono con -10. La polimerasi necessita di σ perchè

spegnendo il promotore spegne anche tutti i geni connessi. Il fattore σ70 riconosce promotori che

producono le proteine sempre utili.

Quando la polimerasi si stacca è senza σ iniziale quindi se ne prende uno, che può essere diverso

da quello precedente, disponibile nella cellula cambiando così il gene prodotto. Si hanno diversi

livelli di promotori. Il fattore σ70 è mantenuto regolarmente acceso perché controlla i geni House

Keeping ovvero i geni costitutivi che sintetizzano per la produzione di enzimi o componenti

costitutive e regolative essenziali; spegnendo il gene che produce un determinato σ spengo tutti i

geni controllati da questo.

Ipotizzando uno shock termico, basta riattivare σ54 (apposta per gli shock termici) per il recupero

delle funzioni perse.

Si può anche avere una regolazione della trascrizione attraverso la modulazione e l’espressione di

sigma:

σ70 attiva la sintesi di geni precoci tra cui σ28

σ28 attiva la sintesi di geni intermedi tra cui σ34

σ34 attiva la sintesi di geni tardivi; si ha quindi un’attivazione a cascata.

I livelli e l’attività dei diversi fattori σ (70, 32, 54, 28) possono variare in risposta a segnali

ambientali e di sviluppo. È presente anche un meccanismo a σ alternativi ovvero questi fattori

vengono espressi solo in determinate condizioni ossia quando sono necessari i geni riconosciuti

dall’σ specifico.

I fattori quindi servono per la:

• Regolazione della trascrizione dell’mRNA sigma (es: biosintesi del flagello di S. typhimurium)

• Regolazione della traduzione del fattore sigma

• Regolazione della stabilità proteica e dei trascritti mRNA sigma

• Attivazione proteolitica di pro-fattori sigma (chimotripsina)

• Produzione di fattori anti-sigma (blocca la sintesi di σ)

• Produzione di fattori anti-anti-sigma (blocca la sintesi di anti-σ)

La RNA polimerasi è il grado da sola di aprire la doppia elica, serve energia per poterla aprire, ma

non si utilizza ATP dal momento che le interazioni che la Polimerasi fa con il DNA liberano energia.

Il promotore per facilitare l’apertura ha un’alta frequenza di AT; a questo punto si ha un

cambiamento di twist, usato dalla polimerasi per dare writhe aprendo così la doppia elica.

L’elemento UP è accessorio, si trova a -40/-60; interagisce con le zone CTD (coda carbossi-

terminale) della RNA polimerasi favorendo la formazione della bolla.

Il 3’-OH RNA si trova nella polimerasi tra β e β’, mentre l’estremità 5’ è esterna all’enzima. La bolla

può generare avvolgimenti a monte e a valle della polimerasi quindi sono necessarie

topoisometrasi da entrambi i lati. La reazione produce PPi che tramite pirofosfatasi viene eliminato

dalla reazione spostando l’equilibrio verso un ΔG negativo. Il 3’-OH fa un attacco nucleofilo al Pα

del nucleoside precedente; la reazione procede a catena finché non arriva al terminatore, la sintesi

però può essere discontinua. La polimerasi II, essendo responsabile della sequenza nucleotidica

dell’RNA, può rallentare o fermarsi per sistemare eventuali errori o tagliare pezzi del templato.

Questa azione viene definita come back-tracking dell’RNA-polimerasi.

L’RNA polimerasi si muove per diffusione sia all’indietro che in avanti, se si aggiungono NTPs va

necessariamente avanti, a volte invece torna indietro facendo ‘sì che il 3’-OH esca dal sito attivo e

venga tagliato grazie ad un fattore di taglio del trascritto.

Anche la RNA polimerasi ha una sorta di “editing” ossia è in grado di correggere un errore appena

commesso:

• Editing pirofosfolitico (pirofosforico):

RNAn + PPi → RNA(n-1) + NTP

• Editing idrolitico: assistito dai fattori GreA e GreB (fattori di trascrizione)

RNAn + H2O → RNA(n-1) + NTP

GreA e GreB sono due proteine che possono entrare specificatamente nella RNA-polimerasi.

TERMINAZIONE: Nei batteri ci sono due tipologie di terminatori ossia due sequenze di

terminazione. Ricorda che la RNA-polimerasi perde il fattore σ all’inizio della fase di allungamento

• Terminatori intrinseci (Rho indipendenti)

• Terminatori Rho dipendenti: necessitano di un fattore Rho di terminazione che fa parte

della RNA-polimerasi.

Gli Rho indipendenti basano il meccanismo di terminazione sulla formazione di una forcina nella

sequenza del DNA. Quando la RNA-polimerasi sintetizza due sequenze palindromiche,

immediatamente a ridosso dell’enzima si forma la forcina. Nel sito attivo si ha la sequenza ripetuta

UA; la forcina strappa il trascritto dall’estremità 3‘ che è debole per i soli appaiamenti Au quindi la

trascrizione finisce. La terminazione non è sempre assoluta; può capitare che la polimerasi vada

avanti, ma questo non crea grandi problemi.

Gli Rho dipendenti hanno una sequenza che, una volta trascritta, lega con alta affinità la proteina

Rho. Rho è un’elicasi che provoca il rilascio di ATP dall’idrolisi della doppia elica; questa proteina

tira l’RNA e si avvicina sempre più alla polimerasi fino a strappare da essa il trascritto da essa.

L’energia necessaria è data dall’idrolisi di ATP.

