C3G nella regolazione cellulare: un possibile target terapeutico per Glioblastoma

UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DEL SANNIO

Dipartimento di Scienze e Tecnologie

Corso di Laurea in Biotecnologie

Tesi di Laurea in

Biologia Molecolare

“La proteina C3G nella regolazione cellulare:

un possibile target terapeutico per Glioblastoma”

Relatore: Candidata:

Ch.mo Prof Marina Ala

Massimo Pancione Matr.171003535

Correlatore:

Ch.mo Prof

Álvaro Gutiérrez-Uzquiza Anno accademico 2022/2023

INDICE

INDICE ................................................................................................................................. 1

INTRODUZIONE .................................................................................................................... 2

CAPITOLO PRIMO - La segnalazione cellulare ..................................................................... 3

1.1 Meccanismi di segnalazione: principi generali ........................................................ 3

1.2 I recettori RTK: oligomerizzazione per riconoscimento del ligando ....................... 5

1.3 I domini SH2 e SH3 ................................................................................................. 7

1.3.1 Src Homology domain 2 8

..........................................................................................

1.3.2 Src Homology domain 3 9

..........................................................................................

1.3.3 I domini SH2 e SH3 nella regolazione cellulare 11

....................................................

1.4 Oncogeni e Oncosoppressori .................................................................................. 13

1.4.1 La proteina Crk 15

......................................................................................................

–

CAPITOLO SECONDO I controllori della segnalazione ................................................... 17

2.1 Regolazione da GTPasi .......................................................................................... 17

2.2 Proteine GAP e proteine GEF ................................................................................ 17

2.2.1 Le GTPasi Ras 19

.......................................................................................................

2.2.2 La via delle MAPK 20

................................................................................................

2.3 La proteina C3G ..................................................................................................... 22

2.3.1 C3G nei sistemi di segnalazione 23

............................................................................

L’importanza di C3G

CAPITOLO TERZO - ......................................................................... 26

3.1 C3G nel tessuto nervoso ......................................................................................... 26

3.2 Il Glioblastoma ....................................................................................................... 28

3.2.1 Perché il GBM è così invasivo? 30

.............................................................................

3.2.2 Ruoli di C3G nel glioblastoma 33

..............................................................................

CONCLUSIONI - Implicazioni Cliniche e Prospettive Terapeutiche ................................... 37

BIBLIOGRAFIA .................................................................................................................... 39

1

Introduzione

Il presente elaborato ha lo scopo di mostrare come difetti nei sistemi di

segnalazione possano contribuire allo sviluppo di forme tumorali e come si

possano, attraverso studi di caratterizzazione dei fattori coinvolti, sviluppare

strategie terapeutiche mirate. Fra i tumori più difficili da trattare si colloca il

glioblastoma multiforme (GBM), il tumore ad oggi più letale, a causa del grande

numero di interattori interessati e dell’alto grado di invasività delle cellule

cancerose, che rendono complicato sviluppare tecniche di trattamento

personalizzate. C3G è una proteina dal ruolo chiave nel GBM. Essa è implicata

in una vasta rete di funzioni, dipendenti e non dalla sua attività come regolatore

della segnalazione, nella quale interagisce con proteine di superficie, come i

recettori RTK, con effettori downstream, come la proteina Rap1, e con molti

fattori coinvolti in vie di segnalazione a cascata, come quella delle MAPK.

Attraverso l’analisi di studi in merito, quindi, questo elaborato sostiene la tesi dei

gruppi di ricerca del Dipartimento di Biochimica dell’Università Complutense di

Madrid, da cui si è adottato l’argomento di studio, secondo cui la proteina C3G

può diventare un bersaglio chiave nel trattamento del glioblastoma multiforme,

in seguito a una più approfondita e necessaria caratterizzazione dei meccanismi

descritti. 2

1. CAPITOLO PRIMO - La segnalazione cellulare

1.1 Meccanismi di segnalazione: principi generali

Nonostante sembrino tendere alla perfezione funzionale, spesso i

meccanismi di segnalazione contribuiscono allo sviluppo di forme tumorali.

Questo accade a causa della grande complessità delle vie di trasduzione del

segnale, reti che descrivono le interdipendenze funzionali tra distinte classi di

molecole, che determinano collettivamente la risposta di una specifica cellula ai

suoi segnali afferenti .

1

Un sistema complesso quale un organismo pluricellulare richiede una costante

comunicazione cellula-cellula, che si attua con lo scambio di molecole segnale

che veicolano l’informazione. Alcune di queste molecole agiscono su lunghe

distanze, inviando segnali a cellule molto lontane; altre, invece, contattano solo

cellule limitrofe.

