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domina la TATA box che dice da che parte deve trascrivere. Se giro initiator ma non TATA vedo che la

direzione che alla fine viene scelta è quella della TATA ma la trascrizione avviene meno perché abbiamo

initiator che vorrebbe trascrizione dall’altra parte.

L’apparato trascrizionale che è in grado di completare la trascrizione (fare tutte le fasi), l’oloenzima è fatto

da una enorme quantità di proteine:

RNA polimerasi II

Ø Fattori generali di classe II per legare al promotore (TFIIA, TFIID, TFIIB, TFIIE, TFIIF, TFIIH anche se la

Ø trascrizione avviene anche senza TFIIA in vitro. Ricordarli tutti). Sono tanti perché la trascrizione deve

essere molto regolata.

Un complesso di coattivatori noto come mediatore.

Ø

È stato scoperto che l’oloenzima era fatto così isolando i diversi componenti e aggiungendone uno per volta

(lo ha fatto sempre Kornberg) e così ha capito l’ordine con cui interagivano. Dopo averli isolati ne ha aggiunto

uno alla volta e vedeva cosa succedeva. Modello a step della trascrizione: come ogni fattore generale della

trascrizione interviene aiutando il successivo. NB: in vivo non è davvero così, probabilmente c’è un intero

oloenzima che viaggia per cercare il suo promotore. In vitro:

1. Una proteina va a riconoscere il core promoter in maniera sequenza specifica. Se c’è la TATA allora

questa proteina è la TBP. Per dimostrare che TPB si lega

esattamente alla TATA box uso footprinting. Normalmente TBP

nella cellula non esiste da solo: sta in un complesso proteico

con altre proteine a dare il fattore generale della trascrizione

di glasse due D (TFIID). TFIID= TBP+11proteine che si chiamano

TAFs (fattori associati a TBP). Quindi in vivo non si lega TBP ma

i TAFs, ma in vitro posso dare TBP e si lega lui. TBP lavora su

tutti i promotori di classe II anche quelli che non hanno una

TATA e come vedremo su quelli di classe I e III. Quindi è un

fattore di trascrizione universale. TBP ‘ associato ai TAF che

estendono il legame di TFIID molto al di là della TATA box e

funzionano da coattivatori. Per dimostrare che TBP viaggia con

i TAF usando ritardo elettroforetico ad esempio.

2. Ora se do RNA polimerasi questa non si lega quindi non basata

TBP. Serve un altro fattore generale della trascrizione: TFIIB

che si lega al complesso TBP-DNA e stabilizzandolo.

3. Aggiungo RNA polimerasi che però da sola non si lega, devo aggiungere RNA polimerasi che

precedentemente si deve essere assemblata con TFIIF. Allora si forma il complesso chiuso. È TFIIF

che fa da ponte molecolare, media l’interazione.

4. Si deve denaturare il DNA creando il complesso aperto: il

complesso non è in grado di andare a complesso aperto senza

idrolizzare ATP (questo vale per classe II) quindi serve un altro

fattore generale di trascrizione: TFIIH: complesso fatto da 9

proteine e contiene una proteina che è una elicasi con attività

elicasica ATP-dipendente (idrolizzando ATP separa i filamenti

degli acidi nucleici che sono appaiati). Ma non si sa legare al

complesso se non è legato al complesso si associ TFIIE. Quindi

idrolisi di ATP e la doppia elica del DNA si apre. Ora siamo

passati al complesso di inizio aperto e la RNA polimerasi inizia a

trascrivere 8anche se all’inizio è un po’ abortivo)

5. RNA polimerasi deve quindi affinità per il promotore. Per farlo

deve perdere affinità con tutte le altre proteine e per perdere

affinità gli serve TFIIH che è tra le 9 proteine ne ha una che è

una chinasi: fosforila la coda dell’RNA polimerasi cariche negative fanno si che non possa più

à

interagire con le altre proteine e quindi queste si allontanano.

È una macchina molto grossa, con tante proteine se contiamo tutte quelle che compongono i vari TF e il

mediatore. Nella realtà si pensa che siano tutti già assemblati prima della trascrizione.

In realtà in natura non si siede TBP ma TFIID ma quindi chi sono i TAF: sono

coattivatori. È una proteina che aiuta un fattore trascrizionale a svolgere il suo

ruolo di attivatore. Un coattivatore non è una proteina che lega il DNA ma facilita

o media l’attività dell’attivatore trascrizionale. TFIID include una singola proteina

di 38 kDa che lega la TATA box (TBP) e 11 fattori associati a TBP (TAFs). I TAF

sono considerati co-attivatori (cioè non sono necessari per la trascrizione basale

in vitro ma per quella attivata). In altre parole i TAF servono a sentire e

rispondere ai fattori trascrizionali. TBP è la prima proteina che contatta il core

promoter. TFIID media la risposta attivata e serve ad

iniziare la trascrizione su quei promotori che non

hanno la TATA box.

Se do solo TBP e tutto il resto, no TAF ho della

trascrizione. Ma se do Sp1 e TBP non c’è attivazione

trascrizionale. Se do tutto, quando do Sp1 ho una

forte attivazione trascrizionale. TFIID=TBP+TAF dove

TAF sono coattivatori che hanno capacità di creare ponte molecolare con alcuni

fattori trascrizionale e quindi permettere l’attività trascrizionale.

Diversi tipi di attivatori possono

contattare specifici TAF,

suggerendo che i TAF possano

fungere da adattatori per

reclutare TFIID a promotori

specifici.

I$TAF$servono$

Cosa vedo nell’immagine: Servono tutti i TAF? Si prende Sp1

per$

e si danno due TAF no attivazione trascrizionale.

à

l’aCvazione$

Cambiamo TAF, no

trascrizionale$

trascrizione. Se mettiamo

250, 110 e 150 c’è

di$fa;ori$

attivazione trascrizionale.

specifici$

Quindi Sp1 ha bisogno di

tutti e tre i TAF per avere

la conformazione giusta

per coattivare la

trascrizione.

Posso quindi modulare la

potenza del promotore aggiungendo TAF quindi un promotore molto

forte ha tanti fattori trascrizionali che rafforzano la RNA polimerasi per

la chiusura.

Cos’è la coda che viene fosforilata della RNA polimerasi?

La coda carbossi-terminale è caratterizzata da una ripetizione di 7 aa

(eptapeptide) che vengono ripetuti un numero elevato di volte. Il numero di ripetizione varia a seconda del

grado di evoluzione dell’organismo che stiamo studiando, aumenta all’aumentare della complessità

dell’individuo. I 7 aa hanno la caratteristica che 5 sono fosforilabili ma molte delle treonin-serin chinasi sono

fosforilabili solo se seguite da prolina ed effettivamente è così anche qui: c’è sito di fosforilazione. Riduzioni

nel numero di ripetizioni alterano la risposta trascrizionale, l’allungamento recupera le mutazioni in attivatori

trascrizionali.

Esperimento per capire la funzione della coda: prendono lievito e iniziano a togliere la coda e allora non è

funzionale. Se si tolgono le ripetizioni via via scoprono che c’è un numero di ripetizioni che sono sufficienti al

lievito per crescere in condizioni ottimali, ma se lo sposto ad esempio ad una temperatura diversa il lievito

muore mutante termo-sensibile (è un cold sensitive). Come dimostro che un mutante è termosensibile:

à

ho piastra con il lievito a 28 gradi e cresce. Voglio vedere se cresce a temperatura minore: si fa la replica della

piastra (si fa lo stampo con stuzzicadenti e le piastro su un’altra piastra) e vedo se cresce a 25 gradi. Quello

che succede è che variano le conformazioni, cambiano i legami. Cambiando la conformazione cambiano le

interazioni proteina-proteina quindi a livello della coda se ho dei mutanti termosensibili (riduzione delle

ripetizioni) devo andare a vedere cosa succede: ricerca di soppressori esterni. Soppressore interno: reverte

il fenotipo annullando la mutazione. La ricerca di soppressori esterni invece è uno screening genetico dove si

cercano altri geni che possano revertere il fenotipo della RNA polimerasi ad esempio. Noi abbiamo mutante

termosensibile e lo irradiamo tanto da avere statisticamente una mutazione per gene e voglio cercare quello

che mutando mi fa tornare a fenotipo wild type il funzionamento RNA polimerasi. Le vado a piastrare prima

a 28 gradi ottenendo le coloniette e faccio la replica plating a 25 gradi e mi aspetto che nessuna colonia

sopravviva tranne per quegli individui che hanno la mutazione che mi fa tornare a wild type la RNA polimerasi.

Hanno trovato che la coda interagisce con una serie di proteine chiamate mediatore. È stato dimostrato

anche da dei biochimici. Hanno dimostrato che la coda interagisce con un complesso di proteine con circa 20

subunità chiamato mediatore ha una struttura sempre

à

mantenuta e il resto sembra vari da cellula a cellula. Sulla coda

non fosforilata è presente un mediatore che formato

sostanzialmente da coattivatori: interagiscono con i fattori

trascrizionali del promotore. Quindi in vivo c’è anche il

mediatore legato che è il punto di aggancio fondamentale per

far sedere il complesso sopra il promotore. Quando la

trascrizione parte TFIIH fosforila la coda e il mediatore non ha

più affinità e quindi si stacca. Mentre se togliamo i TAF può

funzionare lo stesso anche se non in modo perfetto, se togliamo

il mediatore non funziona più.

Sul nostro promotore vediamo un complesso proteico quindi molto grosso che ci permette di far sedere la

RNA polimerasi. L’oloenzima comprende un sacco di proteine (RNA pol, tutti i TF e il mediatore) ed essendo

così grosso (ha le dimensioni di un ribosoma) come fa a trovare il promotore? Si deve muovere in un nucleo

dove c’è molto traffico ed è molto denso. Si inizia a pensare che è il DNA

che in realtà viene portato all’oloenzima. C’è probabilmente una zona

apposta per svolgere il processo.

TATA box porta RNA polimerasi sul promotore ma se la TATA box non

c’è? Abbiamo un core promoter diverso ma come fa la RNA polimerasi

a sedersi sul promotore? TBP non può legarsi perché non trova la

sequenza bersaglio. Quando manca la TATA box le altre sequenze

(initiator,..) vengono riconosciute dai TAF che quindi riconoscono le

altre consensus. Quando manca la TATA box le altre proteine di TFIID

aiutano il complesso a fare riconoscimento sequenza specifica.

