C3G nella regolazione cellulare: un possibile target terapeutico per Glioblastoma

L’acquisizione della capacità invasiva delle cellule di GBM è talmente rilevante

che si è scoperto un vero e proprio processo di transizione da un fenotipo

epiteliale, con perdita della polarità cellulare e cambiamenti nell’espressione

genica, a un fenotipo mesenchimale, dall’aumentata motilità e resistenza

all’apoptosi (Kalluri 2009, S. G.-U. Manzano 2021). Ciò spiega la difficoltà nel

trovare trattamenti efficaci per questo tipo di tumore, che raramente genera

metastasi extra-neuronali, ma ha una grande capacità di infettare le aree

circostanti, generando focolai secondari distanti dalla zona di origine (Manzano,

et al. 2021). 32

Figura 3.4: Meccanismi coinvolti nella migrazione e nell’invasione del GBM.

3.2.2 Ruoli di C3G nel glioblastoma

È noto che la proteina C3G sia associata a varie forme tumorali, in cui assume

un comportamento dipendente dal contesto cellulare, dal tipo e dallo stadio del

tumore. Essa può, ad esempio, agire sia come oncosoppressore che come

oncogene, in base a se si trovi sovra o sottoregolata, ma può anche avere un ruolo

duplice, come accade nel carcinoma colon rettale (Manzano, et al. 2021).

Nel glioblastoma, C3G risulta significativamente sottoespresso ( , (S. G.-

Figura 3.5

U. Manzano 2021)), e si sono evidenziate delle connessioni fra la sua attività,

non solo nell’ambito della trasduzione del segnale, e l’avanzamento del tumore.

In primis, le proteine Crk, con cui C3G forma un complesso, si sono rivelate

overespresse nel GBM (Park T. 2001); si è visto, poi, che, in cellule U87 di

33

cas

glioblastoma umano, CrkI favorisce l’aumento della fosforilazione di p130 e

C3G, e sembra, quindi, promuovere la migrazione cellulare attraverso

cas

l’attivazione della via FAK/p130 /CrkI/DOCK180 (Takahisa Takino 2003).

Si sono, inoltre, presi in considerazione esperimenti che usavano due modelli di

linee cellulari di glioblastoma umano, le U87shC3G, disponibili a livello

commerciale, e le 12Ф12D, che presentavano un fenotipo stem-like (S. G.-U.

Manzano 2021). In entrambi i tipi, C3G era stato silenziato, e si sono riscontrate

un’aumentata invasività e una maggiore migrazione in risposta alla

downregolazione di C3G, con la conseguente diminuzione dell’adesione

cellulare ( , (S. G.-U. Manzano 2021)). Si è, anche, confermata la

Figura 3.6

transizione dal fenotipo epiteliale a quello mesenchimale, per l’aumento

dell’espressione della Vimentina (un marker mesenchimale) e la riduzione della

sintesi di E-caderina (un marker epiteliale, con cui C3G interagisce), oltre alla

sovrespressione degli mRNA di fattori di trascrizione associati alla transizione,

come TWIST1 e ZEB2 (S. G.-U. Manzano 2021).

Ancora, l’effettore principale di C3G, Rap1, mostra livelli di attività maggiori

nel GBM rispetto a tessuti cerebrali sani, e ha dimostrato di avere un ruolo nel

promuovere la proliferazione del tumore in risposta all’attivazione da parte di

RhoA, che permette di innescare la segnalazione dell’integrina (Manzano, et al.

2021). 34

Infine, poiché C3G risponde alla segnalazione di recettori RTK come quelli dei

fattori di crescita, si è scoperto che il silenziamento del C3G riduceva la

fosforilazione di recettori come l’EGFR, e con essa l’invasività indotta dal

recettore, e che diminuivano anche i livelli di fosforilazione di p38MAPK, ERKs

e Akt, coinvolti nella cascata delle MAPK. Al contrario, risultavano over-

fosforilati molti altri recettori, tra cui FGFR1 e erbB2, associati alla migrazione

cellulare e all’invasione ( , (S. G.-U. Manzano 2021)). Studi futuri

Figura 3.7

consentirebbero, quindi, di caratterizzare ulteriormente la funzione di C3G nella

regolazione degli RTK.

