Biologia molecolare

SPLICING ALTERNATIVO

giovedì 11 aprile 2019 11:27

Non tutte le giunzioni vengono riconosciute con la stessa efficienza-> non tutti gli esoni di un gene si possono ritrovare

necessariamente nei trascritti maturi-> splicing alternativo, molto rilevante negli eucarioti superiori-> consente di

ottenere più di una sequenza proteica a partire dallo stesso gene (grande varietà potenziale di MRNA). La variazione

degli esoni può riguardare sia esoni terminali differenti, esoni iniziali alternativi (splicing accoppiato a trascrizione perché

si hanno sequenze promotori differenti). I primi studi di sequenziamento del trascrittoma (anni 2000) hanno evidenziato

che la maggior parte del genoma è trascritto e che tra il 30%-60% dei geni danno origine a diversi trascritti-> risposta al

fatto che avendo poco più del doppio dei geni di Drosophila possiamo generare tanta variabilità. Quelli con maggiore

splicing alternativo sono il sistema nervoso e immunitario. A partire da un gene si ha un pre-mRNA da cui si ottengono

diverse varianti di MRNA.

È stato studiato da David Baltimore il quale aveva scoperto introni ed esoni-> scoprì questo splicing nelle

immunoglobuline: produce due isoforme della proteina che differiscono all'estremità C-terminale-> splicing alternativo

in IgM porta a formare: trascritto con esone 3 e 4 (anticorpo secreto), forma corta + trascritto con esone 4 tagliato

quindi non viene incluso e viene unito il tutto a esone 5 e 6 (anticorpo legato a membrana mediante la porzione C-

terminale). Es. Il gene Dscam di Drosophila codifica un recettore che guida l'assone nella crescita. Il gene presenta degli

esoni costitutivi (presenti in tutti i trascritti) e degli esoni alternativi (viene scelto uno degli alternativi per ognuno)-> si

crea variabilità degli esoni. Calcolando con il calcolo combinatorio tutte le possibili combinazioni otterremmo 40.000

isoforme diverse. Es. Gene slo codifica per un recettore delle frequenze sonore-> splicing cambia la capacità della cellula

di percepire i suoni. La coclea ha delle cellule che portano dei pili (estroflessioni della membrana cellulare) che

esprimono i recettori reagendo alle frequenze sonore-> cellule pilifere. Sono disposte sulla superficie in base a quali

frequenze sonore sentono-> gradiente: ad un'estremità le cellule rispondono ad una frequenza sonora alta 20.000 Hz,

all'altra bassa 20 Hz. Splicing alternativo dell'MRNA di slo (su tutto il gene almeno 8 siti di splicing alternativi-> più di 500

MRNA differenti) codifica un canale uditivo del K+ e Ca+ e in base a come sono, rispondono in modo diverso alle diverse

concentrazioni di Ca+ (isoforme con esone STREX alternativo hanno una delle cinetiche di deattivazione più lente e una

maggiore sensibilità a Ca+).

Diversi modi di splicing alternativo: alternativa selezione dei promotori + alternativa selezione di siti di poliadenilazione

ecc. Es. Tropomiosina ha diversi splicing con esoni diversi (geni espressi in modi diversi in vari tessuti): muscolo striati +

muscolo liscio + mioblasti + fibroblasti ecc. Sappiamo che gli esoni sono riconosciuti grazie alle stremità 3'-5' dell'introne.

Per la sua rimozione è importane anche il riconoscimento della sequenza ramo. Gli esoni terminali mancano di un sito di

splicing 3' o 5'-> il loro riconoscimento dipende da proteine (interazioni con complesso poliadenilazione e 5'cap). Gran

parte della regolazione avviene nelle fasi iniziali-> regolazione può essere positiva o negativa: fattori che stabilizzano o

destabilizzano legame di snRNP U1 e U2 (Formano appaiamenti di basi che definiscono la specificità splicing). I fattori di

regolazione sono di solito ubiquitari (pochi sono tessuto specifici poichè la loro concentrazione varia nei tessuti).

Nucleotidi hanno diverse frequenza: 5' ha nucleotide GU invariante 100% e altri variabili + 3' AG presente al 100% dei siti

e altri variabili-> sequenze che definiscono introni. Gli esoni alterativi sono fiancheggiati da siti di splicing subottimali,

deboli: si allontanano parecchio da quelli ottimali-> U1 e U2 si legano in modo subottimale-> se abbiamo fattori

stabilizzanti allora lo splicing è facilitato + la regolazione negativa avviene per competizione coi siti di legame di U1 e U2.

La regolazione suppone che le sequenze siano subottimali (non efficiente al 100%)-> concetto fondamentale perché se

fossero ottimali il range di regolazione è basso, è difficile da stabilizzare o destabilizzare. Sequenze che definiscono

introni possono essere simili a sequenze interne ad esoni-> non c'è solo quello che regola lo splicing ma anche altre

proteine che si legano-> enhancer (a cui si legano fattori di regolazione positiva) + silencer (a cui si legano fattori di

regolazione negativa). Le sequenze che permettono il riconoscimento dei siti di splicing sono: ISE (intronic splicing

enhancer) + ESE (exonic splicing enhancers) + ISS (intronic splicing silencer) + ESS (exonic splicing silencer)-> a queste

sequenze si legano fattori di regolazione. I fattori di splicing sono decine di proteine in parte trovate associate a

spliceosoma, alcune partecipano allo splicing core e altre sono specifiche per la regolazione. Sono la maggior parte

raggruppabile in due grandi famiglie:

• Contiene principalmente fattori di regolazione positiva-> riconoscono principalmente sequenze enhancer. Sono

altamente conservate nei metazoi. Sono stati i primi fattori di regolazione ad essere studiati. Si chiamano SR,

modulari, hanno:

○ Un dominio o più di legame al RNA: dominio RRM (RNA recognition protein). RNA è molecola molto plastica

con strutture molto variabili-> influenza sua attività di relazione con proteine. Due grossi motivi: RNP1

(ottapeptide) + RNP2 (meno conservato, ricco di residui aromatici e alifatici)-> interazione mediata da

struttura formata da 4 foglietti β. Gli aa aromatici delle catene laterali dei RNP forniscono interazioni. La

catena laterale può formare legami H con le basi.