Promotore:

abbiamo un core promoter che abbiamo visto e basta in vitro. In vivo il core non basta:

Core promoter

Elementi regolativi abbastanza vicini al

core promoter: il numero varia e sono siti di

legami per fattori trascrizionali. Abbiamo

nell’immagine il sito di legame per Sp1 che è

sempre presente come fattore trascrizionale e

due siti di legame: uno per il recettore della vitamina D e uno per il recettore della vitamina A che

sono FT. Abbiamo quindi un promotore che viene acceso solo se c’è vitamina D e vitamina A. Il

problema è che la cromatina inibisce molto la trascrizione e per superare questa inibizione ci servono

tanti fattori trascrizionali. Ci sono sia elementi che legano proteine che ci sono sempre nella cellula

sia siti che legano proteine che non sono sempre presenti (es vitamina D e A). Promotore viene

acceso solo se c’è vitamina D o A perché se no non si riesce

a superare il blocco della proteina. A monte del core

promoter ci sono siti per diversi FT che possono far si che

promotore sia sempre acceso o regolato: se costitutivo i

FT sono quelli sempre espressi nella cellula, se è regolato

serve che si legano sia proteine regolate sia proteine

sempre presenti. Come dimostro ad esempio che un sito

serve per rispondere ad esempio alla vitamina D o allo

shock termico? Se promotore risponde al calore vuol dire

che ci sono degli dei siti di legame che vengono legati da

fattori attivi quando c’è uno shock termico ma come faccio

a dimostrarlo? Spezzetto DNA è faccio un ritardo

elettroforetico sia in condizioni normali che in condizioni

di shock termico. Vedo dove ho un ritardo nella seconda condizione. Trovo quindi una regione dove

c’è un probabile sito trascrizionale indotto al calore. Ma come dimostro che questa regione è

necessaria e sufficiente per rispondere al calore? Lo tolgo e

vado a vedere se non risponde più al calore. Capisco che

questo elemento è necessario ma non che è sufficiente. Per

capire se sufficiente lo metto nel promotore di un gene che

non risponde al calore e vedo se diventa inducibile al calore

il gene diventa inducibile al calore.

à Enhancer: regione che intensifica di molto la

risposta trascrizionale. Se ho un core promoter e lo metto in

vivo non trascrive. Se io aggiungo gli elementi regolativi

viene trascritto. Se metto enhancer trascrive molto di più. Se

allontano di molto ad esempio l’elemento regolativo dove si

lega la vitamina D non attiva più perché la distanza è troppo

elevata per poter attivare. Se io giro questa stessa sequenza

ma la metto vicino po’ essere che non interagisca più e

quindi non attiva. Quindi è sensibile alla posizione e al suo

orientamento. L’enhancer invece è una sequenza di DNA

capace di attivare la trascrizione indipendentemente dalla

sua distanza, posso allontanarla anche di moltissimo. Lo

stesso vale per l’orientamento. Non dipende dalla posizione

né dall’orientamento, lui attiva sempre. È il sito di binding

per più fattori trascrizionali. Esistono anche i silencer che

funzionano nello stesso modo ma inibiscono la trascrizione.

I fattori trascrizionali sono proteine modulari: sono fatti da moduli ossia da domini strutturali e funzionali che

possiamo staccare e continuano a svolgere la loro funzione. Devono

avere un dominio per legare il DNA e lo legherà sempre in maniera

sequenza specifica dominio di binding al DNA. Poi ha un modulo per

à

attivare la trascrizione. I diversi domini sono collegati da una regione

di proteina che è flessibile e serve da collegamento. Il dominio di

attivazione e quello di binding possono essere ovunque, non ci sono

regole per dove stare. Hanno tutte almeno questi due domini, poi ne

possono avere altri. Il dominio di attivazione puà essere al carbossi-

terminale, all’ammino-terminale o in mezzo.

Come si è dimostrato che ci sono domini che sono indipendenti? Esperimento di swapping dei domini: in

analisi due recettori: recettore dei glicocorticoidi ha regione di legame al DNA che fa si che la proteina

riconosca elementi dei glicocorticoidi e uguale per l’accettore per estrogeni che avrà un dominio che

riconosce gli estrogeni. Nella situazione

fisiologica la proteina lega i glicocorticoidi ma

non gli estrogeni ed una volta che li ha legati

attiva i geni responsivi ai glicocorticoidi. Se

scambio la regione di binding al DNA (es

tolgo dal recettore per gli estrogeni la

regione di binding al DNA e gli do quello dei

gruppi corticoidi) funziona solo se è un

dominio indipendente, una regione

autonoma: faccio una proteina chimerica

dove ho recettore degli estrogeni che ha un

dominio di binding al DNA per i gruppi

glicocorticoidi quando lega estrogeni attiva i geni dei gruppi corticoidi. I FT sono proteine che lavorano a

à

domini autonomi ma che possiamo scambiare per

formare proteine artificiali, costruiamo proteine

chimeriche.

GAL4 ha sito di legame e dominio di attivazione di

GAL4. Se noi gli diamo un gene che ha sito di

legame per LEXA non attiva. Se gli diamo il dominio

di legame al DNA di LEXA se gli diamo GAL4 non

attiva e se gli diamo LEXA attiva il gene di GAL4.

Come sono fatti i domini di binding al DNA? Si

prendono N fattori trascrizionali e hanno isolato questa regione. Poi hanno confrontato e hanno visto che

non sono tutti uguali ma neanche tutti estremamente diversi. I fattori trascrizionali possono essere divisi in

famiglie che hanno domini di binding con struttura simile e ce ne sono tre principali.

• Homeobox (negli eucarioti) o Elica-giro-elica (nei procarioti): 60aa che sono necessari e sufficienti a

continuare a legare la propria sequenza al DNA in modo specifico. Non hanno conservazione di

sequenza ma conservazione di struttura: due alfa eliche che corrono in

maniera parallela e una terza elica che si mette perpendicolarmente. FT

deve cercare la sua sequenza bersaglio e legarsi. Deve essere quindi poco

affine al DNA per sondarlo e molto affine alla sua sequenza bersaglio. Ha

una regione per una affinità generica per il DNA per poterlo sondare (si

attacca e si stacca e scorre) e una regione che ha la specificità per la sua

sequenza. Per dimostrarlo (esperimento di swapping anche qui) hanno

preso un dominio elica-giro-elica di Antennapedia (di Drosophila) e hanno

preso elica 1 e l’anno messa a Bicoid, lega ancora le stesse sequenze?

Hanno fatto swapping delle eliche e hanno scoperto che la elica 1 e 2 servono solo per prendere

contatto il DNA in modo aspecifico quindi se le cambiamo non cambia nulla ma se cambiamo elica 3

cambia la specificità. La corta porzione N-terminale è importante per l’affinità di legame e prende

contatto con il solco minore del DNA.

• Zinc Finger: esistono una serie di cisteine e istidine fatte in maniera tale

che ci sia una distanza cisteine-istidine corretta in modo tale da coordinare

un atomo di zinco + la sequenza in mezzo invece crea una particolare

struttura. Viene scoperta in TFIIIA che è un fattore di trascrizione di classe

3 dove ci sono un po’ di ripetizioni di questo zinc finger. Ci si accorge che

esistono proteine capaci di legare DNA perché formano struttura che grazie alla capacità di

coordinare lo zinco, riescono a interagire in maniera sequenza specifica con il DNA. Un dominio di

zinco ha due beta sheet e un’alfa elica e il tutto è tenuto vicino tra loro perché cisteina e istidina

coordinano un atomo di zinco. Le due beta sheet interagiscono in modo aspecifico con il DNA

mentre l’alfa elica entra nel solco maggior del DNA ed interagisce con la sequenza specifica. Se io

tolgo lo zinco la struttura si apre e la proteina non interagisce più con il DNA. Quindi zinc finger è

altro dominio di binding al DNA con delle proteine che presenta la struttura nell’immagine dove ha

Cys e His distanziate in modo da coordinare un atomo di zinco. Ciascun dito di zinco può

riconoscere 3 basi ma la possibilità di avere tre basi in fila è altissima nel DNA quindi la proteina

non ha un solo dito di zinco, se no riconoscerebbe tutto il DNA. Ci sono più zinc finger ciascuna

delle quali contatta 3 basi. Oggi possiamo decifrare alla perfezione i messaggi degli zinc finger: si

guarda la sequenza e si capisce quale sequenza di DNA riconoscerà. Possiamo anche fare quindi

delle proteine artificiali per riconoscere le sequenze che volgiamo noi (Sangamo è una company

che fa fattori trascrizionali zinc finger. Faccio una proteina di binding al DNA e attacco a questo

dominio di riconoscimento dei domini che facciano quello che voglio a quel gene: correggerlo o

distruggerlo).

Multi cysteine zinc finger: In questo caso tutti i domini di binding al DNA hanno due dita di zinco,

ciascuna coordina uno zinco che è coordinato da 4 cisteine (no

istidine). Evolutivamente non ha a che vedere con lo Zinc Finger, è

indipendente. Se cheliamo lo zinco anche qui perdiamo la struttura e

quindi il binding al DNA. Una regione ad elica del primo dito è

fondamentale per il riconoscimento sequenza specifico e si lega al

solco maggiore del DNA; altre regioni nel primo o secondo dito

determinano la distanza tra i due siti palindromici o ripetuti

riconosciuti.

• bZIP e bHLH: è un dominio che è sempre stato classificato come dominio di binding al DNA. Vari

fattori trascrizionali di questo dominio non hanno spesso una sequenza conservata ma hanno residui

di leucina sempre spaziati in modo uguale. Sono residui che si ripetono in maniera equi distanziata

da altri residui e hanno la capacità di fare una alfa elica dove ogni residuo di leucina sporge dall’alfa

elica un giro si un giro no. Però in realtà non è un dominio di binding ma un dominio di interazione

proteina-proteina e in modo specifico di dimerizzazione.

Le leucine funzionano come una cerniera e quindi creano

contatto proteina-proteina. I fattori trascizionali devono

dimerizzare per interagire con DNA quindi se io tolgo i

leucine zipper non perdo la possibilità delle proteine di

legare il DNA ma perdono la capacità di dimerizzare (che

serve al legame) e di conseguenza sembrava che fossero domini di binding. Per dimostrare che il

leucine zipper non è un dominio di binding ma che serve alla dimerizzazione delle proteine posso

fare uno swapping: prendo due fattori trascrizionali che dimerizzano e inverto il loro leucine zipper

e non succede nulla ma se io sposto i ft dal leucine zipper non

dimerizzano più. Il leucine zipper quello che fa è rendere il DNA in

conformazione giusta quindi è essenziale per il legame al DNA ma non

è il dominio di legame. Mutazioni nello leucine zipper aboliscono il

legame al DNA e la dimerizzazione. Mutazioni nel dominio basico

aboliscono il legame al DNA ma non la dimerizzazione. Esperimenti di

swapping mostrano come il dominio basico sia importante per la

specificità di sequenza mentre non lo e’ il leucine zipper. Se facciamo

dimerizzare artificialmente il solo dominio basico, questo lega il DNA con la corretta specificità in

assenza del leucine zipper.

I FT non sono abbondanti perché se lo fossero si legherebbe spesso ma si legherebbe anche a sequenze dove

non dovrebbe essere legato. Se è poco è più probabile che si leghi solo alle sue sequenze perché gioca

l’affinità.I FT trascrizionali per abbracciare DNA devono dimerizzare ma per dimerizzare serve che ci sia il

leucine zipper.

Domini di attivazione (repressione meno studiata perché la cromatina è inibitoria per la trascrizione quindi

il default per le nostre cellule e di avere la trascrizione spenta). Come è stato cercato: si prende dominio di

binding ad es di GAL4 e gli attacco porzioni della proteina e vedo quali sono necessari e sufficienti per attivare

la trascrizione. Poi si è cercato che caratteristiche strutturali avessero: non ci sono strutture tipiche di un

dominio trascrizionale. Un dominio di attivazione è una sequenza polipeptidica che attiva la trascrizione

quando fusa con un motivo di legame al DNA. I domini di attivazione non hanno una struttura ben definita e

molte sequenze diverse possono agire da domini attivatori.

