Virologia molecolare

VIRUSOIDI

## che sono dei virus satelliti di alcuni virus delle piante cui

differenza sta nel fatto che presentano un virus ad RNA molto piccolo (200-375 nt)

e spesso vengono trovati con delle proteine e hanno bisogno di virus helper e

utilizzano le loro proteine per formare un capside vero e proprio. Dunque la

similitudine con i viroidi sta al livello genomico, mentre la similitudine con i virus sta

al livello strutturale per la presenza di un capside.

PARTE2

TECNICHE DI LABORATORIO

Un laboratorio di Virologia può essere o un laboratorio di ricerca sui virus oppure un

laboratorio clinico dove si fanno diagnosi e identificazione di eventuali virus.

Importante anche da un punto di vista epidemiologico. Un virologo deve saper fare

una diagnosi virologica ed essere preparato per i virus sconosciuti. Si dividono in

tre tipi (BSL 2, 3 e 4) a seconda del rischio e pericolosità del virus, fatta dal CDC di

Atlanta nel 1974. I laboratori di livello 2 hanno delle protezioni inferiori rispetto a

quelli di livello 4 proprio perché magari non ci si infetta facilmente con quelli di

livello 2 a differenza di quelli di livello 4 che basta semplicemente un’inalazione per

essere colpiti. Il livello 1 è quello normale e non ci sono virus. Il P2 è quello più

comune e non può dare malattie all’uomo o non può essere trasmesso al di fuori

del laboratorio qualora uno si dovesse infettare la patologia non sarebbe grave, il

P3 un po’ meno raro e il P4 molto raro e solo esperti ci lavorano, tant’è che ci sono

dei corsi appositi per questi tipi di laboratori (adesso anche per i P3), esiste una

zona intermedia prima di entrare nel laboratorio e richiede l’utilizzo di una tuta

protettiva come fosse una tuta spaziale con un apparato di respirazione

autosufficiente. Non ci deve essere il rischio di respirare niente in questi laboratori e

si deve essere SEMPRE in due nel caso di incidenti. Per l’uscita c’è un altra porta

(le entrate e le uscite sono controllate da sistemi di sicurezza) che porta ad una

doccia di detergente atta a sterilizzare il più possibile la tuta. Non può uscire niente

dal laboratorio, quindi prima si usavano i FAX per salvare dei dati, oggi i PC. Non si

adatta solo ai virus, anche ai batteri estremamente patogeni. Deve avere tutto ed

essere estremamente fornito.

Per quanto riguarda i BSL-2 si usano semplicemente le cappe a flusso laminare

che però sono di tipo verticale così da riciclare l’aria dall’alto verso il basso e non

infettare l’operatore. I filtri sono in HEPA ossia in microfibra di vetro.

COLTIVAZIONE DELLE CELLULE

Per lavorare con i virus bisogna saper lavorare anche con le cellule, per questo un

laboratorio di virologia è anche un laboratorio di biologia cellulare. Si deve

conoscere tutto (da signaling fino alla sintesi proteica) della cellula ospite per poter

caratterizzare le caratteristiche dei virus. Tant’è che sebbene il primo virus sia stato

scoperto nel 1850 la caratterizzazione di questi al livello molecolare è stato

possibile solo dal 1950 quando è stato messo appunto il primo metodo per la

coltivazione cellulare.

Si distinguono:

- LINEE CELLULARI PRIMARIE (prese direttamente dal tessuto vivo che sia

esso animale o umano) che sono le più idonee a caratterizzare un eventuale

meccanismo virale in quanto più simili a quelle d’origine. Il loro problema è che

possono fare 5 o 10 cicli di sub coltivazione non essendo queste immortalizzate.

Se si vuole fare un studio scientifico esse diventano per quest’ultima cosa le

meno indicate

- LINEE CELLULARI PERMANENTI che sono quelle che si usano in contrap-

posizione a quelle primarie. Almeno per gli studi iniziali e le diverse

categorizzazioni e solo dopo si cerca di confermare certe ipotesi con le cellule

primarie. Questi crescono in sospensione e creano dei tumori solidi negli animali.

Le si possono avere per trasformazione spontanea anche di cellule primarie

oppure trasformarle con virus oncogeni (in genere si usa un poliomavirus

SV40).

- LINEE DI CELLULE DIPLOIDI DA TESSUTO EMBRIONALE che sono una

buona alternativa alle cellule primarie perché non sono cellule trasformate e

hanno dei cicli di replicazione più elevate 40-50 generazioni.

Da considerare che LE UNICHE CELLULE che possono essere utilizzate per

produrre vaccini sono le cellule primarie in quanto sono quelle più “affidabili”.

La correlazione tipo di virus e tipo di linea cellulare è strettamente associata, tanto

più sono i virus con i quali si lavora tanto più sarà diversificata la tipologia di linee

cellulari che si avranno. Generalmente le cellule

utilizzate sono qui sotto

elencate e sono cellule

cellule tumorali. Le più

utilizzate sono le HeLa,

cellula del carcinoma

della cervice. Il nome

sta per Herietta Lacks

che è il nome della

pazienta a cui è stato

fatto il prelievo. Da più

di 50 anni queste cellu-

le danno un contributo

essenziale per la ricer-

ca.

Quasi tutti i tumori della cervice uterina sono prodotti da alcune specie di

papillomavirus, da cui le HeLa. Queste ultime non sono ottime per studiare

fenomeni di apoptosi o proliferazione cellulare in quanto contiene due proteine del

papilloma (E6 ed E7) che prendono il controllo di questi due fenomeni cellulari.

