Riassunto esame Biologia Molecolare, Prof. Bozzoni Irene, libro consigliato Il Gene VIII, Zanichelli

II DIVISIONE MEIOTICA

Durante la meiosi II, i cromosomi si condensano e si attaccano ad un nuovo fuso (profase II). In seguito,

raggiungono la posizione sulla piastra equatoriale della cellula (metafase II) ed i loro centromeri si dividono

per consentire ai cromatidi fratelli di migrare verso i poli opposti (anafase II) fenomeno definito

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disgiunzione cromatidica. Durante la telofase II, i cromatidi separati, definiti ora cromosomi, raggiungono i

poli ed intorno ad essi si formano i nuclei. Quindi ciascun nucleo figlio contiene un corredo aploide di

cromosomi. La meiosi II è quindi molto simile alla mitosi, tuttavia le cellule figlie nella meiosi sono aploidi

e il corredo cromosomico non è geneticamente identico a quello della cellula madre.

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41. Il nucleosoma

La maggior parte del DNA nelle cellule eucariotiche è impacchettato nei nucleosomi. Il nucleosoma è

composto di un core di otto proteine istoniche ed il DNA è avvolto attorno ad esse. Il DNA fra ciascun

nucleosoma (il filo fra le perle della collana) è chiamato DNA linker. Mediante assemblaggio in nucleosomi,

il DNA viene compattato approssimativamente 6 volte. Ciò è ben lontano dalle 1000-10000 volte (in termini

di compattazione) che deve raggiungere il DNA nelle cellule eucariotiche. Ciononostante, questo primo

stadio è essenziale per tutti i successivi livelli strutturali necessari per compattare adeguatamente il DNA.

Comunque, il DNA più intimamente legato al nucleosoma, il DNA core, è avvolto approssimativamente

1,65 volte attorno all'ottamero istonico (quasi due giri d'elica) in maniera sinistrorsa. Essendo sinistrorso

l'avvolgimento è toroidale quindi corrisponde a giri di superelica negativa. Comunque, il DNA del core ha

una lunghezza di circa 147 paia di basi ed è una quantità invariabile di tutte le cellule eucariotiche. Invece, la

lunghezza del DNA linker esistente fra i nucleosomi è variabile. Tipicamente questa distanza è di 20-60 paia

di basi. L'organizzazione in unità nucleosomali è stata evidenziata mediante dei saggi di digestione con

endonucleasi (nucleasi micrococcica). Questo enzima digerisce il DNA tagliando preferenzialmente il DNA

linker. In questo modo si ottengono si ottengono i singoli nucleosomi. Con una digestione parziale, invece,

potremmo ottenere non solo il monomero di nucleosoma ma anche i dimeri e i trimeri. A questo punto,

quest'ultimi potranno essere separati su un gradiente di saccarosio ed identificare le varie parti che gli

compongono. Se andiamo sempre più avanti con la digestione otterremo, infine, frammenti sempre più

piccoli arrivando ad identificare il singolo monomero di DNA con 147 bp. Inoltre, in tutte le cellule esistono

zone del DNA che non sono organizzate in nucleosomi (eucromatina). Di norma queste sono regioni di

DNA impegnate nell'espressione genica, nella replicazione o nella ricombinazione.

Gli istoni sono di gran lunga le proteine più abbondanti associate con il DNA eucariotico. Le celle

eucariotiche contengono cinque tipi di istoni: H1, H2A, H2B, H3 e H4. Gli istoni H2A, H2B, H3 e H4 sono

gli istoni del core e formano il complesso proteico (core) attorno a cui il DNA si avvolge. L'istone H1,

invece, non fa parte del core nucleosomico, ma lega il DNA linker che unisce due nucleosomi adiacenti ed è

indicato come l'istone linker. In accordo con il fatto di essere strettamente associati ad una molecola di DNA

che è carica negativamente, gli istoni contengono un gran numero di amminoacidi carichi positivamente. Più

del 20% dei residui amminoacidici contenuti negli istoni sono di lisina o arginina. Comunque, gli istoni sono

formati da una regione conservata che viene chiamata dominio histone-fold. Quest'ultimo è formato da tre

regioni elica separati da due tratti curvi non strutturati. In ogni caso l'histone-fold media la formazione

testa-coda di specifiche coppie eterodimiche. Gli istoni H3 e H4 formano degli eterodimeri che poi si

associano dando origine ad un tetramero in cui sono presenti due H3 e due H4. H2A e H2B invece formano

eterodimeri che però non tetramerizzano. L'assemblaggio di un nucleosoma prevede l'associazione ordinata

di questi complessi proteici con il DNA. Prima il tetramero H3-H4 lega il DNA, successivamente due dimeri

H2A-H2B si uniscono al tetramero per formare il nucleosoma completo.

Ciascun istone del core possiede un estensione N-terminale chiamata “coda”. Essa manca di una struttura

definita e sporge all'esterno del nucleosoma rendendosi accessibile. Tale accessibilità può essere verificata

mediante trattamento del nucleosoma con la proteasi tripsina che digerisce queste estensioni mentre non

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digerisce la regione altamente impacchettata degli histone-fold. Comunque, le code N-terminali esposte non

sono richieste per l'associazione del DNA con l'ottamero istonico, infatti il DNA rimane saldamente

associato al nucleosoma anche dopo trattamento con proteasi. Invece, le code sono sito di consistenti

modificazioni che sono in grado di cambiare la funzione del singolo nucleosoma. Queste modificazioni

includono la fosforilazione, l'acetilazione e la metilazione dei residui si serina e lisina. Inoltre, sebbene non

perfettamente simmetrico, il nucleosoma ha due assi di simmetria che vengono chiamati diadi. In questa

organizzazione, il tetramero H3-H4 e i dimeri H2A-H2B interagiscono con una particolare regione del