- Hanno visto che alcuni sono molto acidi quindi tanti residui di

aspartato e glutammato. Se io ipotizzo che essere attivatore dipenda

dal fatto di essere molto acidi e quindi ricchi di aspartato e

glutammato (essere carico negativamente) posso fare una

mutagenesi e progressivamente vado a toglierli diminuendo

progressivamente la carica negativa: man mano che tolgo carica

negativamente perdo la capacità di trascrizione. All’opposto se

aumento la carica negativa vado a vedere se aumenta la capacità di

attivare la trascrizione ed è così.

- Poi hanno visto altri domini di attivazione e hanno visto che erano

ricchi di glutammina: hanno fatto stesso esperimento e hanno visto

anche qui che la forza di attivazione dipende dalla quantità di

glutammina.

- Terza classe di domini uguale ma per la presenza di prolina.

Se ho un dominio di attivazione fortemente negativo quindi carico di aspartato e glutammato, se non

interagisce non ha una struttura definita. Deve interagire con un TAF e prima interazione è

di tipo elettrostatico (cariche + e – si attraggono) quindi abbiamo prima interazione tra le

due proteine che si avvicinano. L’avvicinamento crea un cambiamento conformazionale

della proteina di attivazione e prende una forma ad alfa elica. Una volta assunta questa

struttura ci sono aa fondamentali che interagiscono in modo specifico con alcune regioni del

TAF con aa specifici.

Sono essenzialmente superfici adatte a mediare interazioni proteina-proteina attraverso le

quali può avvenire il reclutamento dei diversi componenti del macchinario trascrizionale

(altri fattori di trascrizione, co-attivatori, GTFs, HAT, SWI/SNF). Spesso comprendono aa

acidici. Spesso sono destrutturati in soluzione, per assumere struttura definita in seguito

all’interazione con un coattivatore.

Cosa vuol dire per la cellula attivare o reprimere la trascrizione:

abbiamo un promotore che è assemblato in nucleosomi. TATA box allora non è legabile e quindi trascrizione

non può avvenire bisogna liberare la sequenza dai nucleosomi.

Una possibilità per un attivatore trascrizionale e quello di portare una proteina

attivatrice che si lega e porta delle proteine che tolgono i nucleosomi. Una volta

che TATA box è libera può essere facilitata da altre proteine per reclutare proteine

quindi usa altre proteine attivatrici.

Possiamo avere proteina attivatrice che si lega e porta attività di rimodellamento

della cromatina che diventa libera (servono due complessi che vengono portati da

attivatori diversi) poi ci sono altri attivatori che aiutano complesso chiuso e altri

che servono a iniziare la trascrizione. Quindi servono tanti attivatori in quanto la

cromatina è molto inibitoria.

Esistono anche i repressori: hanno un dominio di binding uguale agli attivatori e un

dominio di repressione.

Un repressore può:

- Competere con il sito di legame

dell’attivatore. Attivatore e repressore

competono e chi si lega dipenda da affinità e

abbondanza. Se si lega repressore non può legarsi attivatore e

viceversa: binding competitivo

- Sul promotore abbiamo due legami uno per attivatore e uno

per repressore ma repressore interagisce con attivatore e se lo

fa l’attivatore no può interagire con il TAF. Attivatore quindi

non può comunicare con i TAF e quindi non può attivare

- Un attivatore e un repressore sono legati ma se repressore ha

affinità maggiore con i TAF allora si lega e attivatore non può

più legarsi al TAF.

- Repressore fa chiudere la struttura della cromatina sul

promotore: diventa eterocromatina (molto condensata).

Quindi il gene viene spento.

- Stessa cosa di quello sopra ma per farlo recluta istoni

In realtà il nostro DNA codifica per pochi fattori trascrizionali anche se

ne abbiamo bisogno di tanti. Spesso vengono usati stessi fattori

trascrizionali ma combinati tra loro in modo diverso. È la combinazione

dei diversi fattori trascrizionali che permettono di regolare finemente

la trascrizione di tanti geni.

Eucarioti e procarioti hanno come linea di massima una trascrizione simile ma eucarioti hanno trascritti più

lunghi + la velocità di polimerizzazione è maggiore e per andare tanto veloce la RNA polimerasi sono aiutati

da elongation factor che aiutano a farla rimanere attaccata quando si ferma e quando torna indietro a

correggere + trascritto non maturo ma deve essere processato. I fattori di allungamento sopprimono le pause

quindi se RNA polimerasi si è formata la fa andare avanti e

alterano la struttura della cromatina perché RNA pol possa

scorrere sul templato. Processamento va di pari passo con

la trascrizione.

La fosforilazione della coda della RNA pol coordina tutto: a

seconda di quali residui vengono fosforilati la coda

interagisce con proteine che fanno cose diverse: es. si lega

enzima per il capping che mette il cappuccio poi cambia

fosforilazione e si attacca complesso di splicing poi cambia

ancora e si attaccano i fattori di poliadenilazione. Quindi coda non solo importante per interazione del

mediatore ma anche per i passaggi successivi.

Come avviene la terminazione:

1. Formazione estremità al 3’

2. Distacco RNA polimerasi

se RNA polimerasi non si stacca lei continua a trascrivere sequenze che in quel momento non dovrebbero

influenzando la trascrizione di altri geni perché vengono trascritti geni regolatori anche se non codificano per

proteine (non coding DNA). Quindi voglio una terminazione precisa. Impedisce la formazione di RNA

antisenso che potrebbero interferire con la produzione di preRNA normali. La RNA pol I utilizza un fattore di

terminazione che si lega al DNA a valle del sito di terminazione. La pol III ha una sequenza ricca in U (poliU) a

livello del trascritto e utilizza pochi fattori ausiliari. Solo pol II per tagliare l’RNA nel proprio sito attivo richiede

un set di complessi proteici e specifiche sequenze nell’RNA. RNA pol 1 e 3 si usa un sito di terminazione

presente sul dna e quindi sul trascritto + uno o più fattori proteici che aiutano a terminare. Per pol 2 servono

tante proteine invece:

Ci deve essere un segnale di taglio e poliadenilazione che è molto conservato che è sul DNA e quindi sul

trascritto. Questa sequenza cambia conformazione del

complesso se ne vanno proteine e ne arrivano altre.

Questo sito viene riconosciuto da un fattore proteico

particolare che induce il taglio del trascritto ce avviene

circa tra gli 11 e i 30 nucleotidi dopo. Una volta che RNA

è stato tagliato RNA pol non lo sa ancora quindi va

ancora avanti di circa 80-250 nucleotidi ma questo

pezzo non è protetto e viene degradato. All’inizio del

trascritto c’è un cappuccio e la fine è protetta da

poliadenilazione. Il resto che esce dopo coda di A viene

degradato.

RNA polimerasi man mano che si muove cromatina è

stata disassemblata ma dove è disassemblata può

legarsi anche un’altra RNA pol: come lo evitiamo? Quando ci sono sequenze che non dovrebbero essere

trascritte hanno dei segnali di poliadenilazione e di taglio e quindi RNA pol continua a trovare queste

sequenze e continua a tagliare. Questi sono promotori di classe I trascrive per RNA ribosomiali,

à

primo che esce dalla colonna cromatografica. Trascritto che otteniamo

contiene info per 18S, 5.8S e 28S. poi viene tagliato e modificato per

darci i trascritti maturi. RNA pol I ha solo un promotore quindi RNA pol

non deve essere finemente regolata quindi non tanti siti per ft ma serve

promotore che faccia superare la cromatina. Quindi RNA pol 1 si deve

sedere nel punto giusto e farlo efficacemente: viene aiutato anche lui

dai fattori generali di trascrizione perché da solo non può legarsi. Il

promotore: prendiamo regione a monte dei geni per rRNA e

mutagenizziamo per vedere quando perdono attività trascrizionale. Ci

sono regioni che se vengono mutagenizzate trascrizione poco

efficiente/non avviene quindi ha: • Core: fondamentale perché

si possa trascrivere

• Regione a monte del core che

aiuta il core promoter ma è molto

più corto

C’è un complesso che si chiama UBF che è il primo fattore che si lega al

promotore al .. element, poi aiuta e porta il complesso SL1 a legarsi al core

promoter che poi porta rna pol a legarsi. Quindi

1. UBF1 si lega

2. Aiuta fattore SL1 a legarsi nel posto corretto

3. SL1 si lega (sufficiente per la trascrizione basale). Contiene TBP e altri

fattor (tre TAF)

4. SL1 recluta Rna pol

5. Inizia la trascrizione

All’interno di SL1 c’è TBP che è presente sempre (anche in classe 3 come nella classe 1). In classe 2 si legava

alla TATA box ma in classe 2 e 3 non c’è la sua sequenza bersaglio.

Classe 3: geni trascritti da RNA pol 3 e abbiamo anche qui dei

promotori trovati per mutagenesi. due tipi di promotore stanno

tutto a valle del gene e l’altro tipo a monte. Quindi promotore può

essere a monte o a valle. Abbiamo un fattore di assemblaggio che

è un fattore generale di trascrizione che si chiama TFIIIC che si lega

riconoscendo box A e box B in modo specifico. Adesso porta TFIIIB

che contiene TBP e interagisce con la polimerasi che viene reclutata

e inizia la trascrizione. TFIIIC va via ma TFIIIB rimane lì per il ciclo successivo. TFIIIB non saprebbe legarsi senza

TFIIIC ma se si lega cambia conformazione e quindi riesce a rimanere legato anche senza TFIIIC.

Principi unificanti della trascrizione eucariotica:

1. Un fattore di assemblaggio riconosce un sito di legame specifico nel promotore (TFIID, TFIIIC, UBF);

questa proteina poi recluta gli altri componenti del complesso di preinizio.

2. TBP in tutti i promotori aiuta il reclutamento degli altri fattori e della RNA polimerasi; quindi ha un

ruolo di organizzazione dei complessi che si siedono sul promotore.

3. La specificità di TBP è regolata dai TAF con cui si associa

Cromatina

Come fa la cellula a regolare finemente la trascrizione permettendo a due metri di DNA di stare nel nucleo

quindi in uno spazio piccolo? Cromatina=DNA + proteine che con il DNA

à

stanno interagendo. Genoma sono 3 miliardi di bp che corrispondono a 2m

di DNA per cellula che devono stare in 2 micron di diametro del nucleoà

deve essere compattato 200.000 volte. arriviamo mediante diversi livelli di

organizzazione in cui intervengono proteine e non coding DNA. Noi non

sappiamo quali sono tutte queste proteine: conosciamo il nucleosoma e la

fibra da 30 nanometri e poi il resto è ipotizzato.

