Biologia molecolare

SR

Al livello del primo esone sono presenti le proteine ESE, chinasi

che fosforilano l’U1

L’U1, una volta fosforilata, migra dallo specors e si lega al sito di

splicing al 5’. Migrando porta con sé proteine che servono per

prepara l'introne per l'altro snrna U6

assemblare lo spliceosoma.

SR

Le proteine ESE legato all’esone successivo fosforilano U2AF35,

proteina che si attiva e si lega al sito di splicing 3’ e cambia

conformazione.

Questo cambio di conformazione fa richiamare U2AF65, una

seconda proteina più grande che, dopo essersi legata all’introne,

cambia conformazione e richiama BBP che si lega al livello

e prepara tale regione per U2

dell’adenina del sito di ramificazione. SR

U2 viene fosforilata dalle proteine ESE e si lega al sito di

spinta fuori si forma un'ansa

ramificazione, ma non all’adenina che viene estrusa verso 2'

l’esterno e quindi esibisce meglio il suo gruppo alcolico in 3’.

2'

Le proteine SR fosforilano e attivano U4-U6 (che viaggiano

U1 si stacca e lascia il posto a U6 che si trova legata a U4 e sappiamo

insieme) e U5. che è complementare con U 2 quindi u4 si stacca...

U4 si stacca da U6 che può legarsi al sito di splicing al 5’

prendendo il posto di U1. U6 rimane fermo

U2, essendo complementare a U6, ha la tendenza a legarsi con

U6 e trascina il sito di ramificazione fino al sito di splicing al 5’ e allineando l’adenina del sito di ramificazione con

il primo nucleotide dell’introne (in genere guanina).

Le proteine che compongono lo spliceosoma, grazie ad amminoacidi basici come lisina e arginina, determinano

l'ambiente dello spliceosoma va a ionizzare il gruppo alcolico presente al 2' dell'A

la ionizzazione del gruppo alcolico in 2’ dell’adenina del sito di ramificazione, che sferrerà un attacco nucleofilo

che idrolizza il legame fosfoestereo 3’ che lega il sito di splicing 5’ all’esone e forma un legame fosfoestereo con

il primo nucleotide dell’introne. L'introne si stacca determinando una struttura a cappio

L’esone staccato è tenuto dalle proteine dello spliceosoma. Le proteine di U5 agganciano l’esone e lo trascinano

fino al sito di splicing 3’ allineando il gruppo alcolico 3’ col primo nucleotide dell'esone successivo.

Le proteine dello spliceosoma ionizzano il gruppo alcolico 3’ dell’esone che effettua un attacco nucleofilo sul

L'ambiente

primo nucleotide dell’esone successivo e forma un legame fosfoestereo che unisce i due esoni.

Una volta concluso il processo, i componenti vengono defosforilati e migrano negli specors (comprese le

proteine SR).

Gli introni sono utili in quanto proteggono le sequenze codificanti dalle mutazione. Essendoci più sequenze

non codificanti è più difficile che una mutazione cada su una sequenza codificante. 17:30

Splicing alternativo serve a ottenere più proteine da un singolo gene

Il genoma contiene un numero geni nettamente inferiore al numero di proteine sintetizzate. Questo

avviene grazie a diversi processi.

Trans-splicing

Un primo processo (che non avviene nell’uomo) è l’unione di esoni derivanti da

due mRNA differenti. Questa unione da vita a un mRNA ibrido che

corrisponderà a una proteina nuova.

Splicing alternativo

Lo splicing alternativo è un meccanismo di splicing che permette agli

esoni di essere uniti in ordine differente da quello normale. Questo

permette tante più combinazioni (quindi proteine) quanti sono gli

esoni dell’mRNA. exon skipping

I complessi ribonucleoproteici possono quindi considerare gli esoni

come se fossero introni e rimuoverli insieme ad essi.

I complessi ribonucleoproteici possono anche mantenere parte degli

intron retention

introni.

Alcuni introni possiedono sequenze consenso che permettono

l’aggancio di inibitori dello splicing. Quindi, essendo legati questi inibitori, lo spliceosoma non può legarsi.

Gli introni si distinguono in:

- Introni di 1° gruppo: introni capaci di semiautosplicing, ovvero

sono in parte capaci di autoeliminarsi in presenza di alcuni

componenti

- Introni di 2° gruppo: introni capaci di autosplicing presenti solo in

alcuni procarioti, nei mitocondri e nei cloroplasti

Circa il 15% degli introni hanno siti di splicing differenti (AU al 5’ e AC al 3’).

In tal caso gli snRNA saranno diversi (U1→U11, U2→U12, ecc.), ma il

funzionamento è identico.

leggere

RNA editing

L’RNA editing è la modifica dell’RNA in seguito alla maturazione. Ciò

permette la formazione di proteine differenti a partire dallo stesso

trascritto, talvolta alterando perfino la sequenza di lettura.

L’unico esempio presente nell’uomo riguarda il gene che codifica per

l’apolipoproteina b, espresso in due soli tipi cellulari (epatocita ed

enterocita) mentre negli altri il promotore è metilato.

Nell’epatocita il messaggero produce la sintesi dell’apolipoproteina B100, proteina che

lega colesterolo, trigliceridi e altri lipidi per formare LDL.

Nell’enterocita l’mRNA maturo viene modificato dalla citidina-deaminasi, che lega una

specifica citosina e la deammina, trasformandola in uracile. Questa modifica trasforma

un codone CAA (glutammina) in UAA (stop), quindi blocca la trascrizione formando l’apolipoproteina b48

(48% rispetto al normale), proteina che aggancia i lipidi alimentari per formare chilomicroni e, attraverso la

linfa, entra nel torrente circolatorio.

