Biologia molecolare

LA REPLICAZIONE DEL DNA

La prima ipotesi sul meccanismo di replicazione del DNA fu proposta da Watson e Crick

insieme al modello della struttura del DNA. Questa ipotesi di “autoduplicazione” si basava

sul concetto di complementarietà tra le basi dei due filamenti.

Aprendosi a cerniera ciascun filamento sarebbe servito da stampo per l’altro, generando

alla fine due molecole di DNA separate. Si è visto in seguito che il meccanismo di

duplicazione è più complesso di quanto pensassero i due scienziati.

Carattere semiconservativo della replicazione

Il modello di Watson e Crick conteneva delle previsioni che si sono poi rivelate corrette. In

effetti, la doppia elica viene aperta durante la replicazione e ogni nuova molecola di DNA

è realmente formata da un filamento di origine parentale e da un filamento di nuova

sintesi.

Questo tipo di replicazione è detta replicazione semiconservativa, in quanto ogni nuova

molecola di DNA contiene solo metà della struttura parentale originaria.

Originariamente vennero proposti altri due modelli di replicazione:

• Replicazione conservativa, in cui il dal DNA parentale si otteneva una molecola

formata da soli filamenti nuovi;

• Replicazione dispersiva: in cui l’integrità di ciascun filamento parentale è persa,

in quanto sono mischiati segmenti di origine parentale e neo-sintetizzati.

Questi modelli di replicazione vennero in seguito confutati dall’esperimento di

Meselson-Stahl, due scienziati del California Institute of Technology.

Figura 2 I tre modelli di replicazione PAGE 4

Replicazione nelle cellule batteriche

Forcella di replicazione e replicazione bidirezionale

Secondo il modello semiconservativo, la separazione dei filamenti della doppia elica è

accompagnata dalla sintesi di filamenti complementari di DNA.

I punti in cui prende luogo la replicazione sono detti forcelle di replicazione. Ogni forcella

corrisponde al punto in cui:

• Avviene la divisione dell’elica parentale

• Avviene l’aggiunta dei nucleotidi ai filamenti complementari

La replicazione inizia in un punto specifico del cromosoma batterico detto origine di

replicazione. Nel genoma di E. Coli l’origine consiste in una sequenza di circa 245 bp, detta

OriC, a cui si legano numerose proteine che danno inizio alla replicazione.

La replicazione è bidirezionale, cioè procede in entrambe le direzioni. Le due forcelle si

aprono in senso opposto fino a ricongiungersi in un punto opposto all’origine nel

cromosoma circolare del batterio. Le due doppie eliche, quindi, si staccano e sono

distribuite a due cellule diverse.

Le proprietà della DNA polimerasi

Gli enzimi responsabili della sintesi dei nuovi filamenti sono detti DNA polimerasi. Questi

catalizzano l’aggiunta di deossiribonucleotidi trifosfati complementari al filamento

stampo esclusivamente in direzione 5’ -> 3’.

La DNA polimerasi però non può sintetizzare il nuovo filamento ex novo, ma ha bisogno di

un’estremità 3’ libera. Questa è fornita da un primer a RNA, sintetizzato da un enzima

chiamato primasi, un particolare tipo di RNA polimerasi.

Replicazione semidiscontinua

È lecito chiedersi, dal momento che la

polimerasi sintetizza DNA solo in

direzione 5’ -> 3’, come avviene la sintesi

del DNA sul filamento opposto? Esiste

una polimerasi in grado di sintetizzare il

DNA in direzione 3’ -> 5’?

In realtà nessuna polimerasi riesce a

sintetizzare in direzione 3’ -> 5’ e la

replicazione avviene in entrami i

filamenti in direzione 5’ -> 3’. Tuttavia,

la sintesi del nuovo DNA non avviene Figura 3 La forcella di replicazione

allo stesso modo in entrambi i casi. PAGE 5

Un filamento che sintetizza il DNA nello stesso senso in cui si apre la forcella può lavorare

in modo continuo, ed è chiamato filamento guida (o leading strand). Nell’altro filamento,

dove l’apertura dell’elica avviene in senso opposto all’attività della polimerasi, la sintesi

richiede la sintesi continua di primer. Pertanto, questo filamento è duplicato in modo

discontinuo ed è chiamato filamento ritardo (o lagging strand).

I brevi frammenti che vengono sintetizzati sul lagging strand sono chiamati frammenti di

Okazaki. Questi sono poi legati insieme dalla DNA ligasi. I segmenti di RNA primer che si

trovano sia sul leading strand che sul lagging strand sono poi rimossi e sostituiti da sequenze

di DNA.

Per questo motivo la replicazione del DNA viene detta discontinua.

La forcella replicativa

A livello della forcella replicativa la replicazione non si riduce all’incorporazione di

nucleotidi.

Innanzitutto, l’apertura della doppia elica è effettuata dalla elicasi, un enzima che come

una “zip” è in grado di rompere i ponti a idrogeno tra le coppie di basi. I singoli filamenti

separati sono mantenuti distesi dalle single strand binding proteins (SSB); se così non

fosse tenderebbero a ripiegarsi “a forcina”, formando dei legami interni.