Il compattamento del DNA nei cromosomi è essenziale per:

Contenere in uno spazio limitato il lungo DNA

Ø Proteggere DNA da eventuali danni: non accessibile agli enzimi e

Ø agenti di danno

Garantire una corretta trasmissione del corredo genetico ad

Ø entrambe le cellule figlie on ogni divisione cellulare: se non sono

compattati in cromosomi si annodano tra loro nel momento in cui tiri ai due poli della cellula

Regolare l’espressione genica

Ø

Come siamo arrivati a conoscere la struttura della cromatina:

1956 (dopo scoperta di Watson e Crick) c’è un fisico che studia la diffrazione a raggi X e si accorge che ottiene

un segnale che porta al calcolo dimensionale maggiore alla grandezza della doppia elica. Poi altri tre

ricercatori tra cui Crick e Kornberg trovano che la ripetizione era di 100Å. Microscopia elettronica: si fa uscire

DNA dei nuclei e lo si va a guardare vedono come è organizzato il DNA nei nuclei e trovano immagini di

à

collana di perle: il DNA che fuoriesce dal nucleo ha una organizzazione ripetitiva pechè si vedono delle sfere

le cui dimensioni sono esattamente 100Å. Se si va a vedere la dimensione del filo ha la dimensione

esattamente del DNA. Quindi perle tenute insieme da DNA nudo. Come si vedono le dimensioni? Si fa foto

con una tara di misura .

Nucleosomi: soma sta per corpi, nu per nucleo corpi del nucleo. È la più semplice organizzazione presente

à

nel nucleo. Se si tratta il vetrino con poca DNAsi questa toglie DNA nudo nucleosomi non sono composti

à

da solo DNA.

Come sono fatti i nucleosomi? Sono tuti uguali di

dimensioni quindi sono fatti tuti nello stesso modo.

1. Si usa una nucleasi micrococcica che ha la

capacità di tagliare DNA che collega due

nucleosomi (DNA linker) ma non il DNA che

sta sulle perle (NB ne do poca se no mangia

tutto).

2. Si formano dei frammenti di cromatina in cui

una volta ho solo un nucleosoma, a volte ho

due nucleosomi e così via.

3. Si prende il campione e ho nucleosoma e voglio sapere come è fatto. Faccio un gradiente di

saccarosio ad esempio perché i gradienti ci permettono di far migrare molecole in funzione del peso

e della conformazione + microscopia elettronica. Ottengo peso e conformazione (cilindro).

4. Per sapere quali molecole sono presenti nel nucleosoma digeriscono con vari enzimi che digeriscono

varie molecole. Se tratto con le proteasi il nucleosoma non esiste più => DNA fatto da DNA e proteine

Quali proteine?

Purificano i nucleosomi e ora li disassemblo: da una parte proteine e dall’altra DNA. Per farlo si alza il sale:

sfido legami deboli con la forza ionica. Serve una quantità di sali enorme: complesso è molto stabile. E fanno

due esperimenti, uno per vedere proteine e uno per vedere DNA.

A. Tengo DNA e butto le proteine. Faccio elettroforesi e vedo che DNA trovo. Se nucleosoma può

contenere quantità variabili di DNA avrò varie

basi. Trovo una sola banda di 147 paia di basi

costanti e impegnati con il nucleosoma.

à

B. Tengo le proteine e butto DNA. Carico proteina

purificate su SDSPAGE e coloro con blu di

comassi. 4 bande con pm molto vicini e con

intensità di banda simile quindi presenti in

quantità equimolari Istoni che chiamano

à

H2A,H2B,H3,H4.

Allora nucleosoma è fatto da 147 paia di basi e 4

proteine istoniche. è vero? So quanto pesano 147 paia

di basi e sommo con peso delle 4 basi e dovrei trovare

peso che avevo nel gradiente. Non è uguale perché

ciascuna proteina è presente in doppia copia in realtà. Se io sommo peso 147bp con coppie di ognuna delle

4 proteine ottengo stesso peso. Quindi nucleosoma è formato da DNA e da un ottamero proteico.

Se le proteine sono all’esterno e stanno avvolgendo DNA allora se io metto poca DNAsi DNA non dovrebbe

essere intaccato, viceversa se DNA è all’esterno dell’ottamero proteico allora dovrebbe essere intaccato dalle

DNAsi. Quindi do DNAsi e guardo poi su gel trovo che DNA non rimane intatto quindi DNA è esterno al

à

nucleosoma.

Allora la cosa più facile è che si avvolga attorno al nucleosoma: so la grandezza delle 146 paia di basi e so

quanto è grande il nucleosoma. Se avvolgo una volta DNA questo sporge, in realtà quindi è avvolto due volte

attorno al nucleosoma. Il nucleosoma è ormato da un cilindro formato da 4 proteine istoniche in duplice

copia (ottamero proteico) attorno al quale 146bp si avvolgono due volte.

In realtà è possibile trovare un istone H1 che però non è presente in

quantità equimolari. Se Kornberg mette solo H3 con H4 si forma un

tetramero. Se unisco tra loro H2A e H2B si formano dei dimeri.

Quindi:

H3 e H4 creano un dimero, due dimeri formano un tetramero. H2A

e H2B formano due dimero che si uniscono al tetramero e si forma

l’ottamero. Si forma indipendentemente dal DNA, si forma in

soluzione senza problemi. Il DNA ci si avvolge attorno e forma un

sacco di legami deboli con le proteine istoniche perché proteine istoniche sono molto cariche positivamente.

Questi legami deboli (più di 140) ci garantiscono la grossa stabilità (quindi ci servono per questo motivo tanti

sali per dissociare un nucleosoma). La maggior parte di questi legami avviene a livello dell’O dei legami

fosfodiesterici. Curvarsi non è vantaggioso per il DNA perché si avvicinano le cariche negative dell’ossatura

ma queste si respingono. Quindi bisogna neutralizzare le cariche negative e formare tanti legami perché

questa struttura sia energicamente favorevole.

Istoni sono tra le proteine più altamente conservate nell’evoluzione. Sono piccole

proteine molto conservate, cariche positivamente

(lisina e arginina). Tutti e 4 gli istoni del core hanno

una porzione centrale chiamata anche globulare che

è fatta da delle alfa eliche. Due alfa eliche lunghe si

contattano e le due corte si stringono per tenere insieme le proteine. La porzione

globulare serve quindi per l’interazione proteina-proteina. Le code sono destrutturate

e fluttuano. Le code sono molto cariche

positivamente.

Si prende nucleosoma e si purifica, lo trattiamo con

poca proteasi es. tripsina. Tripsina in genere taglia

dove trova un aa carico ma non è specifico. Dando poca trispina per poco tempo, poi

purifico proteine istoni e vedo cosa mi è rimasto: le proteine istoniche hanno perso la coda ammino-

terminale. Questo ha permesso di dire che le code stanno all’esterno mentre i domini globulari stanno

all’interno.

Se io prendo solo il dominio globulare degli istoni guardo se si forma il cilindro si si forma mentre non si

à

forma se uso solo le code. Quindi sono i domini globulari che mi fanno il nucleosoma. La prima organizzazione

della cromatina è chiamata fibra da 10 nanometri (10 nanometri sono 100 Å). Quanto compatta la fibra da

10 nanometri? Si definisce grado di condensazione il rapporto tra quello che è presente nel DNA nucleo e la

stessa molecola di DNA assemblata alla fibra da 10 nanometri. Prendo DNA plasmidico di cui conosco la

lunghezza, la assemblo a nucleosomi e vado a rivedere quanto e lunga dopo. Occupa circa 6 volte meno lo

spazio. Se facciamo i due metri di DNA diviso 6 viene 0,3 ma è ancora troppo grande.

Le perle sono costanti e anche il DNA linker è costante in uno stesso organismo ma

differisce un pochino da organismo ad organismo.

Quindi ci devono essere livelli di organizzazione superiore della cromatina. Allora vado

a vedere come appare la cromatina dal microscopio elettronico quando esce dal

nucleo. Abbiamo dei punti in cui abbiamo la collana di perle e dei punti in cui la

cromatina invece è più spessa e questo riguarda la maggior parte della cromatina à

è una fibra da 30 nanometri. Per la formazione della fibra da 30 nanometri interviene

l’istone H1.

Fibra da 30 nanometri = Fibra da 10 nanometri + istone H1.

Istone H1 è una proteina anche lei altamente conservata, ha un dominio globulare

due code: una più pronunciata e una più destrutturata. Istone H1 interagisce con

nucleosoma in maniera asimmetrica e interagisce un po’ con

nucleosoma e un po’ con il DNA. È come se schiacciasse il DNA contro il

perno, stabilizza il DNA tenendo da una parte l’estremità che esce dal

nucleosoma e schiacciandolo contro il nucleosoma e con l’altra si lega

al nucleosoma. Quindi H1 rafforza l’associazione del DNA con i

nucleosomi. Lega il DNA in due punti: sul linker e nel centro di simmetria

del nucleosoma. Allora DNA forma un angolo fisso perché è obbligato a

prendere una certa traiettoria e costringe la cromatina ad assumere

quindi un andamento a zig zag. Quindi occupa meno spazio, è più compattata à

compatta la fibra di 10 nanometri di circa altre 7

volte DNA compattato di circa 40/50 volte. Per

à

ogni molecola di H1 ho due molecole di H3 quindi si trova che c’è una

quantità dimezzata di istoni H1 rispetto gli altri istoni.

Come dimostro la fibra da 30 nanometri? Prendiamo dei nucleosomi normali e dei nucleosomi che hanno

solo domini globulari e vado a vedere se si forma la fibra da 30nm. Nel secondo caso non si forma. Quindi il

dominio globulare è sufficiente per formare la fibra di 10nm ma in natura noi dobbiamo compattarlo di più

e quindi ci servono le code per formare la fibra da 30nm e le organizzazioni di livello superiore.

Però ancora non basta un DNA compattato di 40/50 volte. Però qui conoscono le nostre conoscenze certe.

Si pensa che nel nucleo interfasico troviamo una via di mezzo tra una fibra da 30 e da 10 nanometri. Se invece

non serve compattiamo di più.

Si pensa che la fibra da 30 nanometri inizia a formare delle anse,

dei loop di lunghezza variabile con proteine che tengono bloccate

le anse. Poi le anse possiamo iniziare ad avvolgerle su sé stesse,

si super avvolgono e occupano quindi meno spazio. tutto questo

avviene grazie a proteine fino ad arrivare al cromosoma

metafasico.

I geni che voglio sempre espressi li metterò nelle stesse anse

mentre quelli che voglio che non siano espressi saranno in anse

che spesso saranno spiralizzate. Quindi si gioca sulla grandezza

delle anse per tenere in un’unica ansa geni che devono essere

espressi/non devono essere espressi. Il cromosoma è compattato al massimo perché non ci sono geni che

vengono trascritti in questo momento.

Epigenetica

Dal punto di vista del significato della parola = sopra la genetica. L’epigenetica studia le informazioni

trasmissibili che vengono date alla cellula ma che non sono contenute nella sequenza del DNA. Possiamo

ereditare delle situazioni patologiche o normali perché ci sono informazioni trasmesse ma non con il DNA.

Epigenetica: Studio dei cambiamenti nella funzione genica ereditabili per via mitotica o meiotica che non

coinvolgono alcuna modificazione della sequenza nucleotidica primaria del DNA.