Alla fine Rho rilascia l’RNA; Rho sono proteine esameriche che legano l’RNA sulla superficie.

TRASCRIZIONE NEGLI EUCARIOTI:

La trascrizione avviene nel nucleo mentre la traduzione è al’esterno sui ribosomi citoplasmatici

quindi l’RNA degli eucarioti deve essere modificato per poter uscire dal nucleo. Nei batteri invece,

non essendoci nucleo, le RNA polimerasi possono trascrivere l’mRNA e avviare immediatamente la

traduzione a carico dei ribosomi.

Sistemi di attenuazione sono in grado di interferire con entrambi i processi.

Il processo di trascrizione è identico tra procarioti ed eucarioti tuttavia vi sono delle differenze nei

macchinari utilizzati in ciascun caso:

• Gli eucarioti possiedono tre RNA polimerasi: Pol I (rRNA), II (mRNA) e III (tRNA e RNA regolativo)

• La struttura dei promotori è diversa (Coli ha σ diversi da quelli umani)

• Negli eucarioti sono richiesti diversi fattori di inizio chiamati fattori di trascrizione generali

• L’apertura della doppia elica richiede idrolisi di ATP tramite un fattore

• In vivo è inoltre richiesto il complesso mediatore ed altre proteine regolatrici

• Per l’allungamento è richiesta la fosforilazione della RNA polimerasi

• Sono richiesti enzimi che modificano la cromatina perche la polimerasi deve muoversi su un

templato ricco di istoni

• Sono necessari enzimi che modificano il trascritto primario: splicing, capping, poliadenilazione

• L’RNA maturo deve essere trasportato fuori dal nucleo

La RNA polimerasi eucariotica è costituita da più di 10 subunità, ma nella sequenza c’è

somiglianza.La RNA polimerasi II degli eucarioti ha un dominio addizionale CTD funzionalmente

molto importante, costituito da numerose sequenze ripetute; è definita coda addizionale e serve

per le modificazioni. CTD è ricca di Tyr-Ser-Pro-Thr; Tyr, Ser e Thr sono amminoacidi ricchi di –OH,

nucleofilo in grado di attaccare il P γ dell’ATP e aumentare gli amminoacidi fosforilati.

Es: la P-Ser ha una carica negativa netta; la Pro impedisce invece la formazione di strutture stabili.

La parte di RNA polimerasi del lievito consiste in 27 ripetizioni; quello dell’uomo in 52 nella CTD.

Negli eucarioti e negli archea ci sono fattori che consentono il legame della RNA polimerasi; la

prima è la TBP (tata binding protein) che lega la TATA box e piega il DNA di circa 80°, la seconda è

TFIIB che, con l’asimmetria conseguente al suo legame, impartisce unidirezionalità alla trascrizione

risultante.

Ci sono differenze anche nel promotore; di fatto un promotore contiene solo due o tre di questi

quattro elementi. Oltre al promotore prossimale ci sono altre sequenze regolatrici: sequenze

regolatrici a monte (UAS), enhancer, silenziatori, elementi di confine, elementi isolatori. Queste

sequenze legano proteine regolatrici (attivatori e repressori) che regolano la trascrizione dal

promotore prossimale. Alcune di queste sequenze possono essere localizzate anche a 10 o 100 kb

dal promotore prossimale.

La fosforilazione della CTD serve a far partire la RNA polimerasi; durante l’allungamento vengono

richiamate proteine che hanno il compito di modificare l’mRNA; la prima modificazione è il

Capping perché è la prima estremità libera. Per l’adenilazione bisogna aspettare lo stacco del

trascritto, infine lo splicing serve per eliminare le sequenze non codificanti. Gli eucarioti infatti

hanno geni interrotti.

Capping del 5’:

1.

Questo fenomeno consiste nell’aggiunta di guanina da un enzima di capping con un meccanismo

diverso da quello delle polimerasi: si ha l’unione 5’-5’ di due nucleotidi. Il nucleofilo è l’ossigeno del

Pβ dell’RNA e attacca il Pα del GTP entrante. La guanina viene metilata in un successivo momento.

Questo processo marca gli mRNA per segnalare se sono integri

e pronti alla trascrizione. Deve essere presente sia capG che la

polyA (coda di adenine) che forniscono lo stop al ribosoma, se

proseguisse sarebbe pericoloso. Se manca il Gcap è probabile

manchi anche AUG.

Il cap svolge diverse funzioni:

• Protegge l’mRNA dalla degradazione

• Aumenta l’efficienza di traduzione

• Facilita il trasporto dell’mRNA dal nucleo al citoplasma

• Contribuisce ad aumentare l’efficienza del processo di

splicing

Poliadenilazione in 3’:

2.

Il trasferimento degli enzimi necessari per la poliadenilazione dalla coda CTD della RNAP II all’RNA

innesca un cambiamento conformazionale che porta alla terminazione della trascrizione. Oppure,

la presenza di un 5’ senza cap, dopo il taglio dell’RNA segnala alla RNAP II di terminare la

trascrizione.

La reazione che avviene è la stessa della sintesi, si ha il 3’-OH che lega A; questa è fatta dall’enzima

PAP che lega ATP in una sequenza senza stampo (sequenza indipendente). Nella terminazione degli

eucarioti ci sono parecchi buchi neri, ma possono esserci diversi modelli:

• Modello a siluro: Dopo il taglio, l’estremità priva di Capping dell’RNA viene riconosciuta da

una RNasi che degrada l’RNA in direzione 5’->3’ fino a quando raggiunge la polimerasi dove,

forse in modo analogo a Rho, causa il distacco del trascritto e quindi la fine della

trascrizione.