Traduzione

Una volta maturo, l’mRNA viene trasportato da specifiche proteine dal nucleo al citoplasma. Una volta nel

citoplasma, l’mRNA viene agganciato da altre proteine.

per traduzione si intende la codifica/conversione del messaggio presente nell'mrna in un messaggio

rappresentato dagli amminoacidi

Ribosomi

I ribosomi sono complessi ribonucleoproteici formati da una subunità maggiore e una minore. Quelli

procariotici si differenziano da quelli eucarioti per proteine in peso e numero.

L’intero ribosoma procariotico ha un coefficiente di sedimentazione di 70S. Le subunità sono:

- Minore: con 30S, è formata dall’rRNA 16S a cui si aggregano 21

proteine (Small protein)

- Maggiore: con 50S, è formata da due rRNA, 5S e 23S (con 2

domini ribozinici) a cui si aggregano 34 proteine differenti.

L’intero ribosoma eucariotico ha un coefficiente di sedimentazione di

80S:

- Minore: con 40S, è formata dall’rRNA 18S a cui si aggregano 33

proteine

- Maggiore: con 60S, ha 3 rRNA, 5.8S, 28S (con 2 domini ribozimici)

il 5 s non è un vero rrna

e 5S, a cui si aggregano 52 proteine

Il 5S non è trascritto dall’RNA polimerasi 3, ma dalla 1.

1 3

pre inizio lunga- inizio-allungamento- terminazione

Traduzione

Man mano che gli amminoacidi vengono incorporati,

il gruppo amminico dell’amminoacido entrante

compie un attacco nucleofilo su quello

precedentemente incorporato. L’energia che si libera

viene usata per formare il legame carbammidico

peptidico.

Nel legame peptidico vi è il fenomeno della risonanza,

per cui gli elettroni π tra C e O sono in realtà dispersi

tra C e N, in quanto attratti sia da O che da N. Si ha

così un legame intermedio tra quello semplice e

doppio tra “O e C” e tra “C e N”.

Questo fenomeno impedisce la rotazione tra gli

amminoacidi, il che da una certa rigidità alla proteina

che ha la tendenza a ripiegarsi per scaricare l’energia

e forare legami deboli che danno le altre strutture. Questa ripiegatura

garantisce le funzioni delle proteine.

Il ribosoma ha 3 cavità:

- A (o amminoacidica): formata principalmente dalla subunità maggiore

qui si localizzano i transfert con gli aa e la porzione

e una piccola parte dalla minore.

di subunità minore a livello di questa cavità prende il nome di centro di codificazione

- P (o peptidica): cavità di uscita dell’mRNA e permette l’idrolisi

meccanica dei legami a idrogeno del codone con l’anticodone. qui viene sintetizzata la proteina

- E (o exit): sito da cui escono i transfert scarichi. perché la proteina viene

caricata su un altro transfert per allungarla

Tra A e P c’è il centro della peptidil transferasi, dove il legame peptidico viene

catalizzato dai ribozimi. della traduzione

Sopra al sito A vi è il centro di legame dei fattori, centro ribozinico che modula

tutto il processo della traduzione dal pre-inizio alla terminazione.

Ci sono due siti ribozimici molto importanti nei ribosomi, tra sito A e P l'rna 23s e rrna 28 s negli eucarioti determinano la

peptidil transferasi, a questo livello avviene la formazione dei legami peptidici tra gli amminoacidi

Traduzione

Le 3 cavità E P A si formano quando il ribosoma si assembla e contiene il

messaggero.

Quando il messaggero esce dal ribosoma (a livello del sito P), interrompe i

legami idrogeno con l’anticodone del tRNA, in modo che possa uscire dal sito

exit.

Sono presenti due centri ribozimici:

1. Peptidiltransferasi: situato tra il sito A e P. Catalizza la formazione del legame peptidico.

2. Centro di legame dei fattori: situato sopra al sito A. Coordina i vari step della traduzione.

Assemblaggio del ribosoma procariotico

La traduzione procariotica si differenzia da quella eucariotica da set di fattori, più complessi negli eucarioti,

ma con un meccanismo molecolare simile.

nei procarioti non abbiamo il 5' protetto di conseguenza i messaggeri vengono subito

agganciati dal ribosoma

Fase di pre-inizio

con legami L’mRNA arriva sulla subunità minore del ribosoma e si complementarizza

a idrogeno mediante la sequenza di Shine-Delgarno (AGGAGG) con una porzione al 3’

dell’rRNA 16S (unico rRNA della subunità minore). Questo appaiamento farà

e blocca il messaggero

posizionare il codone di start (AUG) sul sito P della subunità minore.

sulla sub minore

quando aug si trova nel sito p si dice che la sequenza d lettura è aperta

La fase di pre-inizio è coordinata dai fattori di inizio:

• IF3 (o fattore anti-associativo): fattore di inizio legato in prossimità del

sito E della subunità minore, impendendo che la subunità maggiore si

leghi alla minore prima che il complesso si sia formato.

Il suo distacco avviene al termine della fase di pre-inizio.

si localizza nel centro di codificazione

• IF1: fattore di inizio che maschera il secondo codone posizionato sul sito

A, impedendo ai tRNA di agganciare il secondo codone prima che il

ribosoma si assembli

• IF2: proteina G accoppiata sempre a una molecola di GTP. Riconosce il

transfert iniziatore