Un fenomeno epigenetico: Cambiamento fenotipico ereditabile ma che non implica una mutazione del DNA.

I meccanismi epigenetici sono la base per comprendere la relazione tra organismo e ambiente e influenzano

il modo con cui i geni vengono espressi. Studio dell’epigenetica ci permette di capire come fa l’ambiente ad

influenzare quello che noi siamo + ci permette di capire che la mutazione che arriva dall’ambiente è

reversibile. Noi siamo frutto di genetica ed epigenetica. I gemelli monozigotici sono identici geneticamente

eppure non sono uguali tra loro per suscettibilità alle malattie, ecc. Cosa fa si che due gemelli monozigotici

siano diversi? Due gemelli monozigotici sono tanto diversi quanto sono stati esposti a fattori diversi, dove

sono cresciuti. Allora Manel studia coppie di gemelli monozigotici come sono epigeneticamente: sono dal

punto di vista epigenetico molto simili quando nasco, poi man mano che crescono diventano sempre più

diversi, modificazioni che risentono dell’ambiente. Es. anche api nascono tutte uguali ma poi si differenziano

in ape regina o ape operaia a seconda di quello che mangiano (a seconda se mangiano o meno la pappa

reale). La pappa reale contiene enzimi per la metilazione del DNA quindi si può giocare con la metilazione. La

metilazione del DNA è un meccanismo dell’epigenetica che blocca la trascrizione del gene.

A volte l’influenza dei geni ci deriva dai nonni.

Epigenetica è importante perché ci permette di

essere quello che siamo. Anche se abbiamo un

unico genoma, le nostre cellule hanno tanti

epigenomi diversi. Tutte le cellule di un

organismo sono uguali perché hanno lo stesso

genoma, tuttavia differiscono l’una dall’altra

perché hanno un epigenoma diverso. Il silenzio

trascrizionale è regolato in buona parte da meccanismi epigenetici e questo permette la presenza di cellule

differenti. Epigenetica è maggiormente studiata negli organismi più complessi: lievito ha epigenetica ma ne

ha poca, uomo ha epigenetica molto più complicata e ci permette di essere tanto complicati. Epigenetica

influisce moltissimo sullo spegnimento dei geni. I processi epigenetici sono essenziali per condensare e

interpretare il genoma, sono fondamentali per un normale sviluppo e si riconosce sempre di più il loro

coinvolgimento nella salute umana.

Meccanismi epigenetici che conosciamo sono 3:

- Metilazione del DNA repressione trascrizionale

à

- Modificazione degli istoni o comunque variazione della struttura della cromatina accensione o

à

spegnimento del gene

- Piccoli e non coding RNA

Genetica come un libro scritto che quindi viene sempre copiato

identica, epigenetica invece è quella che legge la genetica

interpretandola, è come colui che legge il libro.

Epigenetica: parliamo di un codice scritto sul DNA e tramandata alle

cellule figlie che la interpretano. Tutti i codici hanno uno scrittore,

che nel caso del codice genetico è la DNA polimerasi, e un lettore,

che nel codice genetico sono RNA polimerasi e ribosomi. Codice

genetico è stabile quindi nessuno lo cancella.

Il codice epigenetico è un codice e quindi ha uno che lo scrive e uno

che lo legge. Si è pensato che gli scrittori del codice epigenetico

sono quelli che depongono il codice epigenetico che sono enzimi:

DNA metil transferasi che sono quelli che metilano il DNA + *che

modificano gli istoni. I lettori del codice epigenetico sono stati trovati e sono delle proteine che leggono il

segnale del DNA metilato attaccandosi + proteine che leggono segnale degli istoni modificati. Ma il codice

epigenetico è meno stabile del codice genetico, è dinamico, cambia a seconda di quello che sta succedendo

nell’organismo e nell’ambiente e per cambiare ci sono degli Eraser che sono enzimi cancellano il segnale

epigenetico.

Metilazione del DNA

La metilazione del DNA è una modificazione post replicativa dei

nucleotidi a carico dell’enzima DNA metiltransferasi. La metilazione

può avvenire su diversi nucleotidi nei procarioti e nei vegetali ma

nell’uomo avviene su un’unica base: citosina aggiunto gruppo

à

metilico al C5. Nei vertebrati le citosine metilate sono quelle seguite da

una guanina: interessa i dinucleotidi CpG. Il nostro genoma è

profondamente metilato: dal 60-90% dei CpG sono metilati. Le cellule di un organismo hanno genoma

metilato in modo diverso. La metilazione del DNA nasce già anticamente quindi presente nei procarioti e nel

lievito, poi viene persa dagli organismi eucariotici più semplici.

Nei procarioti (non si parla di epigenetica ma solo di metilazione) a differenza che negli eucarioti: citosina in

posizione 5 e adenina metilata in posizione 6. I nucleotidi metilati possono essere seguiti da qualsiasi

nucleotidi. Nei procarioti la metilazione serve a:

• Proteggere genoma da invasione di DNA estraneo. Ad esempio Coli ha una sua DNA metiltransferasi

e metila la sequenza GAATTC (che è la sequenza riconosciuta da EcoR1) del suo genoma così enzima

di restrizione di Coli non la può tagliare. Questo tipo di DNA metil transferasi riconosce la stessa

sequenza di EcoR1 così da riconoscerla e metilarla. Enzima di restrizione taglia solo se la sequenza

non è metilata taglia il DNA estraneo e non il suo.

à

• Poi la metilazione viene usata per controllare il ciclo di replicazione del

genoma e che venga equi ripartito tra le due cellule figlie. Genoma di coli

è circolare e covalentemente chiuso. Da OriC parte la replicazione e si

forma la bolla di replicazione, la replicazione prosegue e intanto da Ori si

aprono altre bolle di replicazioni e partono altre replicazioni. Ma ci sono

dei controlli: OriC ha come caratteristica di avere 11 siti ripetuti della

sequenza GATC che è il target di una DNA metil transferasi che metila le

11 A su entrambi i filamenti. L’origine è completamente metilata su

entrambi i filamenti. In seguito a replicazione viene fatto nuovo filamento

che non viene metilato subito e quindi per un certo periodo di tempo

l’origine sarà emimetilata finché la DAM metilasi non rimetila. Si è

scoperto che l’intervallo di tempo da quando origine è emimetilata fino a

che è metilata è il periodo di tempo in cui l’origine non può essere

rireplicata quindi è quello che controlla quando Coli deve replicare. Per

dimostrarlo overesprimo la DAM metilasi e vedo che accorcio il periodo

di non replicazione. Perché: La proteina SeqA si lega quando origine è

emimetilata ma quando Seq A è legata impedisce alla DAM metilasi di

legarsi e quindi rallenta la metilazione. C’è una competizione. Quando

DAM metilasi riesce a spiazzare Seq A metila.

Questo meccanismo vien usato anche per controllare la segregazione dei

due cromosomi: Coli

vuole essere sicuro che ciascuna delle due cellule

figlie ricevi un cromosoma. Se la Ori è metilata non

c’è SeqA legato e genoma è nel citosol della cellula.

Ha iniziato a replicare e ori è emimetilata e quindi è

legata SeqA che aggancia alla membrana cellulare.

Siccome sta agganciando genoma alla membrana

man mano che continua a replicarsi cresce della

membrana in mezzo e allontana le Ori e si crea il setto di segregazione che quindi separa. In questo

modo ho la certezza che un cromosoma vada in una cellula e l’altro nell’altra perché gli ho fatto

crescere membrana in mezzo e le ho separate.

• Riparazione del DNA: esistono dei meccanismi che controllano se ci sono degli errori: meccanismo di

riconoscimento di mismatch: se c’è un mismatch c’è una variazione

della forma della doppia elica che in quella posiziona si distorce. Questi Attività endo

meccanismi trovano e tagliano la distorsione e risintetizzano quel su DNA emi

pezzo. Come fa Coli quali dei due filamenti deve essere riparato? A conferma d

Utilizza la metilazione del DNA: la sequenza GATC è molto frequente nel l’overproduz

genoma di coli e quindi abbiamo un gruppo metilico ogni circa 300bp. un aumento

Il filamento di nuova sintesi non è metilato mentre quello di vecchia

sintesi è metilato. Allora la metilazione viene così usata per riparare il

DNA. Quindi abbiamo un errore nel filamento di nuova sintesi e allora

sistema di riparazione ha una proteina chiamata MutS che si attacca e

si stacca al DNA e riconosce il sito di mutazione e rimane lì legato.

Rimanendo lì legato richiama MutL e MutH che arrivano sul DNA. MutL

e MutH devono incidere DNA e poi degradarlo per farlo sintetizzare ma

devono incidere filamento giusto: MutH scorre sul DNA dal punto di

mutazione e cerca un gruppo metilico quando lo trova incide il filamento opposto quindi viene

à

degradato il filamento di nuova sintesi dal sito di mutazione fino a dove ha inciso MutH e poi

risintetizzano. A conferma del modello la mancanza o l’overproduzione della Dam metilasi portano

a un aumento della frequenza di mutazione.

L’avere un gruppo metilico su una A o su una C può favorire o sfavorire il legame con determinate proteine

che leggono in maniera diversa. Coli ha tantissimi meccanismi che usano la metilazione del DNA.

Torniamo agli eucarioti: metilato su citosina seguita da guanina e nostro genoma è altamente metilato. In

realtà se andiamo a vedere quanta metilazione in C c’è è poca perché ne troviamo 1 ogni 100. Il genoma ha

perso nell’evoluzione CpG perché metilazione è causa di mutazioni. La citosina può andare incontro a

deamminazione spontanea e se si deammina diventa uracile ma uracile nel genoma non c’è: sistemi di

riparazione se ne accorgono e riparano riconvertendola in citosina. La citosina metilata invece se si deammina

spontaneamente diventa una timidina è una base

à

comune nel DNA ma abbiamo quindi una T con una

G dell’altro filamento mismatch. Due possibilità: o

à

sistema viene riparato, o non viene riparato e al

primo evento di duplicazione la mutazione si fissa

con tutte le conseguenze. Questo è il motivo per cui

il nostro genoma ha 5 volte meno CpG e quindi un

numero di citosine metilate minore dell’atteso.

Durante l’evoluzione queste eventi di

deamminazione spontanea sono avvenuti e non sono

stati riparati e quindi abbiamo perso i dinucleotidi.

Avviene dalle 10 alle 40 volte più frequentemente delle altre mutazioni. Molte malattie dipendono da questo.

CpG islands: è una regione del genoma molto lunga (500-5000bp) che ha una frequenza molto molto

elevata di CpG. Queste regione generalmente non sono metilate perché se

fossero metilate le avremmo perse nell’evoluzione.

Se andiamo a studiare dove è distribuita la metilazione del DNA (nella parte

regolativa del DNA) troviamo che i geni housekeeping non sono metilati ma sono metilati i geni regolati:

normalmente i geni metilati non sono espressi mentre quelli espressi non sono metilati. Quindi lo stesso gene

nei diversi tessuti può essere espresso o meno a seconda se è o no metilato. La metilazione avviene nelle

sequenze parassitiche, tutto quello che potrebbe danneggiare il genoma + le sequenze altamente ripetute.

