Biologia molecolare

σH

○​ 23

In E. coli è il regolatore necessario alla sintesi delle proteine heat shock utili a innescare la risposta allo

■​ shock termico nel citoplasma, ed è controllato mediante un meccanismo a feedback

Le e proteine parzialmente denaturate, generate dallo stress termico, diminuiscono la disponibilità

●​ delle proteasi e chaperon citoplasmatiche

Quando la concentrazione delle proteine mis-foldate cala, le proteasi non sono più sequestrate e quindi

●​ degradano σ32, per cui i livelli del fattore tornano normali

σE

○​ Indotto quando si accumulano proteine denaturate nello spazio periplasmico o sulla membrana esterna.

■​ Il fattore si lega alla proteina RseA, fattore anti-sigma in quanto ne impedisce il legame al core

●​ dell’RNA polimerasi

L’accumulo di proteine parzialmente denaturate attiva la proteasi DegS nel periplasma che elimina

●​ l’estremità C– terminale di RseA

Il taglio attiva un’altra proteasi, RseP, sul lato citoplasmatico della membrana interna, che taglia la

●​ regione N–terminale di RseA→rilascio di σE

σ54(σN): controllo dei fattori necessari all’assimilazione dell’azoto

●​ σ28(σF): esprime dei prodotti necessari per la sintesi dei flagelli e la chemiotassi

●​ σ19(σFecI): controllo della sintesi di alcuni fattori necessari al trasporto del ferro

●​ La risposta alla presenza di proteine parzialmente denaturate è conservata

●​ nei tre regni della vita e porta alla sintesi di un simile set di proteine che

proteggono le cellule contro lo stress ambientale→molte sono chaperon e

proteasi, che diminuiscono il livello delle proteine parzialmente denaturate o

rinaturandole o degradandole

Allungamento

Transizione da inizio ad allungamento: fuga dal promotore

Il rilascio del promotore prevede delle variazioni conformazionali del

●​ fattore σ con un suo allontanamento dal canale di uscita dell’RNA in modo

che possa procedere la sintesi

Modello teorico di transizione

●​ L'ibrido DNA-RNA si inserisce in uno stretto passaggio costituito da una regione

○​ della subunità β e da una forcina della regione 3.2 del fattore sigma

L'interazione tra loop a forcina e i nucleotidi dell'ibrido può deformare la

○​ conformazione già ipo-avvolta della molecola ibrida: il loop destabilizza e quindi

facilita la rottura dell'ibrido DNA-RNA, originando gli eventi abortivi

L'ibrido compete con il loop a forcina per cui può allontanarlo dal passaggio,

○​ iniziando i diversi eventi che portano al rilascio di sigma dal promotore (e

dall'RNA polimerasi)

L’estremità 5’ della molecola di RNA in crescita raggiunge l'uscita del canale, che è

○​ bloccata dal dominio C-terminale del fattore σ

La collisione facilita quindi l'allontanamento del dominio C-terminale di σ

○​ dall'RNA polimerasi e dalla regione -35, favorendo la dissociazione di sigma e la

fuga dal promotore

Il fattore σ, il cui rilascio non sembra essenziale per la fuga dal promotore, è in eccesso

●​ rispetto al core enzimatico: le diverse subunità sigma competono tra loro per

quantità limitate di core come sistema per cambiare il profilo di

espressione

In allungamento l’enzima interagisce con tutte le sequenze che incontra in trascrizione

●​ e ha una processività che è dovuta:

A come l’enzima svolge il DNA

○​ All’aumento di affinità dell’enzima per il complesso ternario dato dalle interazioni

○​ con l’RNA nascente

L’RNA polimerasi e il DNA in allungamento

Le strutture cristallografiche degli enzimi batterici e di lievito, complessati con l’rNTP e/o il DNA, forniscono

●​ informazioni su struttura e funzione dell’RNA polimerasi in allungamento

Il canale principale accoglie circa 17 pb che, insieme ai circa 13 nucleotidi di DNA accolti nel sito catalitico,

●​ costituiscono i 30–35 nucleotidi della regione protetta nel DNA footprinting

dei complessi di allungamento

Il canale afferra il DNA a valle nelle sue tenaglie non appena entra

●​ nell’enzima, circondandolo. Il DNA a valle è mantenuto in

posizione corretta da una pinza (= una delle tenaglie)

Quando il DNA è denaturato, il movimento dei singoli filamenti nell’enzima

●​ non è più limitato dalla rigidità della doppia elica: lo stampo compie una

curvatura di 90° nel sito attivo

La lunghezza dell’ibrido di DNA-RNA è limitata da un’ostruzione proteica

●​ detta coperchio

A sua volta, i nucleotidi entrano nel sito attivo dalla regione inferiore,

●​ attraverso un canale secondario

La bolla di trascrizione include 8–9 pb dell’ibrido DNA–RNA

●​ 24

A una estremità l’ibrido è separato dal coperchio, mentre all’altra estremità la base sul filamento stampo ruota verso

●​ l’esterno per potersi appaiare con l’rNTP in ingresso

I contatti RNA polimerasi/DNA in allungamento

L’RNA polimerasi deve mantenere contatti sia con il DNA che con l’RNA, contatti che devono essere

●​ rotti ad ogni aggiunta di nucleotide

L’enzima crea una serie di contatti specifici con i nucleotidi mediante amminoacidi definiti, che sono fissi

