Appunti Biotecnologie genetico molecolari

Il ceppo è un microrganismo he si distingue per i geni, ma non per il 16S perché appartengono

alla stessa specie.

Questa analisi viene fatta in silico. In questo lavoro vanno ad ottenere curato (ceppo privo dei

plasmidi) con arancio acridina (agente mutageno) con un unico trattamento. Si ottiene così il

ceppo curato. Il primo risultato è che la presenza di plasmidi non ha effetti sulla crescita in MRS

a 37°. La presenza di NaCl al 6% influisce sulla crescita. Nessun effetto sulla acidificazione.

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Sia il ceppo curato che il ceppo One type sanno usarlo lo xylano, quindi l’informazione non è

sul plasmide.

È stato trovato il gene mobA che è il gene implicato nella mobilizzazione; plasmidi per la

tolleranza al sale; geni correlati al metabolismo di alcuni carboidrati come la lattato

deidrogenasi (per avere due geni he ripristinano il potere riducente, resto comporta maggiore

velocità) e geni per il processo catabolico dello xilano; geni per codificare tossine e batteriocine

in particolare per la tossina mazF-toxin ( i geni devono essere indicati in corsivo, mentre il

prodotto del gene non deve essere scritto in corsivo) con proprietà probiotiche e serve per

competere e inibire la sintesi proteica di patogeni; geni coinvolti nella tolleranza ai metalli.

Distribuzione geni: alcuni

hanno ragioni bianche con geni

che codificano informazioni

non note. In tutti i plasmidi ci

sono categorie di geni coinvolti

nei processi cellulari (verde),

esempio formazione del setto

per la divisione cellulare. In

giallo ci sono tutte le

informazioni della cellula per

comunicare con l’ambiente.

Questa è una predizione a

livello della grandezza per dire

quali informazioni si trovano sui

geni.

Dopo questa caratterizzazione è stato caratterizzato in vitro con alcune proprietà funzionali,

per poter caratterizzare queste informazioni è necessario rimuovere il plasmide. Per creare il

curato si utilizza arancio di acridina che si intercala La doppia elica il DNA e non è più

disponibile alla sua funzione. Il mutageno non è selettivo nel DNA plasmidico e potrebbe

intercalarsi nel DNA cromosomale, è quindi fondamentale stabilire la concentrazione da

utilizzare che non inibisce la crescita batterica. A seguito stata valutata la curva di crescita del

ceppo curato e del ceppo One type. Il curato cresce più velocemente rispetto al ceppo One

5 type, a 24h raggiungono la stessa

densità cellulare. Nei confronti della

crescita in 6% di NaCl evidenzia che

questi plasmidi non sono implicati. Lo

xilano viene usato sia dal ceppo One

type e dal ceppo curato. La crescita a

concentrazioni superiori di NaCl (8%)

diminuisce in entrambi i ceppi. Il lavoro

viene proseguito con la caratterizzazione

di altre proprietà funzionali: molecole

estratte da ceppo curato e ceppo One

type, nella seconda le molecole testate,

mentre nella terza e quarta colonna

sono presenti valori della minima

concentrazione di inibenti e si usa per

capire la sensibilità o meno di un ceppo

rispetto una molecola ad esempio gli

antibiotici. L’unica differenza tra ceppo

curato e ceppo One type nella sensibilità

della clindamicina che nel curato è meno resistenza. Gli antibiotici hanno uno specifico target

nella cellula batterica (parete, enzimi intracellulari, ribosomi per inibire la traduzione delle

proteine) e inibiscono la crescita del patogeno (batteriostatico), i biocidi invece non hanno uno

specifico target, ma possono averne più di uno e hanno attività battericida (portano alla morte

delle cellule). Per i batteri è più facile avere resistenza agli antibiotici. Non ci sono differenze

sulla MIC per altri antibiotici, neanche sulla crescita in presenza di composti fenolici. Anche

per i metalli sono state determinate le MIC (minima concentrazione inibente) , è uguale per tutti

i metalli tranne per mercurio e cadmio. Inoltre è stata valutata la capacità di adsorbire i metalli

pesanti alla porzione extracellulare degli esopolisaccaridi. Nella seconda parte c’è la

valutazione di specifiche attività probiotiche. Cambia la capacità di inibire patogeni, la

tolleranza al pH, tolleranza alla bile, cambia inoltre la capacità di aderire alla mucina.

Dai risultati questo lavoro rappresenta un esempio di

come andare a valutare le informazioni presenti nei

plasmidi.

ESEMPIO 2: questo caso si sfrutta il fenomeno della

coniugazione. N questo caso vengono trasferite

specifiche informazioni a Lacticaseibacillus rhamnosus

che ha la caratteristica di non crescere bene in latte per

manza di geni e non ha attività proteolitica nei confronti

della caseine. La coniugazione avviene da Lactococcus

lactis NCDO 712. 6

In rosso ci sono le informazioni necessarie per la replicazione del plasmide, in verde I geni del

lattosio, e in azzurro geni per le proteasi. L’esperimento è stato mettere in contatto i due batteri

e consentire la coniugazione. Affinché avvenga la coniugazione le cellule sono state messe

insieme , serve un metodo per discriminare e due cellule successivamente, è stata usata la

resistenza intrinseca nei confronti alla valcomicina (antibiotico). Mentre l’attività proteolitica

rimane stabile nelle generazioni, la capacità di utilizzare il lattosio no.