Prova sperimentale dell’importanza della metilazione del DNA: primo topo transgenico primo della DNA metil

transferasi. Questo topo non nasce, muore nell’embriogenesi. Si è riusciti a prendere poi degli embrioni e si

sono prese le cellule staminale, sono state coltivate e si è viso che effettivamente non c’era DNA metil

transferasi ma in coltura queste cellule si replicano. Quindi si è scoperto che non è fondamentale alle cellule

staminali per replicarsi ma quando le si spingono a differenziarsi queste cellule morivano: la metilazione è

fondamentale per lo sviluppo e il differenziamento.

IL 70-80% DELLE CITOSINE DEI DINUCLEOTIDI SONO METILATI NELLA MAGGIOR PARTE DEI TESSUTI.

IN GENERE I GENI TESSUTO SPECIFICI NON ESPRESSI SONO METILATI MENTRE GLI STESSI GENI SONO DEMETILATI NEI TESSUTI IN CUI VENGONO

ESPRESSI.

MOLTI GENI HOUSEKEEPING SONO PRECEDUTI DA CpG ISLANDS CHE IN GENERE RIMANGONO DEMETILATE.

I MAMMIFERI SONO CARATTERIZZATI DA UNO SPECIFICO PATTERN DI METILAZIONE CHE SI MANTIENE INALTERATO NEI DIVERSI TIPI CELLULARI.

TOPI TRANSGENICI PRIVI DELLA DNA METILTRANSFERASI 1 SONO LETALI. CELLULE STAMINALI (NON DIFFERENZIATE) IN COLTURA PORTANTI LA

MEDESIMA MUTAZIONE OMOZIGOTE CRESCONO SENZA APPARENTE FENOTIPO. VANNO IN APOPTOSI IN SEGUITO A STIMOLAZIONE DEL

DIFFERENZIAMENTO.

IL CROMOSOMA X INATTIVO NELLE CELLULE FEMMINILI DI MAMMIFERO E’ ALTAMENTE METILATO MENTRE QUELLO ATTIVO NON LO E’.

Ci serve a:

- Controllare espressione genica

- Controllare inattivazione del cromosoma X nelle donne (X inattivato è altamente metilato)

- Controllare espressione dei geni soggetti a imprinting: noi abbiamo due alleli (uno di origine materna

e l’altro paterna) e per la maggior parte dei geni non c’è differenza di regolazione. Ma nei geni

soggetti ad imprinting non è così, allele paterno e materno si comportano diversamente quindi puoi

avere uno dei due acceso e l’altro spento.

- It appears to mark the bodies of active genes.

- It represses promoter activity.

Nostro genoma non è sempre metilato. Partiamo da uno sperma fortemente metilato e una cellula uovo

metilata ma un po’ meno zigote con metilazione intermedia. Inizia la divisione e durante le prime divisione

à

il genoma viene tutto demetilato. Arriviamo alla blastocisti che il genoma è virtualmente non metilato. Poi

riparte la metilazione fino ad arrivare al 60-90% del genoma metilato. Quindi abbiamo sistema di metilazione

e demetilazione altamente complicato che si avvale di writers e eraser. Noi abbiamo delle 2 tipi di DNA metil

transfersi e delle Demetilasi. DNA metil transferasi di mantenimento è quello che metila il filamento di

nuova sintesi leggendo dove lo stampo è metilato, se la togliamo è letale. Quando siamo alla blastocisti non

possiamo usare quella di mantenimento perché tutto il

genoma è stato demetilato: si usa le DNA metil tranferasi

de novo che introducono metilazione senza bisogno di un

filamento stampo già metilato. Il topo knockout senza DNA

metil transferasi1 muore, se tolgo la 3A il topo nasce ma

dopo 4 settimane muore. Senza il 3B muore sempre alla

fase embrionale.

Nell’uomo: non esiste un uomo senza la 3B se no muore.

Però esistono patologie come ICF che ha metil transferasi

3B che funziona male e quindi soggetto nasce ma muore

presto. Si possono quindi avere delle mutazioni missenso

che portano alla formazione di una DMT poco funzionante

che porta a patologie, ma comunque per avere un soggetto vivo devono essere presenti.

La metilazione del DNA inoltre serve all’inibizione dell’espressione genica e al mantenimento dell’integrità

genomica attraverso l’inattivazione di sequenze parassite quali i trasposoni e il DNA dei provirus.

Come fa la metilazione del DNA ad inibire la trascrizione:

Si ipotizzò il modello diretto: la metilazione del Dna inibisca direttamente il legame

dei fattori trascrizionali. I lollipop indicano CpG: se rosso è metilato. Il gruppo metilico

sporge nel solco maggiore del DNA e quindi FT non può legarsi gene spento. Per

à

dimostrarlo uso ritardo elettroforetico. Ma: i CpG sono rari quindi la probabilità che

ci sia un CpG all’interno del sito bersaglio di un ft è bassa (a volte ci sono promotori

metilati fuori dal sito di legame dei ft eppure il ft non si lega, non può essere modello

diretto) + trova che ci sono FT che sanno legarsi alle sequenze bersaglio anche se

metilate ma anche se si legano il gene spento. Allora si ipotizza il modello indiretto: nella cellula esistono

delle proteine che si legano al DNA non per la sua sequenza ma perché è metilata

metil binding protein. Se il gene non è metilato il FT si lega, se gene è metilato

à

i gruppi metilici attirano queste proteine e quindi bloccano il sito. Si chiama

meccanismo indiretto perché richiede delle proteine che bloccano. Lo dimostra

ancora con ritardo elettroforetico trova la MeCP2 che è una proteina con un

à

dominio di binding al DNA metilato che è come un dominio di un FT: se o togli dal

contesto rimane la possibilità d legarsi al DNA + ha un altro dominio che si chiama

TRD che è un dominio di repressione trascrizionale. Quindi questa proteina non

ha quindi specificità di sequenza. È una proteina molto presente nel cervello.

MeCP2 è in realtà il capostipite di una famiglia di proteine che hanno tutte il dominio di MBD (metil binding

domain) + hanno un dominio di repressione trascrizionale, si legano e reprimono la trascrizione. Esiste

comunque il meccanismo diretto ma prevale il meccanismo indiretto. FATTORE NUCLEARE ABBONDANTE, IN GENERE È

CONSIDERATO UBIQUITARIO. GRAZIE AL MBD LEGA ANCHE UN SINGOLO DINUCLEOTIDE CpG SIMMETRICAMENTE METILATO. NON HA SPECIFICITÀ

DI SEQUENZA. IL TRD REPRIME LA TRASCRIZIONE SE PORTATO ARTIFICIALMENTE SUL DNA (GAL4-TRD). LA SUA IMMUNOLOCALIZZAZIONE RIVELA

UNA LOCALIZZAZIONE PREVALENTEMENTE SUL DNA ETEROCROMATICO ED ALTAMENTE METILATO.

In verità il meccanismo è ancora più complicato: se gene non metilato, ft si lega ed è attivo. Se è metilato si

legano le metil binding protein che reprimono la trascrizione con due meccanismi: leggono la metilazione del

DNA che è già un meccanismo epigenetico + portano sul DNA

metilato dei fattori di rimodellamento della cromatina e quindi

fanno passare la cromatina del DNA metilato da una struttura più

aperta a una più chiusa e quindi incompatibile con la trascrizione.

Queste proteine a lato sono effettivamente dei repressori

trascrizionali.

Per capire l’importanza di queste proteine hanno fatto un topo

knockout (vedi immagine a fianco) e si è visto da che fenotipo è

affetto. Se abbiamo dei problemi nella metilazione del DNA

abbiamo grossi problemi a livello del sistema nervoso (anche se

non solo). Questo perché SN è il sistema che più risente dei

problemi trascrizionali, neuroni sono finemente regolati.

In realtà buona parte del genoma è metilato ed ha anche ruolo di proteggere il genoma: se elementi

trasponibili sono metilati non si traspongono. Se cellule hanno mutazione della DMT sono molto trasposti.

Tiene silenziate sequenze parassitiche. Inoltre la metilazione avviene su una serie di sequenze altamente

ripetute: tiene regioni molto condensate e quindi fa in modo che cromosomi non si frammentino.

Metilazione del DNA per proteggerci da DNA che possono danneggiarci ma difetto è che se a volte tentiamo

di fare terapia genica, aggiungiamo DNA estraneo e dopo un po’ andiamo a metilarlo e quindi dopo un po’

terapia non funziona. Ora ci sono meccanismi che aiutano a prevenire questo fenomeno.

Se abbiamo dei difetti della metilazione allora ci sono delle malattie:

• DNA metilato può deaminare spontaneamente creando mutazioni (vedi prima)

• Pattern di metilazione non corretto e quindi se abbiamo mutazione in uno scrittore della metilazione

abbiamo delle patologie (ICF)

• Silenziamento scorretto di specifici geni che causa tumori: sono quindi dovuti a difetti genetici e

epigenetici

Difetti della metilazione del DNA nei tumori: si confronta pattern di metilazione di una cellula sana e una

tumorale. Nelle seconde ci sono due fenomeni:

Ipermetilazione del tumor suppressor gene e quindi silenziamento.

o Ipometilazione di oncogeni (ma poco diffuso) e ipometilazione delle sequenze parassitiche,

o altamente ripetute, trasposoni.

Tumore ha come caratteristiche della metilazione (quelle che insorgono prima danno il via al tumore, poi ci

sono quelle che fanno in modo che proliferi) che può essere ipometilazione e quindi genoma diventa instabile

e cellule tumorali sono aneuploidi. Il fatto di avere all’inizio del tumore delle ipometilazioni di quelle

sequenze ha il senso di avere delle instabilità cromosomali e poi dopo acquisiscono ipermetilazione dei tumor

suppressor gene che rende tumore più aggressivo.

Cura: siccome la metilazione del DNA è reversibile possiamo inibire DMT in modo da diminuire la

ipermetilazione del tumor suppressor gene e quindi di va ad alterare la crescita del tumore rallentandola,

terapia affiancata poi alle cure come la chemioterapia. Ci sono ovviamente problemi annessi perché abbiamo

ipometilazine di tutto il genoma e quindi cellula può diventare pericolosa per altre patologie. Ma questo tutte

le cure che riguardano i tumori.

Modificazione degli istoni e rimodellamento della

cromatina

Coli parte da una trascrizione basale (efficienza di trascrizione del gene

dipende dalla sequenza e dalla DNA polimerasi, no fattori trascrizionali) che

può attivare o reprimere. Da noi la trascrizione basale non esiste perché

siccome c’è la struttura della cromatina i fattori trascrizionali non riescono a

portare la RNA polimerasi sul DNA perché la cromatina reprime la trascrizione

di circa 50 volte. Quindi ci servono attivatori che attivino le 50 volte. Spesso

vogliamo che dei geni siano ancora più silenziati perché vogliamo essere sicuri

che non vengano trascritti. Quello che succede è che ci sono geni troppo

pericolosi e quini li seppelliamo sotto ulteriori starti di repressioni

aggiungendo altri strati epigenetici reprimendoli di altre 50 volte così

abbassiamo le probabilità di fare errori. L’effetto combinato della repressione

determinato dalla cromatina e dalla metilazione del DNA determina una inibizione trascrizionale di 25000

volte.