●​ nella struttura dell’enzima, ma cambiano nucleotide ad ogni movimento dell’RNA polimerasi

Un modulo flessibile (trigger loop), amorfo prima dell’aggiunta del nucleotide, assume una struttura definita

●​ non appena l’rNTP entra nel sito attivo: aiuta il posizionamento del ribonucleotide e coordina la catalisi

Creato il legame fosfodiesterico e avvenuta la traslocazione nella posizione successiva dello stampo, l’enzima ricrea i

●​ legami e il modulo trigger loop perde nuovamente conformazione

Pausa o arresto dell’RNA polimerasi in allungamento

L’RNA polimerasi gestisce le situazione in cui la trascrizione è bloccata dall’estremità 3’ dell’RNA

●​ nascente con il sito attivo→occorre tagliare l’RNA così da riposizionare correttamente il 3’–OH per

l’aggiunta di altre basi

L’attività di taglio, che è intrinseca del core enzimatico, è stimolata da fattori accessori presenti in tutti i tre i regni

●​ della vita

In E. coli sono stati identificati due fattori, GreA e GreB, mentre l’RNA polimerasi II si avvale di TFIIS: hanno poca

●​ similarità di sequenza e struttura, ma in ogni caso si legano al canale secondario dell’RNA polimerasi

In assenza dei fattori di taglio l’attività endonucleasica è lentissima, per cui predomina l'attività

●​ polimerasica

In presenza dei fattori di taglio tale reazione è favorita da un punto di vista termodinamico

●​ I fattori abilitano la polimerasi a tagliare alcuni nucleotidi dal 3’ dell’RNA crescente, in modo che ci sia un

○​ riallineamento tra estremità e sito attivo

Inseriscono un dominio proteico nell’enzima che arriva in prossimità del sito catalitico, e con due amminoacidi

○​ permettono ad un secondo ione magnesio di agire: il sito catalitico assume attività di ribonucleasi

Le attività dell’RNA polimerasi in allungamento

1.​ Svolge e riavvolge il DNA

2.​ Interagisce con i filamenti separati di NDA e con il prodotto di RNA

3.​ Catalizza l’aggiunta di ribonucleotidi alla catena crescente di RNA

4.​ Controlla l’avanzamento della reazione

5.​ Risolve i problemi che si verificano con l'aiuto di fattori accessori

Terminazione

L’RNA polimerasi scorre sullo stampo finché incontra una sequenza

●​ terminatore dove

Smette di aggiungere nucleotidi alla catena di RNA

○​ Rilascia il prodotto

○​ Si dissocia dallo stampo di DNA

○​

L’identificazione in vivo del sito di terminazione di un RNA è complessa dato che

●​ l’estremità 3’ della molecola può essere degradata da enzimi ad attività

ribonucleasica

I terminatori in E. coli sono suddivisi in due classi a seconda che l’RNA polimerasi

●​ richieda, o meno, la presenza di fattori ausiliari per terminare la trascrizione

Nella struttura secondaria dell’RNA trascritto si deve formare una forcina ricca

●​ di G + C(lunga da 7 a 20 basi)

Deve e essere presente una serie di residui di U che seguono la forcina, ma posti

●​ prima dell’effettiva posizione del terminatore

La terminazione dipende quindi dal prodotto a RNA, i cui segnali

●​ agiscono sull’RNA polimerasi

Terminatori intrinseci/ρ indipendenti

I terminatori hanno efficienza diversa tanto che esistono i trascritti

●​ readthrough(passano i siti di fine)

La terminazione può pure essere impedita da alcuni fattori in un evento detto

●​ antiterminazione→anche la terminazione può essere regolata e

quindi controllare l’espressione genica

Le mutazioni puntiformi che riducono l’efficienza di terminazione sono in

●​ genere nello stelo della forcina o nella sequenza di U

L’efficienza di terminazione in vitro è molto variabile dato che dipende anche

●​ dalle sequenze poste a monte e a valle del sito di terminazione: l’enzima può

fare semplicemente una pausa, e anche tale blocco temporaneo può svolgere

funzioni regolative (i.e. attenuazione nell’operone trp)

L’efficienza di terminazione dipende da variabili termodinamiche e cinetiche

●​ influenzate dalle caratteristiche della forcina, dalla serie di U, e dalle ulteriori

sequenze

Una pausa può avvenire a livello di siti simili a terminatori, ma che hanno

○​ una distanza tra forcina e serie di U più lunga dell’ottimale per terminare 25

L’ibrido DNA–RNA concorre molto alle forze che tengono assieme il complesso di allungamento

●​ L’interazione della forcina con l’RNA polimerasi, e/o le forze esercitate dalla sua formazione quando l’RNA

○​ emerge dall’enzima, causano un temporaneo disallineamento dell’estremità 3’ con il sito attivo

Questo evento, assieme all’ibrido debole derivante dalla serie di U, destabilizza il complesso di allungamento

○​ causando la terminazione

Terminatori ρ dipendenti

Necessitano o dell’aggiunta del fattore ρ in vitro per interrompere la trascrizione e l’analisi

●​ mutazionale ha dimostrato che tale proteina è coinvolta nella terminazione in vivo

Il fattore Rho è proteina essenziale in E. coli

●​ Si lega ad una sequenza del trascritto, il sito rut, a monte del sito di terminazione, ma a valle della regione

●​ codificante dell&rsqu