• Modello allosterico: La terminazione è causata da un cambiamento conformazionale della

RNA polimerasi responsabile di una diminuzione della processività dell’enzima e quindi di

una terminazione spontanea. Questo cambiamento conformazionale sarebbe collegato alla

poliadenilazione e potrebbe essere indotto dal trasferimento degli enzimi responsabili della

poliadenilazione dalla coda CTD della polimerasi all’RNA.

Negli eucarioti ci sono anche promotori infaragenici.

La RNA polimerasi riconosce sequenze promotore che fanno parte dei trascritti; il trascritto

mantiene le box (sequenze necessarie per la sintesi del tRNA), ciò è possibile nelle RNA polimerasi

III che trascrive tRNA e sequenze regolatrici. In questo modo il promotore intragenico impedisce la

traduzione in proteine e permette l’esistenza di sequenze conservate (Box A e Box B) necessarie

per il folding tipico uguale per tutti i tRNA. Il folding del 5S-rRNA avviene a carico di Box C. Box A e

Box B regolano rispettivamente il folding dell’ansa D e dell’ansa ψU del tRNA.

Tecnica del footprinting: se al DNA si lega una proteina allora la sequenza a contatto con la

proteina sarà meno suscettibile al taglio da parte delle nucleasi. Da questa operazione ottengo la

lunghezza della sequenza contattata dalla proteina per vedere dove si lega in modo specifico.

Marchiamo un solo filamento di DNA con P, facciamo una digestione parziale con una nucleasi (2

minuti invece che 2 ore) ottenendo filamenti rotti di diversa lunghezza. Metto i filamenti rotti sul

gel di acridilamide provocando la migrazione del DNA (DNA migration). Si forma una zona vuota

che mi indica la lunghezza e la posizione di legame tra la proteina e il DNA.

Splicing:

3.

Per splicing si intende il processo di maturazione dell’RNA dove vengono divisi gli esoni (RNA

codificante) dagli introni (informazione non codificante).

Lo splicing viene scoperto nel ‘ 77: mescolando l’RNA con il DNA dell’adeno-virus si vedeva che le

parti di RNA non si accoppiavano completamente con il DNA ciò significava che alcune parti

dell’RNA venivano tolte. Questa è una prerogativa degli eucarioti, sono composti da esoni ed

introni. Il numero di introni varia da 1 a diverse centinaia (363 nella titina umana)

Gli esoni sono in genere composti da 150 nt mentre gli introni arrivano anche a 800000 nt

I pre-mRNA possono subire splicing alternativo (circa il 75% dei geni umani subisce splicing

alternativo). Il vantaggio di avere dei geni interrotti a causa dello splicing è quello di riuscire a

portare parte dell’informazione all’interno di un altro gene. Gli esoni quindi danno la possibilità di

modulare il genoma ovvero spostarlo; si ha quindi la possibile modificazione dell’informazione.

Altro processo permesso dai geni separati è lo splicing alternativo ovvero che ogni gene è

composto da diversi esoni che possono accoppiarsi in ordine e modi differenti per creare proteine

diverse.

A questo punto si ha che la teoria “un gene una proteina” comincia a non valere più. Aumentando

il grado evolutivo, aumentano il numero di introni per gene; ad esempio l’uomo ne ha in media 8.

Sono quindi necessari dei segnali che vadano a separare gli introni dagli esoni; questi sono detti

“sequenze confine”; non è possibile sbagliare i tagli altrimenti si va ad alterare l’intero frame del

segmento successivo. Sono presenti dei siti di splicing, solitamente all’interno dell’introne, dove

avviene il taglio e un punto di ramificazione.

La reazione di splicing è tipica degli acidi nucleici:

Taglio per idrolisi del ponte fosfodiesterico. È presente un -OH che va a rompere l’estremità 5’

dell’introne, è un gruppo OH in 2’ su un ribosio appartenente all’introne stesso; non avviene più a

carico dell’acqua. Il ripiegamento dell’RNA avviene a carico di interazioni che si formano tra i

nucleotidi il che comporta una struttura terziaria. Questa permette quindi il ripiegamento

dell’introne così che l’OH del punto di ramificazione si trovi sul punto di taglio tra esone ed introne.

Si forma quindi un cappio.

L’OH in 3’ della base liberata dell’esone va a fare un attacco al fosfato dell’inizio dell’esone

successivo facendo avvenire contemporaneamente due reazione: il distacco dell’introne e l’unione

dei due esoni.

Quando faccio il primo taglio, le due estremità non si perdono per una ragione strutturale: i due

elementi sono ancora legati tra loro tramite altre interazioni; il nuovo 3’ OH verrà spostato, tramite

una variazione conformazionale, vicino all’OH dell’esone successivo.

Può anche succedere, raramente nell’uomo, che una guanosina esterna con un OH libero vada a

fare il primo taglio; in entrambi i casi lo splicing ha portato all’unione dei due esoni.