Figura 3.5: C3G risulta significativamente

sottoespresso nel GBM rispetto al tessuto cerebrale

sano.

Figura 3.6: Il silenziamento di C3G risulta in una maggiore capacità invasiva. (A) Saggio di invasione

di cellule U87; (B) Saggio di invasione di cellule 12Ф12D. 35

Figura 3.7: Alcune funzioni di C3G nel glioblastoma (GBM). I livelli di C3G sono

elevati nel cervello sano e diminuiscono col progredire del glioblastoma. La

sottoespressione di C3G aumenta la migrazione e l’invasione delle cellule di GBM

attraverso meccanismi dipendenti dall’iperattivazione di RTK come FGFR1 e la

sottoregolazione di altri recettori come EGFR. 36

CONCLUSIONI - Implicazioni Cliniche e Prospettive Terapeutiche

Come descritto in questa tesi, dunque, la proteina C3G è implicata in una

complessa rete di ruoli funzionali e agisce con meccanismi dipendenti e non dalla

sua attività di GEF.

Proprio per il suo coinvolgimento in molti processi cellulari, dal

differenziamento tissutale e la proliferazione, all’apoptosi e al rimodellamento

del citoscheletro, la sua disregolazione può portare alla promozione di tumori

come il glioblastoma. In questo ambito, C3G ha un’attività dipendente dal

contesto cellulare e dal tipo di tumore, il che rende complicato sviluppare

strategie terapeutiche mirate, considerando anche che la proteina è espressa

ubiquitariamente.

Per questi motivi, quindi, C3G non è stata ancora oggetto di trial clinici che la

potessero identificare come target terapeutico, nonostante essa possa

rappresentare un nuovo biomarcatore per la diagnosi e la prognosi del GBM, ad

esempio tramite la quantificazione, con la tecnica della biopsia liquida, dei livelli

proteici nel microambiente tumorale (Manzano, et al. 2021). Questo

permetterebbe di identificare lo stadio del tumore, poiché l’espressione di C3G

sembra diminuire all’aumentare della malignità del GBM (S. G.-U. Manzano

2021). 37

Si potrebbero, teoricamente, anche sviluppare trattamenti personalizzati per

pazienti che non rispondono alle terapie contro i bersagli di C3G, che, come

illustrato, sono ampiamenti coinvolti nel GBM.

Studi ulteriori, infine, potranno determinare come i livelli di C3G influenzino la

risposta agli agenti chemioterapici attualmente in uso, e una migliore

caratterizzazione della proteina, e delle interazioni che essa instaura con i suoi

effettori, potrebbe permettere, anche, di identificare, fra i suoi interattori, nuovi

bersagli terapeutici (Manzano, et al. 2021). 38

Bibliografia

Angela Armento, Jakob Ehlers, Sonja Schötterl, and Ulrike Naumann. “Molecular Mechanisms of

Glioma Cell Motility.” In Glioblastoma. Brisbane (AU): De Vleeschouwer S, 2017.

Arold S., et al. “The Role of the Src Homology 3-Src Homology 2 Interface in the Regulation of Src

Kinases.” Journal of Biological Chemistry 276 (February 2001): 17199-17205.

Bell ES, Park M. “Models of crk adaptor proteins in cancer.” Genes Cancer, 2012.

Boriack-Sjodin P., et al. “The structural basis of the activation of Ras by Sos.” Nature 394 (July

1998): 337–343.

Bos J.L., et al. “Linking Rap1 to cell adhesion.” Curr. Opin. Cell Biol. 17 (April 2005): 123-128.

Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, David Morgan, Martin Raff, Keith Roberts, Peter

Walter. Biologia molecolare della cellula. 5. Translated by Ghiotto, Quarto Conte. Bologna:

Zanichelli, 2009.