Il documento "Plasmid Evolution" tratta l'evoluzione dei plasmidi, elementi genetici che

colonizzano e si replicano nelle cellule procariotiche. Sono considerati una forza trainante

dell'evoluzione dei procarioti grazie alla loro capacità di trasferirsi tra popolazioni, favorendo il

trasferimento laterale di DNA e la competizione microbica.

FAGI E TRASDUZIONE È un trasferimento genico orizzontale che coinvolge

i fagi. I fagi sono un metodo noto coinvolti nel

trasferimento orizzontale.

Nell’immagine sono indicati i due cicli

che interessano i fagi: ciclo lisogeno e

ciclo litico. Il primo obiettivo dei fagi è

infettare la cellula batterica: il fago si

attacca su specifici recettori della

cellula batterica e inietta i propri acidi

nucleici (DNA e RNA). Provoca la

degradazione del genoma della cellula batterica e si ha l’assemblamento di particelle fagiche

che porta alla produzione di cellule fagiche e alla lisi della cellula. Nella seconda possibilità il

genoma fagico si integra con il genoma batterico e si replica con esso(profago) la cellula

batterica si chiama cellula lisogenica. Questo ciclo va avanti finche un segnale ambientale

induce l’escissione del genoma fagico che induce il ciclo litico.

Una relazione di antagonismo in un ambiente specifico come il microbiota umano si è

trasformato in una relazione mutualistica ossia una relazione positiva per fagi e batteri.

Sul pianeta terra si arriva ad avere 10 particelle fagiche, che sono 10 volte superiori alle cellule

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batteriche. I fagi necessitano di un ospite suscettibile (che consenta loro di entrare) da cui

dipendono per la replicazione del genoma e per la loro sopravvivenza. Il processo di infezione

avviene a spese della cellula batterica perché mette a disposizione al fago tutto ciò che

necessita per la replicazione del suo genoma. La lisi porta alla morte della cellula. È un costo

anche se integrato nel genoma perché la cellula ha più genoma da replicare. La convivenza con

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il profago conferisce un vantaggio alla cellula batterica stessa perché il profago si porta dietro

informazioni che possono essere utili alla cellula stessa. Dall’analisi del genoma si nota che

più o meno tutti i genomi comprendono una sequenza fagica. Ci possono essere comunità

complesse di cellule (es microbiota intestinale, mare..) in cui per fermare la replicazione del

genoma fagico la cellula batterica si lisa sacrificandosi per la popolazione. L’intestino umano

oltre la comunità batterica continente anche dei fagi sia batterici che di eucarioti e tutto questo

prende il nome di viroma. Nell’oceano i sono più virus che cellule batteriche (1/100) mentre

nell’intestino il rapporto è 1/1.

L’effetto dei fagi: due punti di vista. A livello di Singola cellula l’interazione cellula-fago non è

mai positiva. - Ciclo litico: la cellula muore

- Lisogenesi: c‘è un periodo di

convivenza fino a qualche segnale

ambientale che induce la produzione

di particelle fagiche e lisi della cellula

(es crisi energetica per la cellula

batterica Ossia carenza di fonte di carbonio, oppure incapacità della cellula di usare la

fonte di carbonio).

- Infezione cronica: c’è l’ingresso del genoma virale una volta all’interno della cellula

batterica c’è la continua produzione di particelle fagiche senza lisi della cellula ospite.

Mentre nel ciclo lisogenico a presenza del fago può rappresentare un vantaggio,

nell’infezione cronica rappresenta un costo metabolico che influisce sulla capacità di

crescita di una cellula. La curva rossa si sposta verso destra e quindi aumenta la fase di

latenza, l’altro effetto è accorciamento della fase esponenziale e quindi si avrà una

minore densità cellulare.

Lo scenario a livello di singola cellula è sempre negativo.

A livello di popolazione l’interazione fago-batterio apporta la coesistenza tra fago e batterio.

1. Popolazione di batteri sensibili ad una

specifico fago: questo porta alla cellula di

produrre varie ti genotipiche (irreversibili)

resistenti al fago; la seconda variante è a

livello fenotipico (reversibile).

2. La comunità resiste alle fasi del fago.

3. Le cellule fagiche vanno ad attaccare

le forme che possono essere sensibili

4. Il fenotipo reversibile resistente al fago

ritorna sensibile, ma il fago si è adattato ad

attaccare la variante fenotipica.

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Tutto ciò va a creare variabilità generica. C’è un effetto di protezione da parte della comunità.

Avere più varianti consente di avere una maggiore protezione della popolazione, perdere un

fenotipo può causare a perdita di un meccanismo di protezione. Un esempio è il microbiota

intestinale in cui virus e batteri hanno imparato a coesistere, questo antagonismo si è

sviluppato nel corso dell’evoluzione attraverso due strategie particolari on la premessa che

l’esposizione ai fagi è la forza che induce variabilità all’interno di una popolazione microbica.

Perdere n fenotipo, una variante è un costo per una comunità batterica perché grazie a queste

raggiunge una certa labilità nei confronti ei fagi.

Strategia:

- Corsa alle armi: continuo adattamento della cellula batterica nei confronti del fago e il

fago nei confronti del