Le colture si fanno in dei contenitori che si chiamano FLASK fatti di un materiale

particolare che permettono l’adesione delle cellule ad un substrato. Per la crescita

si inseriscono in degli INCUBATORI A CO2 che ovviamente devono essere sterili e

che tengono la temperatura sotto controllo (a seconda delle T ideali per il virus) e

l’umidità dell’ambiente. Nelle flasks ci sono i terreni che poi a seconda del tipo

cellulare cambiano. Il più semplice e più utilizzato si chiama MEM (minima

essencial medium) contenente 13 aa essenziali, 9 vitamine, sali glucosio e

tampone bicarbonato (per tenere il PH stabile). Questi si comprano, prima si

facevano, e si aggiunge al momento un siero che generalmente è un siero (ormoni

e altre molecole importanti per le cellule) fetale di vitello o cavallo, antibiotici

(gentamicina o streptomicina, in genere) e indicatori di pH (rosso fenolo) per vedere

se le cellule stanno metabolizzando (passa da rosso a giallo, indica che il mezzo

vuole essere cambiato).

Generalmente non è consigliato usare le cellule murine per i virus perché si

comportano in maniera completamente diverse da quelle umane con un signaling

completamente diverso.

Per fare una coltura serve un pezzettino di tessuto che deve poi essere prelevato

con degli strumenti specifici come bisturi, ad essi si aggiungono soluzioni di

collagenasi e tripsina che serve ad allontanare le diverse cellule per evitare

contaminanti di quel tessuto in specifico come zone adipose (grasso in eccesso)

oppure fibrose, insomma servono ad allentare quello che non serve al tessuto di

interesse. In più ovviamente servono altissime dosi di antibiotici benché si lavori in

ambienti sterili e con strumenti sterili. Dopodiché si passano queste cellule in delle

retine con dei pori di dimensioni tali che passino le cellule separate e singole. Se

non si è contaminato nulla una volta passate le cellule nelle flasks esse iniziano ad

aderire e crescono fino ad occupare tutta la flask (fenomeno chiamato

CONFLUENZA). Una volta che hanno occupato tutta la falsa si fa una coltura

secondaria, che consiste essenzialmente nel cambiare la falska utilizzando la

tripsina per staccarle. Dato che in questo caso si tratta di cellule nuove, non si

conosce bene il comportamento in vitro e dunque bisogna provare diverse

condizioni, potrebbe succedere quindi che alcune crescano più di altre e allora in

quel caso si ottengono delle LINEE CELLULARI diverse ossia si trasformano.

Esse poi possono crescere in sospensione (cellule del sangue per esempio —

JUKART T cells) o in monostrato (endoteliali, ad esempio — HUVEC dai cordoni

ombelicali). Nel primo caso si utilizza tale metodo o perché alcune cellule non

crescono nel terreno solido oppure nelle industrie perché servono ingenti quantità

di cellule (per fare ciò servono dei trucchi: SPINNER COLTURE che non hanno Ca

e Mg e devono avere un agitazione continua, proprio per evitare che le cellule

vadano ad aderire).

Nel caso si voglia isolare una clone si può fare una cosiddetta diluizione in

piastra, che consiste prima in una forte diluizione in sospensione e poi si piastra (li

dove si vede una sola popolazione ben isolata) e si preleva la popolazione per poi

magari clonarla di nuovo e fare i diversi studi.

Le cellule, onde evitare spreco, vista la poca durata delle generazioni cellulari esse

si congelano e si scongelano quelle necessarie. I congelatori hanno poco terreno

con un’alta densità in glicerolo e DMSO (dimetilsulfossido) e ovviamente l’N liquido.

PRODUZIONE DEI VIRUS

Si utilizzano le colture cellulari MA ANCHE le uova embrionate. Quest’ultimo è

molto utilizzato, soprattutto per produrre grandissime quantità di virus, ma anche

utilizzate dalle industrie per produrre vaccini.

Questi devono essere sterili, ci si mette parecchio a farli e generalmente si

comprano ma costano tantissimo.

Si possono utilizzare diverse parti dell’embrione a seconda del tipo di virus, sopra

elencati nell’immagine.

La cavità allantoidea è quella più usata perché contiene più ml di cellule e quindi

potrebbe dare più quantità di virus. Se invece il virus è stato appena isolato si

utilizza la cavità amniotica che contiene minor liquido amniotico e quindi per

concentrare il virus.

La membrana corion allantoidea invece si utilizza per alcuni tipi di virus, tipo quelli

del sarcoma. Questo perché il virus riesce a

crescere solo su delle membrane, formando delle

pustole che è possibile contare. In verità oggi

quest’ultimo saggio non si utilizza più perché è

stata sostituita.

Si fa un piccolo foro, in una camera sterile.

In genere si procede prima sottoponendo l’uovo ad una lampada speciale atta ad

individuare la camera d’aria (serve per poter inoculare in qualsiasi parte della cavità

allantoidea). Poi si fa un foro e si procede con l’inoculazione. Si richiude il buco con

un cerottino per permettere al virus di replicare. Inoltre le uova devono essere

ferme e messe in un incubatore per 4-5 giorni. Successivamente si riapre il foro e si

preleva tutto il liquido della cavità allantoidea. Bisogna a questo punto aliquotarlo e

titolarlo per capire quanto virus è stato prodotto. Si congela, possibilmente in azoto

liquido.

VACCINO INFLUENZALE

Fare un vaccino di questo ge