○ Regione ricca di arginine e serine (RS). Funziona principalmente nelle interazioni proteina-proteina +

coinvolta nelle fasi iniziali dell'assemblaggio dello spliceosoma. Avvicina i siti 5' 3' facendo da ponti tra fattori

assemblati sui siti di splicing. Es. U2AF, eterodimero, ha subunità grande e piccola ciascuna con un dominio

RS (necessario per il riconoscimento del sito 3').

Nucleo colorato con anticorpo che va contro proteine famiglia SR-> si nota che tendono a concentrarsi in certi

punti. Trattati con antimicina D-> si ha inibizione polimerasi III-> non è più necessaria trascrizione-> SR aumentano

nel nucleo perché non servono più nel citoplasma. Dunque SR sono fattori regolati sia nella loro localizzazione sia

che nella fosforilazione (simile che per i fattori di trascrizione): quando devono essere reclutate sul trascritto

nascente le proteine vengono fosforilate

• Contiene principalmente fattori di regolazione negativa. hnRNP (particelle ribonucleoproteiche eterogenee

nucleari) sono una famiglia caratterizzata negli anni 70 quando si è iniziato a purificare RNA rendendosi conto che

è sempre associato a tantissime proteine (mai nuda)-> eterogeneo di dimensioni. Sono classificate con le lettere

dell'alfabeto. Legano RNA in modo sequenza-specifico, hanno ripetizione di RGG (Arg-Gly-Gly), mancano del

dominio SR (principale differenza con SR). Sono ubiquitarie ma la quantità di ciascun membro varia nei diversi

tessuti. Agiscono in modo antagonistico con le SR quindi riconoscono principalmente le sequenze silencer

Concentrazione rispettiva di regolatori positivi o negativi favorisce in un tessuto una maggiore espressione dell'esone o

meno.

Dunque nel modello attuale gli esoni vengono immediatamente legati da proteine di regolazione e gli introni da proteine

hnRNP. Nel caso del Cap esistono proteine specifiche che lo legano fino al citoplasma + nel caso di 3' terminale abbiamo

altre proteine specifiche che legano coda poliA. Quello che si immagina avvenga nella cellula è che ci sia una vera e

propria fabbrica di RNA, splicing, capping e processamento di 3' sembra essere coordinato dalla subunità grande della

RNA polimerasi III-> a quantità crescenti di CTD aumenta efficienza di splicing, poiché forma piattaforma che stimola

assemblaggio dei complessi.

Determinazione del sesso in Drosophila: caratteristiche determinate da pathway di regolazione che coinvolge vari step:

che inizia con regolazione trascrizionale-> propagato attraverso splicing alternativo-> mantenuto a livello trascrizionale.

Pathway di default viene seguito se non interviene la regolazione-> sviluppa mosche maschio. Pathway regolato

determina invece sesso femminile. Drosophila ha solo cromosomi X e ciò che termina se sarà maschio femmina sarà

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Determinazione del sesso in Drosophila: caratteristiche determinate da pathway di regolazione che coinvolge vari step:

che inizia con regolazione trascrizionale-> propagato attraverso splicing alternativo-> mantenuto a livello trascrizionale.

Pathway di default viene seguito se non interviene la regolazione-> sviluppa mosche maschio. Pathway regolato

determina invece sesso femminile. Drosophila ha solo cromosomi X e ciò che termina se sarà maschio femmina sarà

rapporto tra cromosomi sessuali X e autosomi. La determinazione del sesso coinvolge:

• Sxletal (proteina SR tra le poche che agisce come regolatore negativo). Viene trascritto in fasi differenziali della

vita dell'embrione -> il fatto che venga prodotto o meno dipende da una decisione trascrizionale che deriva da un

rapporto X/autotosmi-> se rapporto è 1 allora abbiamo trascrizione Sxletal che attiva cascata splicing che porta a

trascrivere geni che danno femmine + se rapporto è 0,5 Sxletal non viene prodotto (anche se gene è trascritto)

innescando il pathway di default che porta a maschio. Il gene si chiama letal perchè se inattivato da mutazioni

porta a morte femmine e si sviluppano solo maschi + se ha mutazione gain of function muoiono i maschi. Viene

trascritto da un promotore interno acceso solo nelle fasi iniziali dello sviluppo-> trascritto non soggetto a splicing

alternativo-> solo in femmina viene prodotto sxletal. Ha un ulteriore promotore più a monte trascritto in fasi

successive (late) dello sviluppo: porta a tratto di RNA pre messaggero aggiuntivo con due esoni: sito di inizio + sito

di terminazione della traduzione (esone 2). Quando c'è Sxl compete con U2AF (lega tratto pirimidinico inibendo

splicing esone 2)-> splicing alternativo che fa saltare stop codon-> MRNA nella femmina viene prodotta la proteina

funzionale-> feedback di regolazione positiva. Nel maschio Sxl non c'è e quindi l'esone 2 viene incluso (stop

codon)-> proteina tronca non funzionante. Sxl essenzialmente sceglie dove si a