Negli eucarioti lo splicing più frequente avviene tramite lo spliceosoma ovvero un apparato

proteico e ribonucleico che guida l’RNA. L’unica differenza è che, negli introni di gruppo II si ha il

self-splicing, è l’RNA stesso che si ripiega; negli introni di gruppo I il primo taglio avviene a causa di

una molecola esterna con un –OH libero; nello spliceosoma invece c’è bisogno di un sussidio. Il

complesso proteico è composto da proteine SnRNP (ribo nuclear proteins) ovvero complessi

proteina-rna che riconoscono il sito di splicing in 5’ ed il sito di ramificazione, avvicinano questi due

siti e favoriscono la catalasi. Una volta formato lo spliceosoma è questo che comporta gli

spostamenti conformazionali dell’RNA e l’avvicinamento dei due esoni che si uniscono tra loro.

Con lo spliceosoma non è più necessario conservare gli introni perché il ripiegamento avviene a

suo carico; sono indispensabili solamente le sequenze di inizio e fine.

Lo spliceosoma è composto da 150 proteine, da 5 RNA diversi chiamati snRNA (U1, U2, U3, U4,

U5), ha dimensioni simili a quelle del ribosoma ed utilizza ATP. Per snRNA si intendono “small

nuclear” RNA ricchi di uracile che aiutano nella maturazione dell’mRNA.

Gli snRNA (small nuclear RNA) sono complessi RNA-proteine che ripiegano l’introne obbligando il

singolo filamento ad ottenere determinate conformazioni.

Lo spliceosoma riconosce il sito di legame, ma ci possono essere degli errori come il salto di un

introne o il riconoscimento di pseudo-siti di splicing data la bassa astringenza delle sequenze

consenso.

Ci sono diverse strategie per evitare questi errori:

• Lo stesso sito viene riconosciuto in sequenza da diverse snRNP

• Lo spliceosoma viene assemblato in fase di trascrizione (alcune proteine provengono dalla

coda CTD della RNAP II); si ha una poliadenilazione.

• Vengono riconosciuti preferenzialmente siti di splicing vicino agli esoni con l’ausilio delle

proteine SR (riconoscono le sequenze enhancer) che si legano a sequenze collocate

all’interno degli esoni (modello di definizione degli esoni) o all’interno degli introni

(modello di definizione degli introni).

Comunque, le proteine che regolano lo splicing si legano a dei siti specifici chiamati enhancer

(proteine SR) o silencer (hnRNP) di splicing esonici o intronici (exonic – intronic – splicing

enhancers o silencers, ESE o ISE – ESS o ISS). I primi incrementano mentre i secondi reprimono lo

splicing sui siti di splicing vicini.

Possono essere presenti delle mutazioni sui siti di splicing che comportano un non riconoscimento

dell’esone o un mancato splicing.

Lo splicing alternativo può essere sia costitutivo che regolato; a seconda della presenza di un

fattore proteico si possono ottenere determinate proteine. Nel primo caso si ha che più di un

prodotto viene sempre generato dal gene trascritto; nel secondo caso invece si hanno forme

diverse che vengono generate in momenti diversi, in diverse condizioni o in diversi tipi cellulari o

tessuti.

Nello splicing inoltre sono presenti dei repressori ovvero proteine che vanno ad interrompere il

processo legandosi ai siti di splicing che vengono mascherati (hnRNP). In questo caso allora lo

spliceosoma salta l’esone mascherato e va direttamente all’esone successivo. Dopo lo splicing le

proteine create possono a loro volta essere modificate per ottenere un’ulteriore amplificazione

dell’informazione.

Lo splicing può avvenire anche tra esoni non successivi o anche tra esoni di molecole diverse di

pre-mRNA (splicing in trans). Ci sono diversi tipi di esoni:

• Modello degli introni precoci: Gli introni

esistevano in tutti gli organismi ma nei batteri

sono andati perduti

• Modello degli introni tardivi: Gli introni furono

inseriti nei geni in una fase successiva

dell’evoluzione

Vantaggi dei geni interrotti:

• Con lo splicing alternativo si possono produrre proteine diverse da uno stesso gene

• Permette la creazione di nuovi geni attraverso il rimescolamento degli esoni

o Molti esoni corrispondono ai domini delle proteine

o Molti geni e le loro corrispettive proteine si sono evoluti anche tramite la duplicazione e la

divergenza degli esoni

o Alcuni esoni si ritrovano in geni codificanti per proteine differenti

Editing dell’RNA: avviene una deaminazione del sito specifico della citosina quindi la citosina

deaminata può diventare uracile; a differenza di quello che succedeva nel DNA, nell’RNA l’uracile

ha senso. Questo può causare l’interruzione della sintesi di una proteina come accade con una

proteina del fegato e dell’intestino (apolipoproteina) perché la sequenza viene letta con un codone

di stop. Altro editing è l’inserzione delle uridine a carico dell’uridilil transferasi 3 terminale (TUTasi):

viene creato un templato, un filamento complementare allo stampo tranne che in un punto. Si ha

quindi una bolla che viene tagliata e rimossa creando un gap in cui vengono aggiunte delle

adenine; si inseriscono rispettivamente delle uridine sul filamento complementare.

LA TRADUZIONE:

Per quanto riguarda la traduzione è importante avere chiara la reazione chimica e la struttura degli

amminoacidi!

Le proteine sono polimeri formati da amminoacidi uniti tra loro mediante legami ammidici; la

differenza con gli acidi nucleici è che le proteine possono fare legami anche con altri cofattori

enzimatici di natura non amminoacidica.

La formazione delle proteine consiste nella reazione del gruppo amminico con quello carbossilico

di due amminoacidi differenti per creare un legame peptidico. La reazione avviene sempre tra i

gruppi del carbonio α; ogni amminoacido ha un gruppo amminico e uno carbossilico. La sintesi

amminoacidica è sfavorita perché ha un ΔG +10 KJ/mol mentre è favorita l’idrolisi (-10 KJ/mol).