L’apertura della doppia elica provoca però il cosiddetto supercoiling, letteralmente

l’avvolgimento della molecola su sé stessa a valle della forcella. Questo fenomeno è dovuto

al fatto che il DNA non è libero di ruotare intorno al proprio asse. Questo problema è risolto

dalle topoisomerasi, degli enzimi in grado di ridurre la tensione del DNA. Esistono due

classi di topoisomerasi, entrambe aventi lo stesso ruolo ma con un diverso meccanismo

d’azione:

• Topoisomerasi I: taglia un filamento, permettendo al DNA di ruotare su se stesso

• Topoisomerasi II: taglia una doppia elica e fa passare attraverso il varco il resto

della molecola

Nei batteri l’elicasi e la primasi sono strettamente associate, formando il primosoma.

Mentre l’elicasi svolge il DNA duplex la primasi sintetizza a intervalli regolari gli RNA

primer, che verranno poi allungati dalla DNA polimerasi.

Pur muovendosi in direzioni opposte, le polimerasi di entrambi i filamenti lavorano come

parte di uno stesso complesso replicativo chiamato replisoma, senza violare la “regola”

della direzione 5’ -> 3’. In questo complesso il lagging strand si ripiega ad occhiello su sé

stesso e assume lo stesso orientamento del leading strand. Una volta raggiunta la fine del

filamento ritardo, la polimerasi abbandona il filamento e inizia a lavorare sul primer

successivo. PAGE 6

Inizio e termine della replicazione

L’inizio della replicazione è un processo altamente controllato dalla cellula in quanto, una

volta avviato, il processo di replicazione procede incontrastato.

Il primo step consiste nel legame di una proteina di inizio ad una sequenza ripetitiva

presente nel sito OriC. Questa sequenza è ricca di legami A-T, in quanto questi sono meno

forti dei legami C-G e quindi più facili da rompere. Il legame della proteina di inizio al DNA

induce l’apertura del DNA. Segue il reclutamento nella regione delle elicasi, delle SSB e delle

altre componenti della forcella di replicazione.

Le due forcelle si incontrano in una regione del cromosoma chiamata TER, dove la

replicazione ha termine, le forcelle si smantellano e i due cromosomi figli si separano.

Quest’ultimo processo è mediato da una particolare topoisomerasi, la topoisomerasi IIα.

Struttura e funzione della DNA polimerasi

I batteri possiedo tre tipi di DNA polimerasi: pol I; pol II; pol III. Ciascuno di questi enzimi

possiede la stessa attività catalitica: aggiungere deossiribonucleosidi trifosfati all’estremità

3’ di un RNA primer. Tuttavia, ricoprono ruoli diversi all’interno della cellula.

In E. Coli la polimerasi principale della

replicazione è la pol III, spesso chiamata

anche replicasi. Questo oloenzima è molto

più grande delle altre due polimerasi e

comprende almeno 9 subunità, ognuna con

un ruolo nel processo replicativo. Una delle

,

subunità, la subunità mantiene la

polimerasi agganciata al DNA stampo. In

particolare, due subunità si uniscono

formando una pinza scorrevole (sliding

clamp) che permette all’enzima di spostarsi Figura 4 La DNA polimerasi II

da nucleotide a nucleotide senza

abbandonare lo stampo.

Per quanto riguarda la pol II non è ancora chiaro quale funzione svolga, e cellule mutanti

prive di questo enzima non presentano difetti apparenti.

La pol I, invece, partecipa al processo di riparazione del DNA ed è il principale enzima

che rimuove gli RNA primer dei frammenti di Okazaki.

Attività esonucleasiche delle DNA polimerasi

Tutte le polimerasi batteriche sono anche in grado di degradare un polimero di acido

nucleico. Esistono nucleasi in grado di agire in senso o 5’ -> 3’ o 3’ -> 5’. La pol I, invece, è

in grado di compiere la propria attività esonucleasica in entrambe le direzioni. PAGE 7

Mentre la maggior parte delle nucleasi degradano solo un tipo di acido nucleico, la nucleasi

5’ -> 3’ della pol I può agire sia su DNA che su RNA. Ciò torna molto utile nella rimozione

dei primer dei frammenti di Okazaki, che una volta rimossi sono sostituiti dallo stesso

enzima.

Alta fedeltà della replicazione del DNA

Per la sopravvivenza di un organismo, e soprattutto delle generazioni cellulari successive,

l’accurata replicazione del proprio genoma è essenziale.

Il primo livello di controllo avviene a livello dell’appaiamento complementare delle basi.

Le polimerasi contengono siti specifici per ciascuno dei quattro nucleotidi, e il legame tra il

filamento stampo e il nucleotide risulta più semplice da formare quando le basi sono ben

appaiate.

Le polimerasi sono in grado di effettuare un controllo delle bozze (proofreading) man

mano che sintetizzano il nuovo filamento. Un nucleotide male appaiato è riconosciuto

immediatamente dalla polimerasi, che procede allora a rimuoverlo mediante attività

esonucleasica 3’ -> 5’ per poi continuare la sintesi.

I batteri possiedono inoltre un sistema di riparazione dell’appaiamento scorretto, che

entra in azione a replicazione terminata.

E. Coli è in grado di replicare il proprio genoma in circa 40 minuti. Tuttavia, dal momento

che una nuova replicazione può iniziare anche prima che la precedente si sia conclusa,

alla massima velocità questi batteri raddoppiano di numero ogni 20 minuti.

La replicazione nelle cellule eucariotiche

Negli eucarioti la replicazione si svolge con le stesse modalità che nei procarioti. A variare

sono le dimensioni del genoma e le proteine coinvolte (non cambiano, però, le classi).

Sono state identificate cinque polimerasi eucari