Carabias, A., Gómez-Hernández, M., de Cima, S., Rodríguez-Blázquez, A., Morán-Vaquero, A.,

González-Sáenz, P., Guerrero, C., & de Pereda, J. M. “Mechanisms of autoregulation of

C3G, activator of the GTPase Rap1, and its catalytic deregulation in lylymphomas.” Science

signaling 13 (2020).

Chiang S.H., et al. “Insulin-stimulated GLUT4 translocation requires the CAP-dependent activation

of TC10.” Nature 410 (April 2001): 944–948.

Feller, S. “Crk family adaptors–signalling complex formation and biological roles.” Oncogene,

October 2001: 6348–6371.

Giese, A., Loo, M. A., Tran, N., Haskett, D., Coons, S. W., & Berens, M. E. “Dichotomy of

astrocytoma migration and proliferation.” International journal of cancer 67 (1996): 275–

282.

Gotoh T., et al. “Identification of Rap1 as a target for the Crk SH3 domain-binding guanine

nucleotide-releasing factor C3G.” Molecular Cell Biology 15 (September 1995): 6746-6753.

Han, S., Liu, Y., Cai, S.J. et al. “IDH mutation in glioma: molecular mechanisms and potential

therapeutic targets.” Br J Cancer 122 (2020): 1580–1589.

Hogan C., et al. “Rap1 regulates the formation of E-cadherin-based cell-cell contacts.” Molecular

and Cellular Biology 24 (August 2004): 6690–6700.

Ichiba T., et al. “Activation of C3G guanine nucleotide exchange factor for Rap1 by phosphorylation

of tyrosine 504.” The Journal of biological chemistry 247 (May 1999): 14376-14381.

Ichiba T., et al. “Enhancement of guanine-nucleotide exchange activity of C3G for Rap1 by the

expression of Crk, CrkL, and Grb2.” The Journal of biological chemistry 272 (August 1997):

22215–22220.

Ichiba T., et al. “Enhancement of Guanine-Nucleotide Exchange Activity of C3G for Rap1 by the

Expression of Crk, CrkL, and Grb2.” Cell Biology and Metabolism 272 (August 1997):

22215-22220.

Jovčevska, I. “Genetic secrets of long-term glioblastoma survivors.” Bosnian journal of basic

medical sciences 19 (2019): 116–124. 39

Kalluri, R., & Weinberg, R. A. “The basics of epithelial-mesenchymal transition.” The Journal of

clinical investigation 119 (2009): 1420–1428.

Kaneko T., et al. “The SH3 domain- a family of versatile peptide- and protein-recognition module.”

Frontiers in Bioscience-Landmark (Landmark) 13 (May 2008): 4938–4952.

Lemmon, M.A., and J. Schlessinger. “Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases.” Cell 141 (June

2010): 1117-1134.

Li W., et al. “Nck/Dock: an adapter between cell surface receptors and the actin cytoskeleton.”

Oncogene 20 (October 2001): 6403–6417.

Li, S. “Specificity and versatility of SH3 and other proline-recognition domains: structural basis and

implications for cellular signal transduction.” Biochem J 390 (September 2005): 641-653.

Louis, D.N., Perry, A., Reifenberger, G. et al. “The 2016 World Health Organization Classification of

Tumors of the Central Nervous System: a summary.” Acta Neuropathol 131 (2016): 803–

820.

Maia, V., Ortiz-Rivero, S., Sanz, M. et al. “C3G forms complexes with Bcr-Abl and p38α MAPK at

the focal adhesions in chronic myeloid leukemia cells: implication in the regulation of

leukemic cell adhesion.” Cell Common Signal 9 (2013).

Manzano, S., A. Gutierrez-Uzquiza, P. Bragado, A.M. Cuesta, C. Guerrero, and A Porras. “C3G

Protein, a New Player in Glioblastoma.” Int. J. Mol. Sci. 22 (2021): 10018.

Manzano, S., Gutierrez-Uzquiza, A., Bragado, P. et al. “C3G downregulat