Come nella sintesi di nucleotidi, la reazione può avvenire solamente quando almeno uno dei

gruppi è attivato così da risolvere il problema termodinamico. La sequenza di nucleotidi è

traducibile per mezzo di un codice in una sequenza di amminoacidi; il codice genetico è costituito

da codoni a tre basi. Il codice genetico è degenerato ovvero ad ogni codone corrisponde ad un

amminoacido; diversi codoni codificano per uno stesso amminoacido.

Caratteristiche principali del codice genetico:

• I codoni sono di tre basi

• →

I codoni vengono letti in direzione 5’ 3’

• I codoni non si sovrappongono o non ci sono salti di basi

• Lo schema di lettura è fisso ed è determinato dal codone di inizio

• La tabella di sintesi è uguale, eccetto che per alcuni casi rari, per tutti gli organismi; si ha lo

stesso codice per convertire i nucleotidi in amminoacidi

• L’informazione viene scritta in un mRNA (messaggero) il quale contiene una o più ORF

(open reading frame: sequenza di codini abbastanza lunga che inizia con AUG (metionina) e

termina con un codone di stop (UAG-UGA-UAA).

Il messaggero è più lungo alle estremità per evitare la perdita d’informazione. Sono necessari degli

adattatori che riescano a tradurre i codoni in amminoacidi; questi adattatori erano già stati

proposti da Crick. L’adattatore è il tRNA (transfer) che è in grado di riconoscere un codone con una

sequenza complementare. Essendo il tRNA un acido nucleico, esso si lega in modo antiparallelo

rispetto al filamento di mRNA quindi porta l’amminoacido corrispondente sull’estremità 3’. La

sequenza che riconosce il codone è detta anticodone.

Per far si che l’anticodone si leghi al codone corretto è necessario un apparato: il ribosoma.

Nei batteri gli mRNA sono generalmente policistronici ovvero sono dotati di più ORF

contemporaneamente i quali sono definiti cistroni o punto d’inizio. Un mRNA deve avere un

segnale di riconoscimento per il ribosoma, questo viene detto RBS (ribosome binding site) o

sequenza di Shine-Delgarno. Un’elevata complementarietà ed una spaziatura adeguata del sito RBS

dal codone di stop precedente e dall’AUG successiva favoriscono una traduzione efficiente;

successivamente all’RBS è necessaria un’AUG iniziale e un codone finale.

In certi casi il sito d’inizio di una ORF è molto vicino al sito di termine della ORF precedente

consentendo una traduzione accoppiata delle due ORF senza il bisogno di reclutare un nuovo

ribosoma; le due sequenze vengono tradotte una di seguito all’altra.

Il cap (cappuccio) è necessario negli eucarioti per il riconoscimento da parte del ribosoma ed è

posizionato al 5’ recluta il ribosoma che ispeziona la sequenza fino ad incontrare il codone di inizio

AUG. Sia la presenza della sequenza di Kozak, contenente la metionina iniziale, che la coda di poliA

al 3’ contribuiscono all’efficienza di traduzione.

L’elemento di traduzione è composto da 4 zone associate e non è come solitamente rappresentata

a trifoglio, ma è a L rovesciata con doppie eliche compresse. Tutti i tRNA hanno la stessa forma

perché devono entrare in una camera fatta apposta nel ribosoma; inoltre le camere possono anche

cambiare a seconda del tipo di codone. La sequenza che serve è l’anticodone che si legherà al

codone e stabilirà l’amminoacido corretto. L’estremità 3’ è detta CCA è una modifica post-

traduzionale ed è importante perché lì deve essere agganciato l’amminoacido che deve essere

trasportato; le anse determinano la forma del tRNA ma a livello chimico non hanno una valenza

importante. L’anticodone dista 70Å dall’estremità CCA; deve quindi partire un segnale corretto

dall’anticodone all’estremità 3’ che confermi o neghi l’inserzione dell’amminoacido trasportato.

Il tRNA è fatto da nucleotidi che però, dopo la sintesi, vengono modificati da enzimi; alcuni esempi

sono la Inosina etc. I tRNA usano così frequentemente delle basi modificate perché, avendo la

stesa forma, aumentano la loro variabilità chimica per essere meglio riconosciuti da ribosoma. C’è

una proteina sul ribosoma che riconosce gli amminoacidi tramite queste variazioni chimiche.

LEGAME DELL’AMMINOACIDO:

→

L’amminoacido viene fatto reagire con l’estremità 3’ del tRNA formando così un legame covalente;

l’amminoacido però non è attaccato all’adenina, ma al carbonio 3’ dello zucchero. Il legame

avviene tra l’alcool (OH dello zucchero al C3) e il carbossile formando un estere che è più reattivo

rispetto all’acido quindi questo diventa il substrato attivato. Il legame che si forma tra

l’amminoacido e l’RNA è ad alta energia, questa è fornita da ATP che diventa AMP; in questo modo

la reazione diventa spontanea con ΔG negativo.

Nel grafico energetico ci sono delle barriere energetiche che permettono di mantenere lo stadio

desiderato anche ad energia maggiore; queste barriere energetiche vengono abbassate dalle

proteasi per permettere la degradazione. La prima

reazione avviene per mezzo dell’ossigeno del carbossile

dell’amminoacido che fa attacco nucleofilo al P dell’ATP

liberando PP.

