Laboratorio di metodologie molecolari e cellulari - Pcr

I TERMOCICLATORI

Sono stati assembrati a posteriori; sono delle macchine che permettono di fare in automatico tutti i vari step della PCR - inizialmente si

avevano delle macchine con tre vasche con tre t ≠ e il ricercatore doveva stare li a controllare tempo e tutto; poi è stato fatto il primo

prototipo di termociclatore detto baby blue che sfruttava l’effetto peltier per il cambio di T (in sostanza una piastra si scalda mentre una si

raffredda).

In uno possono starci fino a 384 provette.

Per evitare un’evaporazione date le alte temperature c’è bisogno che il coperchio sia caldo di suo (105C) per creare un gradiente di T verso il

basso. Servono anche a prevenire la condensa del campione sul tappo.

MISCELA DI REAZIONE TIPO DELLA PCR:

• Dna stampo

• Tampone 5x-10x (da diluire per avere una concentrazione finale 1x)

• Primer forward e reverse da 10-25 picomoli

• Mgcl2 25-50 mM (da diluire per avere una concentrazione finale di 1.5 - 2 mM a volte pero è già presente nel buffer)

• Nucleotidi (trifosfato) ognuno a concentrazione finale di 0.2 mM

• DNA polimerasi 1.25 U per reazione

Il volume finale deve essere di circa 10-50 micro litri perciò si porta a volume con dell’h2o

Programma di PCR tipo

La fase 3 è opzionale è permette alla polimerasi di finire di sitetizzare frammenti rimasti incompleti

La fase 4 permette di raffreddare il termociclatore per bloccare tt i processi (specialmente quando si fa pcr overnight)

La temperatura di appaiamento deve essere messa a punto in modo tale da essere perfetta (è l’unica T che puo variare sensibilmente) - deve

essere scelta in modo da dare appaiamenti non aspecifici (t troppo bassa) oppure un appaiamento difficile (t troppo alta), devo andare a

bilanciare questi due aspetti andando a dare un tempo di annealing non troppo lungo in modo da sfavorire i legami aspecifici.

Come si calcola?

Dipende da

• Contenuto di CG del primer e lunghezza di esso

• Temperatura di fusione tra primer ed elica complementare TM

Per un primer di lunghezza 20 pdb la tm ha come formula:

Tm= [4(G+C) + 2(A +T)] C

Nel caso i due primer abbaio tm diversa si usa quella piu bassa e poi si ha il calcolo della ta (temperatura i appaiamento)

Ta = Tm - 2.5C

Posso mantenere la mia ta stabile per tutta la reazione o faccio una reazione di PCR touch down, ovvero che per i primi 15 cicli si utilizza una ta

piu alta di quella teorica che diminuisce ciclo per ciclo per arrivare al 16esimo ciclo che ha la temperatura che avrei usato in principio - dal 16 in

poi la ta rimarrà costante (favorisce la stabilità - non favorisce la formazione di annealing non perfettamente complementari nei primi cicli)

Estensione - basta 1 min per amplificare stampi di cc 1 kb - il tempo è calibrato sulla lunghezza dello stampo da amplificare.

Importante la concentrazione di magnesio perche è essenziale per il funzionamento della polimerasi, se non c’è allora non funziona nulla.

Maggiore è la concentrazione minore è la specificità dell’ appaiamento - il magnesio è + mentre il dna - perciò il magensio andrà a

neutralizzare la carica ed esso formerà piu legami aspecifici perche non ha pii la destabilizzazione della carica.

Spesso si aggiungono altri componenti - degli additivi - quando si ha a che fare con stampi difficili come sequenze ricche di CG che tendono a

rimanere a doppia elica - percio si mettono sostante che favoriscono la denaturazione

Progettazione dei primer, come si disegnano?

Abbiamo bisogno di un primer forward sull’’elica senso e il reverse su quella opposta In modo da deliminatare il primer da codificare. La

sequenza del primer si legge sempre dal 5’ al 3’.

Devono avere una lunghezza minima pr probabilità - servono almeno 17 nucleotidi.

Però primer troppo lunghi avranno una tm talmente alta che anche t di appaiamento elevate non sufficienti.

Il contenuto di CG ottimale è di 40-60% per evitare ta troppo bassi - affinché la t di melting sia simile tra due primer il contenuto di CG deve

essere simile. È anche preferibile avere che l’ultima base in 3’ è o G o C per aumentare la specificità e rendere tutto piu stabile. Inoltre bisogna

evitare le sequenze ripetute perche sono regioni a bassa complessità perche si può avere uno slittamento dell’appaiamento o annealing su siti

aspecifici.

Inoltre bisogna evitare che i due primer siano complementari tra loro e su loro stessi perche non devono appaiarsi a vicenda e non devono

formare strutture secondarie o dimeri.

Strutture secondarie del tipo

o Forcine, interazione del primer con se stesso

Dimeri del tipo

o Self dimer, quindi interazione Inter molecolare fa due molecole dello stesso primer

o Cross dimer, tra i due dimeri ≠

Quando si formano i dimeri la polimerasi va ad amplificare quelli e non le nostre sequenze di interesse.

SOFTWARE PER IL DISEGNO DEI PRIMER

Primer3

Primer - BLAST

In questi siti si possono impostare tutti i parametri di nostro interesse per avere un primer come lo vogliamo noi - segnalano anche la

formazione di forcine o di dimeri, e anche se il primer è unico nel nostro gene o meno.