I meccanismi di segnalazione differiscono per la tipologia di informazione da

trasmettere e per i relativi messaggeri coinvolti. In tutti i casi, però, la ricezione

del segnale avviene per riconoscimento, da parte di una proteina recettoriale, di

una molecola specifica, che può condurre, tramite cambiamenti nella cellula,

all’attivazione o inibizione di una via cellulare di interesse ( ).

2

Figura 1.1

1 Ochsner, S.A., Abraham, D., Martin, K. et al. The Signaling Pathways Project, an integrated ‘omics

knowledgebase for mammalian cellular signaling pathways. Sci Data 6, 252 (2019).

https://doi.org/10.1038/s41597-019-0193-4

2 (Bruce Alberts 2009, cap.15 p.867) 3

Ciò avviene per l’intervento, a seguito dell’attivazione di un recettore, di proteine

di segnalazione intracellulari, capaci di elaborare il segnale recepito dalla cellula

e di distribuirlo agli specifici bersagli a valle delle vie di segnalazione, che sono

anche detti proteine effettrici. A seconda della tipologia di segnale e dello stato

della cellula ricevente, gli effettori possono agire, poi, come regolatori della

trascrizione, canali ionici, componenti di una via metabolica o parti del

citoscheletro.

I sistemi di segnalazione, quindi, veicolano un’informazione precisa, per mezzo

di pathway interconnesse, che costruiscono una complessa rete di trasmissione,

capace di amplificare il segnale da riportare, tramite ramificazioni a valle della

via ( ). In alcuni casi la ramificazione può anche permettere a un segnale

3

Figura 1.2

di modulare la forza di una risposta ad altri segnali, con l’intervento, ad esempio,

dei sistemi a feedback.

Figura 1.1: Il legame di una molecola segnale a un

recettore transmembrana attiva il meccanismo di

trasduzione del segnale.

3 (Bruce Alberts 2009, cap.15, p.917) 4

Figura 1.2: Rappresentazione semplificata dell’interconnessione di

cinque vie parallele di segnalazione, attivate da recettori accoppiati

a proteina G (GPCR) e da recettori tirosina-chinasi (RTK).

1.2 I recettori RTK: oligomerizzazione per riconoscimento del ligando

I recettori si distinguono in recettori di superficie, che riconoscono ligandi

idrofili, e recettori con localizzazione intracellulare, capaci di legare molecole

sufficientemente piccole e idrofobiche per attraversare la membrana plasmatica.

I recettori di superficie, in particolare, agiscono da trasduttori del segnale,

convertendo il legame di un ligando extracellulare in segnali intracellulari che

alterano il comportamento della cellula (Bruce Alberts 2009).

Alla classe dei recettori di superficie appartengono i recettori con attività

tirosina-chinasica (RTK), proteine dimeriche integrali di membrana, costituite da

5

un dominio extracellulare, di legame alla proteina segnale, e un dominio tirosina-

chinasi sul lato citosolico ( ).

4

Figura 1.3

In assenza dei segnali extracellulari, il recettore RTK è in forma monomerica,

con il dominio chinasi inattivo. Il legame al ligando provoca nel recettore un

cambiamento conformazionale, che unisce i due monomeri per formare un

dimero, il che conduce, nella maggior parte dei casi, i due domini chinasici a

fosforilarsi a vicenda su tirosine specifiche, con completa attivazione della

proteina.

Da ciò scaturisce una vera e propria catena di fosforilazione di tirosine, che

genera siti di attracco per proteine di segnalazione intracellulari, le proteine

adattatrici, con formazione di complessi proteici ( ), che permettono di

5

Figura 1.4

trasdurre, modulare e amplificare i segnali lungo vie di segnalazione multiple

(Bruce Alberts 2009).

I meccanismi di dimerizzazione variano molto tra i diversi membri della famiglia

degli RTK, fra cui si ricordano il recettore dell’insulina (IGF1R), quello del

fattore di crescita dell’epidermide (EGFR) e il recettore del fattore di crescita dei

fibroblasti (FGFR).

4 (Lemmon e Schlessinger 2010)

5 (Bruce Alberts 2009, 906) 6

Figura 1.3: Attivazione del recettore per dimerizzazione indotta dal ligando. Le proteine di segnalazione legate alle

fosfotirosine (“P” sul recettore) fanno da impalcatura per la trasmissione a valle.