DNA. Delle 147 bp di DNA nucleosomico, le regioni dell'histone-fold del tetramero H3-H4 interagiscono

con le 60 paia di basi centrali. La regione N-terminale di H3, più vicina all'histone-fold, forma una quarta -

elica che interagisce con le ultime 13 paia di basi di ciascun terminale del DNA. Da sottolineare, anche, che

il tetramero H3-H4 occupa una posizione chiave nel nucleosoma legando la parte centrale ad entrambe le

estremità del DNA. Invece, ciascuno dei due dimeri H2A-H2B lega circa 30 bp da entrambe le parti delle 60

centrali legate da H3 e H4. Ad una più attenta osservazione ci si rende conto che le basi strutturale e la

particolare curvatura nel nucleosoma, sono dovuti principalmente a quattordici distinti siti di contatto, uno

per ciascuna volta che il solco minore del DNA fronteggia l'ottamero istonico. L'associazione del DNA con

il nucleosoma è mediata da un grande numero di legami idrogeno. La maggior parte di questi legami si

instaura fra le proteine e gli atomi di ossigeno dei legami fosfodiesterici, vicino al solco minore del DNA.

Inoltre, la struttura del nucleosoma risolta a livello anatomico ha fornito informazioni anche riguardo le

code N-terminali degli istoni. Le quattro code degli istoni H2B e H3 emergono fra e dalle due eliche. La loro

via d'uscita è formata dai due solchi minori adiacenti, che creano uno spazio fra le due eliche del DNA

giusto sufficiente per far passare la catena polipeptidica. In modo analogo emergono dall'altra parte le code

di H2B e H3.

Un ulteriore caratteristica relativa alla formazione dei nucleosomi è la distorsione che subisce il DNA in

queste particolari strutture che è di circa 4,53° per ogni dinucleotide. Per studiare questa caratteristica e

quindi il DNA attorno all'ottamero istonico si è utilizzata la tecnica del footprinting con DNasi I. Questo

enzima taglia il DNA in maniera differente, in quanto, se è nudo la digestione procede normalmente, invece,

in presenza di proteine legate al DNA, questo enzima lo digerisce difficilmente. Si è visto, comunque, che se

digeriamo i nucleosomi, la DNasi I riesce a tagliare i solchi minori esposti verso il solvente, in modo tale da

poter studiare la periodicità del DNA sul cromosoma. Il profilo che si ottiene sono bande che distano 10,2

bp ( invece delle 10,5 bp di Watson e Crick). Per definire le regioni del nucleosoma, invece, si parla di

posizionamento traslazionale per indicare i confini del nucleosoma mentre di posizionamento rotazionale

per indicare le basi a contatto con il DNA e quelle esposte al solvente. Il primo parametro ci indica quindi

quali sono le parti a contatto con l'istone e quelle invece che non lo sono (DNA linker), quindi questo sta ad

indicare anche l'accessibilità che hanno le proteine. Il posizionamento rotazionale, invece, ci fa capire quale

faccia del DNA è esposta, ossia quali coppie di basi si trovano all'esterno verso il solvente. Comunque, tutta

questa organizzazione è importante per capire che il DNA più accessibile alle proteine è quello non

vincolato agli istoni ed esposto al solvente. Il tassello mancante a questo punto era relativo alla disposizione

delle coppie di basi sul DNA. Un esperimento effettuato da Satchwell, Drew e Travers sugli eritrociti di

pollo, che sono nucleati, a permesso di definire questa caratteristica. In laboratorio i nuclei vennero trattati

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con MNasi per ottenere singoli nucleosomi di 147 bp. Questo DNA successivamente venne clonato

all'interno di plasmidi e sequenziato. Grazie all'utilizzo di 177 diverse sequenze, si è visto che vi era una

sequenza non casuale. L'andamento delle coppie di basi risulta essere sinusoidale, le coppie di basi AT si

trovano a contatto con gli istoni mentre GC all'esterno, esposte al solvente. Quindi il punto in cui il DNA

agisce con gli istoni è ricco in AT mentre nella parte esterna in GC. Altre caratteristiche trovate sono che

alcune sequenze tendono ad essere escluse dai nucleosomi, come cinque adenine consecutive, che vanno

quindi a formare il DNA linker. Quindi, in generale, possiamo dire che l'ottamero degli istoni riconosce

caratteristiche conformazionali del DNA, ovvero la capacità di una data sequenza di DNA di distorcersi

attorno all'ottamero a formare 1,65 giri di superelica. Questa proprietà del DNA, che possiamo chiamare

flessibilità, è dipendente dalla sequenza in quanto le coppie di basi nelle loro interazioni non sono

perfettamente planari ma formano spesso degli angoli, energicamente più favoriti (curvandosi).

Nel 1995, Polach e Windom ipotizzarono che il nucleosoma fosse una struttura dinamica, in cui il DNA si

svolge e si riavvolge consentendo alle proteine di riconoscere il proprio sito di legame, Questa ipotesi venne

saggiata mediante digestione con enzimi di restrizione. Questi scienziati, quindi, si resero conto che il DNA

si apre e si richiude permettendo il legame degli enzimi (nucleosome breathing: respirazione nucleosomale).

Questo meccanismo è stato definitivamente approvato con un altro esperimento, applicando una tecnica

detta FRET (trasferimento di energia di risonanza tramite fluorescenza) e con l'utilizzo di due molecole

fluorescenti