EFFICIENZA DI UNA REZIONE DI PCR

In teoria la quantità di prodotto raddoppia ad ogni ciclo secondo questa legge:

N = N0 x 2^n

Ma c’è una parte costituita dall’efficienza di amplificazione (E) che è la frazione di dna stampo che viene duplicata ad ogni ciclo che pero non è

mai uguale a 1 essendo che vorrebbe dire che è il 100%

L’equazione piu corretta percio è:

N = N0 x (1+E)^n

Quali fattori influenzano l’efficienza?

Non è costante durante la pcr perché è influenzata da una serie di fattori che variano

• Concentrazione della dna polimerasi, dei nucleotidi e del magnesio

• Quando il dna si denatura si potrebbero denaturare anche frammenti già amplificati che vanno a rubare il posto ai primer

• Produzione di inibitori della reazione come il pirofosfato

• Strutture secondarie ricche di CG che rendono difficile la denaturazione

• Produzione di prodotti aspecifici

• Lunghezza della sequenza da amplificare

La Pcr ha una cinetica di accumulo esponenziale fino ad un certo numero di cicli - venderemo che il grafico è esponenziale per poi arrivare ad

un plateau (intorno al 30/35 ciclo).

Ci possono essere dei problemi di contaminazione della Pcr essendo che essa è molto sensibile e se ci fossero si rischierebbe l’amplificazione

anche di questa.

Come ridurre i problemi?

• Mantenere tutto separato

• Avere provette alioquitate (se ci dovesse essere la contaminazione di un aliquota non si va a perdere tutto)

• Utilizzare la cappa, guanti monouso e set di micropipette dedicato

• Decontaminazione tramite raggi UV

• Utilizzo dell’uracile al posto della timina perche poi nelle reazioni successive si può andare a togliere grazie all’uracil dna glicosilasi e il

nucleotide rimarrà abasico cosi da non potersi amplificare.

VARIANTI DEL PROTOCOLLO CLASSICO DI PCR

PCR HOT-START: aggiunta della polimerasi nella fase iniziare della denaturazione invece che subito per evitare l’ appaiamento aspecifico -

questo però implicava l’apertura del termociclatore e delle provette per inserire la polimerasi e quindi ce un elevato rischio di contaminazione.

Si puo sostituire coniugando la polimerasi a degli anticorpi che legano il sito catalitico dell’enzima e gli impediscono l’attivazione prima dei 95C.

PCR LONG - RANGE

Si utilizza una miscela di taq polimerasi e polimerasi proofreading per andare ad amplificare efficientemente frammenti di dna più lunghi -

bisogna pero andare ad aumentare il t di estensione ad ogni ciclo

NASTED PCR

Dopo una prima reazione di pcr ne viene fatta un’altra su una piccola aliquota della prima utilizzando uno o entrambi i primer che si appaiano

all’interno della prima per ottenere un’amplificazione piu piccola della prima.

Ci permette di aumentare la specificità - sostanzialmente frammenti aspecifici nella prima amplificazione dovrebbero scomparire nella seconda

in quanto è improbabile che ci sia un match di primer anche li. Aumentano anche la sensibilità.

CLONAGGIO PRODOTTI PCR

Ci sono tre metodi

• TA CLONING: la taq poli quando finisce di sitetizzare aggiunge un reasiduo di adenina all’estremità 3’ perciò vengono fattori

linearizzati che contengono una T sporgente per andare a formare delle estremità coesive per avere una ligazione efficiente.

Se pero si utilizza anche la polimerasi proofreading essa crea delle estremità piatte perciò se si vuole avere l’estremità sporgente si

deve aggiungere la taq e far fare un ciclo a se stante.

• TOPO CLONING: piu o meno stesso discorso di prima ma sta volta si fruttano anche le toposiomerasi legate alle T sporgenti dei

vettori che aumentano l’efficienza dei attacco - la topoisomerasi catalizza la ligazione fra vettore e inserto. È piu efficiente e rapida di

quella vista prima e ha un’efficienza del 100% - la ligazione con se stesso è prevenuta dalle A sporgenti.

• UTILIZZO DI PRIMER MODIFICATI: i primer per la pcr possono essere utilizzati per inserire un sito di restrizione - hanno una regione in

3’ complementare allo stampo ceh si vuole amplificare e il sito di riconoscimento per l’enzima è il 5’ - perciò l’ appaiamento è

garantito solo dal 3’ perciò al primo ciclo non ci andrà ad attaccare il 5’,ma dal secondo in poi il primer complementare va a ricopiare

tutto anche la porzione che non si era legata prima percio si ha tutto attaccato.

La taq non ha attività di proofreading percio puo andare ad inserire degli errori - questi vengono identificati tramite uno screening delle

colonie.

Come funziona?

Questa tecnica vale sia per il clonaggio a seguito della pcr che per il clonaggio classico.

Allestiamo una pcr su colonia con primer universali disegnati sulla sequenza del vettore ai lati del sito di clonaggio (i primer universali sono

primer forward e reverse che vanno a legarsi a sequenze che fiancheggiano il msc): prelevo la colonia e la unisco ad una miscela di pcr, ho una

denaturazione iniziale che mi fa lisare una parte delle cellule che rilasciano il nostro plasmide e mi fanno avere l’amplificazione; prelevo poi il

prodotto e lo vado ad osservare su elettroforesi per avere la certezza di avere una sequenza della lunghezza che mi aspettavo etc. Poi posso

fare il Sequenziamento per essere sicura al 100%.

Si puo fare anche lo screening di librerie genomiche tramite pcr che consiste in 2 passaggi:

1. Screening primario: tutti i cloni della libreria genomica vengono fatti crescere in piastre e poi viene prelevato il dna da queste colonie

e viene mischiato per avere un master pool; io ho creato