Si forma quindi l’amminoacil adenilato, estere

fosforico più reattivo dell’amminoacido; in questo

modo è più semplice produrre un estere.

Il legame tra l’amminoacil-AMP e l’alcool del 3’OH dello

zucchero del tRNA formando così l’amminoacil tRNA;

questo è favorito dall’’enzima amminoacil tRNA

sintetasi.

Il ribosoma prende il tRNA a cui è legato l’amminoacido, controlla l’appaiamento codone-

anticodone e, nel caso sia corretto, inserisce l’amminoacido nella proteina.

L’enzima va ad attaccare l’amminoacido sul tRNA, deve essere estremamente specifico così da non

sbagliare ad attaccare l’amminoacido corretto. Gli amminoacidi sono 20, per questo ci sono 20

amminoacil tRNA sintetasi, ogni sintetasi è specifica per il suo amminoacido; è l’enzima che deve

riconoscere il tRNA. Queste sintetasi devono riconoscere tutti i 61 tRNA (non 64 perché ci sono 3

codoni di stop che non hanno tRNA); più esattamente ogni sintetasi, specifica per il suo

amminoacido, deve riconoscere le sequenze degli anticodoni corrispondenti ai codoni che

sintetizzano per l’amminoacido per cui è specifica. Attraverso le sequenze delle forcine del tRNA e

per le sequenze dell’anticodone a cui si lega, la sintetasi è in grado di riconoscere il tRNA corretto.

Il tRNA quindi non è solo un trasportatore dell’amminoacido, ma trasporta anche l’energia per far

avvenire il legame peptidico. L’amminoacil-tRNA sintetasi catalizza sia la reazione tra amminoacido

e ATP sia quella tra amminoacil-adelilato (amminoacil AMP) e il tRNA.

• amminoacido + ATP → amminoacil-AMP + PPi

• amminoacil-AMP + tRNA → amminoacil-tRNA + AMP

Le sintetasi sono in grado di fare anche il proofreading ovvero sono in grado di controllare che

l’amminoacido legato sia esatto; nel caso non sia così può staccarlo e sostituirlo; questa proprietà è

essenziale perché poi il ribosoma non ha nessuna possibilità di correggere gli errori.

I batteri e gli Archea spesso non hanno tutte e 20 le tRNA sintetasi quindi l’enzima GluRS riconosce

sia tRNAGlu che tRNAGln e carica acido glutammico. Successivamente un’amidotrasferasi riconosce

tRNAGln-Glu e lo converte in tRNAGln-Gln.

→

Glutammato glutammina; si toglie un gruppo e si aggiunge l’NH2.

Le amminoacil-tRNA sintetasi devono selezionare l’amminoacido; si creano quindi due tipi di

discriminazioni: quelle semplici, come tirosina e fenilalanina che anche se hanno solo un gruppo

differente hanno diversa carica e diversa forma, e quelle difficili come tra isoleucina e valina che

invece hanno un gruppo diverso, ma stessa carica e stessa forma. Per abbassare la probabilità

d’errore, inizialmente 1% si aggiunge il proofreading ovvero la capacità delle sintetasi di capire se

gli amminoacidi sono corretti in base all’anticodone del tRNA. Con questo procedimento il margine

d’errore delle sintetasi è pari a 0.01%.

Per legare l’amminoacido all’ATP si ha bisogno di un sito attivo per abbassare l’energia

d’attivazione; per il proofreading viene inserito, oltre al sito di sintesi, un sito ulteriore detto

d’idrolisi. Il sito attivo di sintesi è ideale per il composto aa+ AMP (es. amminoacil adenilato) che ha

subito la reazione precedente di aa+ATP; in questo però c’è l’1% di probabilità che entri anche un

altro amminoacido (es valina). Si è quindi creato un sito di idrolisi uguale all’aa che potrebbe legarsi

ma non si deve legare (ad esempio la valina) così se entra per sbaglio nel sito di sintesi va

direttamente nel sito d’idrolisi senza legarsi all’tRNA; si perde una molecola di ATP, ma si evita un

errore. Stessa cosa succede quando il legame è già avvenuto sul tRNA.

S: coefficiente di sedimentazione ovvero dove sedimenta, non è lineare con il peso molecolare, 30S,

sub unità minore, e 50S, sub unità maggiore, messe insieme sedimentano come una 70S.

La sub unità minore è deputata al legame mentre quella maggiore ha tre diversi siti di legame: A

per il tRNA, P per il legame peptidico ed E per il tRNA in uscita senza amminoacido. La catena

polipeptidica, la proteina che si forma, rimane sempre legata al tRNA. All’amminoacil tRNA in

entrata nel sito A viene ceduta l’intera proteina sintetizzata fino a quel momento quando entra nel

sito P, scacciando il tRNA precedente nel sito E. Dal momento che il legame tra l’amminoacido e il

tRNA è estere, ovvero deve essere fatto con l’estremità carbossiterminale, l’estremità che esce è

quella amminoterminale. La sintesi continua finché non arriva un codone di stop; queste sono le

uniche tre triplette che non hanno un tRNA corrispondente.

I fattori di inizio caricano il tRNA iniziatore, specifico per la metionina, nel sito P dell’unità minore,

poi la sub unità maggiore si associa a quella minore; la metionina iniziale viene riconosciuta dal

ribosoma a causa della RBS che la precede e si inizia la traduzione.