Figura 1.4: Formazione di multi-complessi proteici per

segnalazione da RTK.

1.3 I domini SH2 e SH3

La formazione dei grandi complessi proteici sulla coda citoplasmatica di un

recettore RTK è una strategia semplice ed efficace per aumentare la specificità

delle interazioni tra le molecole segnale, assicurando che esse interagiscano

solo con proteine designate. L’assemblaggio di tali complessi di segnalazione 7

dipende da domini di interazione altamente conservati, come i domini SH2 e

SH3 (Bruce Alberts 2009).

1.3.1 Src Homology domain 2

I domini SH2 (Src Homology-domain 2) sono stati scoperti nella proteina

tirosina chinasi Src, caratterizzata a partire dall’oncogene virale v-Src, causa del

“sarcoma di Rous”, e sono stati così denominati per l’omologia strutturale con la

Src (Waksman G. 1992).

La struttura dei domini SH2 è costituita da circa 100-120 amminoacidi e

comprende tre regioni principali ( , (Waksman G. 1992)):

Figura 1.5

α-elica N-terminale: regione coinvolta nel riconoscimento e nel legame con

o il residuo di fosfotirosina del peptide bersaglio.

β-sheet centrale: core idrofobico di circa 5-6 foglietti β antiparalleli, che

o formano una tasca per accogliere il residuo di fosfotirosina.

α-elica C-terminale: coinvolta nel riconoscimento del legame con altre

o regioni del peptide bersaglio e nel posizionamento del dominio SH2 sulla

proteina da riconoscere.

Nonostante la peculiarità strutturale per il riconoscimento di amminoacidi

specifici, comunque, si è scoperta la presenza di domini SH2 anche in proteine

funzionalmente non correlate alle tirosina-chinasi, come la fosfatidil inositolo 3-

OH chinasi, la fosfolipasi Cγ1, le proteine Ras-GAP e anche in alcune proteine

tirosina-fosfatasi (Waksman G. 1992). 8

Figura 1.5: Disegno schematico del dominio SH2 di Src. Le frecce indicano

foglietti-β e i rettangoli le α-eliche.

1.3.2 Src Homology domain 3

Come i domini SH2, anche i domini SH3 sono coinvolti nei meccanismi di

mediazione della segnalazione cellulare, e anche loro derivano il nome

dall’omologia, nelle regioni N-terminali, con la proteina Src.

Essi sono strutturalmente e funzionalmente distinti dai domini SH2, in quanto

costituiti da circa 60 residui, che formano una struttura caratteristica a barile-β,

comprendente 5 foglietti β antiparalleli disposti come le “doghe” di un barile; le

estremità, invece, si estendono a formare una tasca idrofobica ( ,

Figura 1.6

(Musacchio A. 1992)). 9

La tasca è circondata da loop che riconoscono e legano specificamente il motivo

“PxxP” nei peptidi bersaglio, dove “P” è un residuo di prolina e “x” è un

amminoacido qualsiasi.

Considerando che circa il 25% delle proteine umane ospita regioni ricche di

prolina, è incredibile come le centinaia di domini SH3 codificate dal genoma

umano selezionino specificamente i loro partner fisiologici (Kaneko T. 2008). A

questo dilemma, inoltre, si aggiunge la scoperta che alcuni domini SH3 sono in

grado di legare non solo i motivi PxxP, ma anche variazioni di tale sequenza

consenso e di instaurare persino interazioni fra le strutture terziarie (Li 2005).

Proprio per la capacità di contattare numerosi motivi proteici, quindi, le

funzionalità dei domini SH3 risultano essere numerose, ma evidenziano il loro

coinvolgimento principale nello stabilire interazioni proteina-proteina,

fondamentali per la formazione di complessi proteici, e nel coordinamento di

processi cellulari come la segnalazione, l’adesione e la motilità cellulare

(Musacchio A. 1992).

Figura 1.6: Rappresentazione schematica di un

dominio SH3. Le frecce indicano i foglietti-β e il

cilindro l’α-elica. 10

1.3.3 I domini SH2 e SH3 nella regolazione cellulare

Alcune proteine di segnalazione sono composte quasi interamente da domini

SH2 e SH3, come accade nella proteina Crk, e funzionano da adattatori,

permettendo il collegamento fra i residui di fosfotirosina sugli RTK e proteine

che non hanno domini SH2 propri.

La segnalazione da recettori RTK attivati, pertanto, può muoversi in avanti

proprio grazie alla mediazione di domini come gli SH2 e SH3, che trasmettono<