Inizialmente si pensava che nucleosomi non avessero ruolo sull’espressione genica ma che servissero solo ad

impacchettare, poi si capì che cromatina ha un ruolo nella regolazione

dell’espressione genica.

Ci sono stati vari esperimenti per capire il ruolo della cromatina

nell’espressione genica. I fattori TBP non si lega alla TATA box se questa è

associata ai nucleosomi. Come lo sappiamo:

Facendo saggio di ritardo elettroforetico ma invece che dare sonda nuda gli

diamo 146bp, li rendiamo radioattivi e con sito bersaglio del FT, lo

assembliamo in un nucleosoma che sul gel corre in una certa posizione. Nella

lane di fianco mettiamo nucleosoma + fattore trascrizionale. Fattore

trascrizionale si sa legare alla sonda se è assemblato in un nucleosoma?

Prevalentemente la risposta è negativa, la maggior parte dei FT non sanno

legarsi se sonda è assemblata in un nucleosoma. C’è un problema di

ingombro sterico.

Quindi nucleosomi sono barriera al legame dei fattori trascrizionali che

quindi non riescono a legarsi. Ma se è una barriera, è una barriera uguale

per tutti i geni? Tutti i geni sono inibiti di 50 volte dalla presenza dei

nucleosomi? È un meccanismo repressivo ma non partecipa alla regolazione

dell’espressione genica o può partecipare?

Esperimento sul lievito perché se vogliamo vedere

effetto di un gene il lievito ne ha solo due copie

quindi più facile. Fa un ceppo di lievito che non ha più

la copia endogena dell’istone H4 ma prima ne ha un

gene H4 da un plasmide regolato da un promotore

sensibile al mezzo a seconda di che

zucchero c’è nel mezzo. Quando gene è

trascritto e tradotto i nucleosomi sono

normali. Quando sposto lievito nel mezzo in cui il gene non può più essere trascritto non ho più

H4 e quindi man mano diminuiscono i nucleosomi e dopo un po’ lievito muore. Ma siccome

muore dopo 3 generazioni posso andare a vedere tra la prima e la seconda cosa succede:

struttura della cromatina è cambiata, diventa più aperta. Se mi aspetto che la cromatina sia una

barriera passiva uguale per tutti i geni allora la trascrizione di tutti i geni deve aumentare,

globale innalzamento della trascrizione. Se invece sistema non è usato da tutti i geni allora geni

sono diversamente sensibili a questa variazione. Si fa una microarray e va a comparare la

trascrizione di un ceppo che ha cromatina normale rispetto a chi ha cromatina più aperta. Trova che non è

represso tutto il genoma ma solo alcuni geni: si ha innalzamento di certi geni che in particolar modo sono

quelli regolati, non costitutivamente espressi.

La cromatina solitamente inibisce la trascrizione perché non permette ai ft di legarsi. Ma come facciamo

quindi a trascrivere il gene quando dobbiamo? Possibili soluzioni per un promotore sono diverse:

A. Si accende durante la replicazione perché i nucleosomi

vengono smantellate per permette alla DNA polimerasi di

fare replicazione. Al momento della replicazione c’è una

finestra di possibilità per trascrivere il gene perché DNA è

nudo e quindi i ft e i nucleosomi competono a chi arriva

prima. Se c’è tanto ft si riuscirà a legare prima dei nucleosomi

e quindi può scatenare la trascrizione. Se ci sono tanti

nucleosomi si legheranno i nucleosomi

B. Gene che è in una conformazione preattivata: i nucleosomi

sono posizionati in maniera tale che la TATA box è occlusa e

lo stesso per un sito di binding al ft ma esiste un sito di legame

per il ft disponibile. Arriva stimolo per cui ft viene attivato perché ft che ha una speciale

conformazione si lega al suo sito sul DNA nudo e il suo legame permette di eliminare i nucleosomi e

attivare trascrizione.

C. Abbiamo tutti i nucleosomi assemblati, arriva stimolo, un ft viene attivato e questo ft è particolare

perché sa legarsi alla sua sequenza bersaglio anche se questa è assemblata ai nucleosomi.

In tutti e 3 i casi la struttura della cromatina è stata modificata perché TBP e tutte le altre proteine possano

legarsi. Quindi istoni inibiscono la trascrizione ma ci sono questi tre meccanismi che permettono la

trascrizione dei geni in seguito al rilassamento della cromatina.

Come facciamo a cambiare la struttura della cromatina: Dobbiamo immaginare che fin dai primi momenti

dell’evoluzione eucariote l’apparato trascrizionale abbia dovuto imparare a convivere con la cromatina. Si

sono evolute ed affermate proteine capaci di alterare la struttura della cromatina e di regolarne il livello di

compattazione. Nelle nostre cellule esistono 3 modi per alterare l’accessibilità delle sequenze del DNA

alterando la struttura della cromatina:

Utilizzo di complessi di rimodellamento della cromatina ATP

v dipendenti: abbiamo dei nucleosomi e poi delle attività ATP dipendenti

(serve energia per smantellare tantissimi legami tra nucleosomi e DNA).

Fanno cose diverse su geni diversi. Ci deve essere però sempre una

subunità che idrolizza ATP. Questi complessi possono:

Possono far spostare i nucleosomi alterandone la posizione

Ø rendendo disponibile o non disponibile il gene. Quindi può

premettere o impedire la trascrizione

Nucleosoma viene portato via, viene tolto liberando un sito di

Ø binding

Modificare post tarduzionalmente gli istoni: istoni vengono modificati e questa modificazione media

v apertura della cromatina. Hanno un segnale che apre. Succede o perché io ho modificato istone e quindi

questo determina apertura della cromatina (perché interagiscono di meno) o perché ci sono delle

proteine che leggono messaggio della coda dell’istone modificata, si legano e aprono la cromatina.

Sostituire istoni con delle varianti istoniche che hanno caratteristiche strutturali e funzionali

v

Modificazioni post traduzionali degli istoni: le code sono le più accessibili alle modificazioni e quindi sono

principale bersaglio di enzimi che le modificano covalentemente. Modificazioni sono deposte da degli

scrittori e lette da dei lettori. Code possono essere:

- Acetilate: a carico di lisine (cariche positivamente, uniche che

possono essere acetilate) e l’acetilazione comporta la perdita

della carica positiva.

- Monometilate sulla lisina

- Dimetilate sulla lisina

- Trimetilate: sulla lisina

- Fosforilate: sulla serina

- Metilate sulla arginina

- Dimetilate in modo simmetrico o asimmetrico sulla arginina

Quindi code possono essere modificate in modi diversi. Ci sono diversi residui che possono essere acetilati,

altri possono essere acetilati o metilati e così via. Se

stiamo immaginando che queste modificazioni che non

avvengono in tutte contemporaneamente sono un

segnale allora abbiamo un numero di combinazione

talmente elevato che abbiamo un sacco di segnali.

C’è quindi ipotesi del codice degli istoni: a seconda di

quali modificazioni sono combinate sul quel

nucleosoma, quel nucleosoma sta dando una

informazione diversa. Quindi si possono regolare in

modo molto fine l’accessibilità del DNA, dei suoi

legami. DNA ha affinità diverse per diverse proteine a

seconda di queste modificazioni e questo porta a delle

modificazioni della cromatina diversa.

Histone modifications occur at selected residues and some of the patterns shown have been closely linked to a biological

event (for example, acetylation and transcription). Emerging evidence suggests that distinct H3 (red) and H4 (black) tail

modifications act SEQUENTIALLY or IN COMBINATION to regulate unique biological outcomes. How this hierarchy of

multiple modifications extends (depicted as 'higher-order combinations') or how distinct combinatorial sets are

established or maintained in localized regions of the chromatin fibre is not known.

I residui di arginina possono essere mono- o di-metilati ed in quest’ultimo caso possono esistere due configurazioni

alternative caratterizzate da una modificazione simmetrica o asimmetrica. La lisina può accettare uno, due o tre gruppi

metilici che portano alle corrispondenti forme mono-, di-, o tri-metilate. Attualmente sono noti 24 siti di metilazione

degli istoni (17 K e 7 R) che considerando i tre possibili modi alternativi di modificazione di ciascun residuo possono, in

linea teorica, portare a 3 x 11 diverse isoforme di metilazione. Anche se è possibile che le cellule non utilizzino tutte

queste forme, appare evidente come sia importante capire come la metilazione lavori e perché si siano evolute così

tante diverse possibili varianti.

appare chiaro come le code degli istoni rappresentino una piattaforma utile allo stabilirsi di diverse interazioni proteina-

proteina e come il risultato finale di queste interazioni sia una particolare e ben controllata attività biologica del dominio

cromatinico. In altre parole, si inizia a pen sare che le diverse combinazioni delle modificazioni degli istoni stabiliscano

un “codice” (codice istonico) che interpretato da altre proteine non istoniche, portanti specifici domini d’interazione

proteina- proteina, porta ad uniche risposte cellulari (Jenuwein and Allis, 2001).

Le modificazioni degli istoni possono anche solo modificare però quanto le code interagiscono con il DNA,

non solo con proteine diverse. Si prendono dei nucleosomi senza le code (tolgo con tripsina) e succede che

nucleosoma ora permette la trascrizione anche se non

benissimo, le code quindi partecipano alla repressione

trascrizionale, un po’ reprimono. Le code sono cariche

positivamente e libere di fluttuare e quindi abbracciano

DNA dall’esterno e quindi DNA è tutto chiuso, non può

interagire con nulla. Se acetilo le code ho tolto carica

positiva quindi code si aprono e quindi la trascrizione è

permessa. Acetilazione è attivatoria perché code non

possono più interagire. Ma non succederà mai che in

natura tutte le lisine siano acetilate, ha spinto

l’esperimento. L’esperimento fatto prevedeva che tutte

le lisine fossero acetilate ma se io ho solo due residui

acetilate non ho abbastanza aperto le code affiche effettivamente la trascrizione possa avvenire. Da qui

l’importanza di ricordare che deve esserci per forza la presenza dei lettori, da sola l’acetilazione di alcuni

residui non può permettere il distaccamento delle code degli istoni e quindi non possono da soli permettere

la trascrizione!

Tutto DNA assemblato nella cromatina quindi non può essere attivato. Possono succedere cose diverse:

immaginiamo che si lega un fattore trascrizionale che sa interagire con la iston acetil transferasi che acetila

alcuni residui e questi diventano sede di complessi di rimodellamento ATP dipendente che si lega e apre la

cromatina. Ora si può legare l’apparto trascrizionale.

Oppure: abbiamo il promotore chiuso in cromatina, gira per la cellula un fattore di rimodellamento della

cromatina ATP dipendente che in maniera random smuove un po’ i nucleosomi. Ci possono essere N scenari

possibili ma attivazione genica significa quasi sempre l’arrivo delle iston acetil transferasi e rimodellamento

ATP dipendente. Stesso la repressione è rimozione degli acetili e rimodellamento ATP dipendente.