Il fattore di allungamento EF-Tu carica il secondo amminoacil-tRNA nel sito A del ribosoma, qui

l’’attività peptidil-transferasica catalizza la formazione del legame peptidico; il fattore EF-G

promuove il movimento del complesso mRNA-tRNA posizionando il successivo codone nel sitoA e

spostando nel sito E il precedente tRNA ormai scarico.

Su un messaggero si possono creare i “poliribosomi” ovvero più ribosomi su un singolo filamento;

può esserci un ribosoma ogni 80 nucleotidi.

Nei batteri si usa la formilmetionina come AUG iniziale perché non può essere inserita in una

catena già iniziata; questo non c’è negli eucarioti. Il RBS o sequenza di Shine-Delgarno sta a monte

e si riconosce allineando le metionine iniziali e vedendo se ci sono delle sequenze conservate.

Per l’inizio nei procarioti sono richiesti tre fattori:

• IF1: evita che i tRNA si leghino alla zona della sub unità minore che diventerà il sito A prima

che si sia legato l’mRNA

• IF2: è una GTPasi che facilita l’associazione di fMet-tRNA con la sub unità minore ed evita

che altri tRNA si associno con questa subunità. Sono delle proteine che prendono il GTP che

lo idrolizzano a GDP+P. L’energia che serve per legare il legame peptidico è già nel tRNA,

eppure durante le fasi di inizio, sintesi e terminazione ci sono diverse idrolisi di GTP che

permettono l’avvenimento corretto e lineare del processo. L’idrolisi del GTP è il segnale che

conferma il corretto adempimento del processo.

• IF3: si lega alla sub unità minore e previene la riassoci azione con la sub unità maggiore.

L’Amminoacil tRNA è legato ad una proteina EF-Tu che è un fattore di allungamento. Questa è

legata all’estremità 3’, è lì per proteggere l’amminoacido, è come un cappuccio. Viaggia legata ad

un GTP, è una GTPasi. Quando questo complesso entra nel sito A e codone e anticodone

corrispondono si ha che il GTP viene idrolizzato causando un riarrangiamento conformazionale

della molecola EF-Tu che fa staccare la proteina.

L’appaiamento codone-anticodone implica che si possano creare altri ponti H, definiti ponti

addizionali, tra codone e anticodone oltre che tra tRNA e ribosoma.

La fase di accomodamento è il periodo in cui si sceglie se l’amminoacido entrato nel sito attivo è

corretto o no, si evita quindi l’inserimento errato.

Alla fine i fattori di rilascio di classe1 riconoscono il codone di stop e liberano il polipeptide; i fattori

di rilascio RRF e EF-G promuovono il rilascio dei tRNA, dell’mRNA e la dissociazione delle subunità

ribosomiali. SINTESI PROTEICA:

Si tratta quindi di creare il legame peptidico tra la catena (peptidil tRNA,) legata al tRNA tramite

legame estere, e il gruppo amminico dell’amminoacido entrato nel sito A, portato dal tRNA sempre

da un legame estere. L’amminoacido entrato ha il doppietto libero dell’NH2 che fa un attacco

nucleofilo al carbossile che ha carica δ+ a causa del doppio legame con l’ossigeno. Si ha quindi la

formazione di un gruppo OH sull’tRNA che esce.

L’energia d’attivazione per l’attacco nucleofilo viene abbassata dall’OH nel 2’ del ribosio, vicino

all’NH (circa 2 Å). Si ha che la catalisi avviene a carico dell’RNA.

EF-G-GTP stimola la traslocazione dal tRNA dal sito P al sito E attraverso mimica molecolare ovvero

imita il procedimento di altre molecole cercando di assomigliarle, questa ha le stesse sembianze

del tRNA. Si ha quindi che il fattore di terminazione EF-G-GTP prende il posto di un tRNA senza

però avere un amminoacido associato, questo fa terminare la traduzione. La proteina terminata

verrà attaccata all’acqua con lo stesso sistema di catalisi, si forma il terminale carbossilico e si

stacca. A questo punto la sintesi è completata.

SI inseriscono i fattori di rilascio:

• RF1 riconosce i codoni di stop UAG e UAA: sito catalitico della reazione di idrolisi

• RF2 riconosce i codoni di stop UGA e UAA

• RF3 rimuove RF1 o RF2 con l’utilizzo di GTP

Il fattore di riciclaggio del ribosoma simula un tRNA e favorisce la dissociazione delle due sub unità

del ribosoma.

L’azione combinata del fattore di riciclaggio del ribosoma (RRF) e di EF-G-GTP provoca la

dissociazione delle due sub unità del ribosoma. Il tRNA e l’mRNA rimangono legati alla sub unità

minore finché IF3 non promuove la loro separazione. Il complesso sub unità ribosomiale minore-

IF3 è ora libero per dar luogo ad un nuovo processo d’inizio della traduzione. La nuova sequenza

RBS nei batteri si trova successivamente ad un codone di stop poiché nei procarioti ci sono geni

policistronici ovvero ha più inizi. Il ribosoma controlla solo l’appaiamento codone-anticodone, ma

non controlla l’amminoacido; inserisce quello che si trova sul tRNA anche se è sbagliato.

I fattori IF sono fattori d’inizio per la traslazione:

• IF1: impedisce che un tRNA entri nel sito A della subunità minore del ribosoma

• IF2: controlla l’entrata dei tRNA al sito P, è associato a GTP

• IF3: regola diverse funzioni ad esempio stabilizza il legame tra mRNA e la sub unità minore

del ribosoma e impedisce che le due subunità si uniscano

Quando entra nel sito A un amminoacil-tRNA sbagliato viene spostato nel sito P dove crea un

appaiamento codone-anticodone non corretto. Qui si ha quindi un passaggio fondamentale per il

ribosoma che, in presenza di un mismatch nel sito P, cambia la conformazione del sito A così da

poter introdurre più facilmente tRNA errati. In questo modo, non potendo tornare indietro,

aumenta la probabilità di interruzione prematura così da evitare di creare proteine errate e

recuperare il ribosoma più velocemente possibile. Il sito A si trasforma quindi in un sito a bassa

fedeltà, più affine a fattori di rilascio.

È un meccanismo che salvaguarda la correttezza della catena peptidica che si sta creando; tutto

questo non lo fa perché vede l’amminoacido errato, ma perchè guarda l’appaiamento codone-

anticodone.

Altro problema relativo ad altri errori si ha quando l’mRNA è spezzato e blocca il ribosoma in una

singola posizione. Mancando un pezzo di mRNA la proteina sarà incompleta quindi si perde in

partenza, la cellula però vuole recuperare il ribosoma. Si ha quindi un tmRNA fatto come il tRNA,

ma ha anche una parte filamentosa con l’estremità 3’ che ha lo scopo di dirigere la sintesi entrando

nel ribosoma. Questo succede perché simulando il tRNA entra nel sito A con un’alanina; una volta

che entra nel sito P, nel sito A si trova un codone del tmRNA che permette di continuare la sintesi e

sbloccare il ribosoma. Alla fine di questa sequenza si ha un codone di stop, inoltre l’intera

sequenza porta è una sequenza di degradazione per i proteosomi. Con questo sistema si recupera

il ribosoma e si prende la proteina fatta fino ad allora per marchiarla e degradarla.

Soppressione del non senso: è la capacità di saltare il codone di stop, basta avere un tRNA che

riconosca il codone di stop; l’utilità di questo sistema di lettura è inserire amminoacidi o terminare

in precedenza la proteina. La soppressione di un codone di stop (UAG) può avvenire nel virus A

della leucemia murina: questo codone è seguito da una forcina che consente di sostituirlo con una

glicina e proseguire la traduzione. Altro aspetto per cui viene usata la soppressione di stop è il caso

del 21esimo amminoacido (selenio-cisteina) usato in proteine che vanno a fare il trasporto di

elettroni. Questo amminoacido è la cisteina che al posto di SH ha SeH, ha un atomo modificato.

Nelle proteine redox il Selenio funziona meglio. Prima di tutto serve il tRNA complementare (ACU)

al codone di stop (UGA). Su questo amminoacil tRNA sintetasi è un grado di caricare la serina (-

CH2-OH) a cui toglie l’OH e aggiunge Se. A questo segue la sequenza SECIS: selenio cysteine

insertion sequence usata come segnale; in questa corrispondenza quindi si ha, invece della

terminazione si ha il proseguimento della trascrizione.

Sistema più complicato è lo spostamento della cornice di lettura (frame shift) ovvero si aggiunge o

si salta una base spostando la lettura delle triplette. Questo può avvenire per controllare il fattore

di rilascio dei batteri: RF2. Quando il ribosoma arriva sul codone di stop termina la traduzione; se la

concentrazione di RF2 è alta allora va a legarsi al ribosoma e termina la produzione di altro RF2, se

invece la concentrazione è bassa, a questo punto c’è un codone CUU (leucina) che viene letto da

GAA seguito dal codone di stop UGA, ma il ribosoma può fare ugualmente un appaiamento UUU

(l’appaiamento G-U va bene comunque) quindi scivola in avanti di un nucleotide perdendo così il

codone di stop e continuando la sintesi corretta di RF2. Questo è un chiaro esempio di feedback

negativo.

L’antibiotico si prende tranquillamente perché ha il compito di interferire con traduzione e

trascrizione batteriche non eucarotiche, i ribosomi sono 70S nei batteri ed 80S negli eucarioti. Un

esempio è la puromicina che simula un tRNA, entra nel sito A e blocca la traduzione.

È positivo che il codice sia degenerato così, nel caso si abbia una mutazione con il cambiamento di

un amminoacido, non si ha l’interruzione dell’intera proteina; la cellula cerca di capire se la

mutazione sia vantaggiosa (e quindi si può fissare) o svantaggiosa (quindi si perde). Si hanno 64

codoni quasi tutti codificanti, si ha un codice in cui più codoni codificano per uno stesso

amminoacido.

Fino ad ora i tRNA li abbiamo pensati di un numero uguale a quello dei codoni dunque un tRNA per

codone. Tuttavia i tRNA non sono 64 e nemmeno 61 togliendo i codoni di stop. Il numero dei tRNA

dipende dall’organismo es: E.Coli 41 o l’uomo 45. Se non ci sono 61 tRNA vuol dire che un tRNA

deve riconoscere più codoni, deve riconoscere tutte e tre le basi del codone.

Dispensa scritta al pc in modo chiaro e comprensivo; sufficiente per passare l'esame con più di 25. Gli argomenti trattati riguardano la storia della biologia fino alla comprensione della struttura del DNA con nascita della biologia molecolare. Si tratta di DNA, RNA, cromatina, ciclo cellulare, riproduzione fagica, funzionamento di operoni lac e triptofano, duplicazione del DNA, polimerasi, enzimi quali ligasi topoisomerasi elicasi etc, trascrizione e traduzione del DNA maturazione di RNA (mRNA, rRNA, tRNA), codice genetico.