Come si fa a sapere dove si attacca il fuso mitotico? Come fanno le fibre del fuso a leggere centromero? Su

quelle sequenze vengono poste delle varianti istoniche: istone simile alla H3 ma ha coda più lunga che

protrude dalla cromatina. Quindi solo in un punto c’è il segnale che dice che lì c’è centromero. Quindi le

varianti istoniche sono un altro modo per differenziare la cromatina. Dove cromatina deve essere tanto

trascritta ci mettono un istone H3 specifico che dice che quella regione deve essere tanto trascritta.

Molti tumori sono dovuti a errori dell’assemblaggio della cromatina uso di farmaci epigenetici.

à

Organismi modello

Un organismo modello è una specie che viene studiata per comprendere fenomeni biologici supponendo che

le informazioni ottenute possano fornire indicazioni su altri organismi. Tanto più ci avviciniamo nella scala

evolutiva a noi tanto più quello che stiamo studiando dovrebbe essere simile.

Possibile in quanto i principi biologici fondamentali sono conservati in tante specie. Vengono scelti in base

alla loro capacità di essere adattabili a manipolazione sperimentali:

Breve ciclo vitale

o Tecniche di manipolazione genetica a disposizione

o Genoma sequenziato

o Costi di “stabulazione” ridotti: stabularlo vuol idre mantenerlo negli opportuni ambienti in cui vive

o Massa critica di altri ricercatori con cui confrontare i dati

o

Possiamo avere a che fare con:

Organismi unicellulari semplici o virus possono essere usati per studiare questioni fondamentali della

biologia molecolare tipo replicazione, trascrizione e sintesi proteica;

Organismi più complessi invece sono richieste per studiare lo sviluppo.

L’utilizzo di animali in laboratorio è regolato da una direttiva che regolamenta utilizzo principalmente degli

animali più evoluti.

L’animale in laboratorio ha avuto un ruolo essenziale per la conoscenza:

- Dei fondamentali processi metabolici

- Delle funzioni fisiologiche

- Delle cause e dei meccanismi di insorgenza di molte malattie

- Di strumenti farmacologici e chirurgici utili nella terapia di molte patologie

Regola delle 3 R sull’impiego di animali nella ricerca:

- Restriction: limitazione del numero di animali

- Refinement: miglioramento delle metodologie per ridurre sofferenza e per limitare numero di

animali usati

- Replacemen: sostituzione degli animali con altri modelli biologici o computerizzati

Uomo e topo sono molto vicini e quindi la maggior parte delle cose che studiamo nel topo sono veri anche

per l’uomo. La maggior parte delle cure che funzionano nel topo non funzionano però nell’uomo per una

serie di motivi.

Poi c’è lo xenopus Laevis che è rospo, drosophila melanogaster e C. Elegans.

E. Coli

Su un terreno solido (agar – polisaccaride dalle alghe) i batteri formano colonie – una singola colonia

Possono crescere in un terreno liquido fino ad una densità

è un clone di cellule identiche; di circa 10 9

cellule/ml; I batteri sono abbastanza grandi (circa 2 per rifrangere la luce permettendo di seguire la

μm)

crescita di una coltura batterica mediante l’aumento ).

della densità ottica (OD

600

La temperatura ottimale vivi a 4°C

è 37°C; i batteri possono essere tenuti per alcune settimane o -80°C

9

In condizioni ottimali si dividono ogni 20 min: una cellula diventa circa 10 in 10

virtualmente per sempre;

ore; Curva di crescita si caratterizza per una fase lag dove batteri si adattano alle condizioni di crescita; una

fase esponenziale e una fase stazionaria (i nutrienti diventano limitanti e i batteri rilasciano metaboliti nel

terreno di crescita).

Lievito - Saccharomyces Cerevisiae

lievito della birra. Eucariote unicellulare, primo organismo di cui si nucleo

È è sequenziato il genoma,

distinto, cromosomi lineari multipli assemblati in cromatina, citoplasma dotato di organelli intracellulari tipo

mitocondri. Facile da crescere in laboratorio (t di dimezzamento di 90 min), cresce su terreno solido o liquido,

può vivere sia come aploide che come diploide. Facile da manipolare e introdurre DNA esogeno. Genoma

13x10^6 bp codificando per circa 6000 geni; Esistono 6000 ceppi ciascuno deleti

di singoli geni. Ciclo: si riproduce per gemmazione, dentro alla gemma va il DNA

e poi questa si separa.

Può essere anche aploide: se prendo ceppo diploide e lo metto in condizioni

particolari come mancanza di nutrienti, questo va incontro a meiosi quindi da

una diploide a 4 spore aploidi (sporulazione) che sono contenute in un asco. Se

io ho tolto un gene essenziale ed era 2n allora solo 2 su 4 spore vivranno perché

2 non vitali quindi posso vedere che cause hanno queste delezioni. Altrimenti le cellule aploidi possono

coniugare formando cellule diploidi. La coniugazione avviene soltanto tra cellule di diversi gruppi di

complementazione (Sesso / Mating Type).

C’è macchina che rompe asco prende spore una per una

una e

appoggiandole su una piastra in ordine, si fa crescere e si vede

cosa succede e quali spore erano dello stesso asco. Quindi cresce

aploide A ma possiamo metterlo a contatto con spora aploide

alfa e formano un individuo diploide. Il tempo di duplicazione ca

90 min. in terreno ricco e 140 min. in terreno sintetico.

Manipolare lievito è facile: può essere trasformato e quando

plasmidi entrano possono rimanere come tali o integrarsi nel

genoma. Come selezioniamo lieviti che hanno plasmide: con

marcatori per la sintesi di aa. Lievito ha dei geni per fare ogni aa

ma se mutagenizziamo questi geni non possono più crescere in

terreni che non hanno quell’aa che al lievito manca. Quindi

trasformiamo lievito e lo mettiamo in terreno ricco e cresce tutto,

poi li spostiamo in terreni in assenza ciascuno di un aa non

crescono più. Crescono solo quelle che hanno preso il plasmide.

C. Elegans

Verme cilindrico, multicellulare.. facile da modificare geneticamente. È trasparente, 1mm e si può congelare.

Ogni 3 giorni nuova progenie. Si nutre di E. Coli che possiamo mettere su piastra o habitat naturale è la terra.

Ha numero di cellule definito, sempre lo stesso numero di cellule e abbiamo imparato esattamente ogni

cellula cosa va a fare. Ha permesso di scoprire apoptosi e quindi la morte programmata. Facile da modificare

geneticamente perché mangia i plasmidi e si modifica. Difetto è che è un ramo secco dell’evoluzione. 12%

delle cellule di C. elegans sono destinati a morire mediante morte programmata apoptosi; Lo studio di

animali mutanti con eccesso/ridotto numero di cellule ha permesso di mappare i geni che controllano

l’apoptosi; Tanti di questi geni sono conservati fino all’uomo;

Drosophila melanogaster

Moscerino della frutta. Usato inizialmente da Morgan, studi genetici. Piccolo, facile da allevare, economico.

Morfologia facile da studiare; dismorfismo sessuale. Ciclo vitale breve; prole

numerosa (una femmina circa 2000 Molto utilizzato in genetica e

“figli”).

biologia dello sviluppo; mosche mutagenizzate per radiazioni o sostanze

mutagene. Collezioni di mutanti. Circa 15000 geni; genoma sequenziato (nel

1998). Circa 50% dei geni hanno omologhi nell’uomo signaling

e tanti

pathways sono conservati. 70% dei geni malattia umani hanno un omologo in

Drosophila. Studi comportamentali. Si possono comprare mutanti da

collezioni di Drosophila.

È stato molto studiato per capire che cosa andava storto. Scoperto così i geni

omeotici che sono fattori trascrizionali importantissimi per sviluppo del

nostro corpo. L’ordine è collineare a come si esprimere. Abbiamo mantenuto

lo stesso ordine.

Xenopus laevis

Rospo dove la femmina ha nell’ovaio un deposito di enorme quantità di ovociti (che sono grandi, 1.2mm) che

hanno dentro tutti i materiali utili per le prime divisioni. In questi ovocito possiamo inserire dell’mRNA che

quindi verrà tradotto e portato nella posizione giusta della cellula. Può anche trascrivere. Possiamo far

avvenire fecondazione in vitro, fecondazione sincrona e quando parte la fecondazione ce ne accorgiamo che

è avvenuta perché si mettono tutte con il polo animale verso l’alto. Si può poi vedere conseguenza

nell’individuo di quello che gli ho iniettato. La cellula uovo fecondata si divide ogni 20/30 min quindi molto

veloce, tutti gli stadi sono visibili all’occhio. Poi si arriva ai girini se non abbiamo alterato il processo vitale.

Non molto comodo per manipolazione genetica perché è tetraploide.

Zebra fish (Danio rerio)

Simile allo xenopus, tutto lo sviluppo è visibile. Facili da manipolare geneticamente.

Topo: Mus Musculus

Genoma di dimensione comparabile alle nostre, stesso numero di geni; 99% hanno un omologo nell’uomo;

alta sintenia. Stabulazione costosa; lungo tempo di generazione: 8-10 settimane. Tutto genoma sequenziato.

Molto usato in genetica; Modelli di malattia e di funzione di gene mediante la produzione di topi transgenici.

Topo transgenico: il suo genoma è stato modificato e la modificazione è ereditabile quindi presente anche

nelle cellule germinali. I libri dicono che il topo transgenico è un topo in cui è stato introdotto qualcosa

mentre il knock-out quando io gli ho tolto qualcosa. In un topo transgenico l’allele normale è presente. Ci

serve per:

- capire funzione di una proteina

- analisi delle sequenze regolatrici importanti per il controllo dell’espressione di un gene

- recupero di funzionamento di un gene difettoso (terapia genica)

Il topo knock-out: vado a distruggere l’allele normale quindi

distruggo il gene target.

Come si fanno i topi transgenici:

Femmina che abbiamo indotto ad ovulare o facciamo

fecondazione in vitro o la facciamo fecondare. Quindi

abbiamo una cellula uovo fecondata, la teniamo ferma e

vedo il pronucleo maschile in cui inietto il DNA di interesse.

Allora siccome lo do in forma lineare è molto probabile che

venga integrato nel genoma in qualunque punto. Adesso si

impianta la cellula uovo nell’ovidotto di una madre surrogata

che abbiamo trattato con ormoni che l’ha resta tale da poter

accettare questa cellula uovo e far si che questa si impianti. Se va bene l’embrione si impianta e si forma un

individuo che ha integrato il DNA nel suo genoma. Dato che può inerirsi ovunque può essere che vada in una

regione eterocromatica quindi poco trascritta. Poi bisogna capire quali degli individui che nascono sono

transgenici. Noi abbiamo preso cellula uovo da coppia di topi con pelliccia bianca e la madre surrogata ha

pelliccia nera. I piccoli che nascono sono bianchi per

forza. Ora vado a tagliare un piccolo pezzo di coda, si

estrae DNA e si fa PCR con primer del frammento che

abbiamo inserito e andiamo a veder chi lo ha. Poi li si

incrociano tra loro e vediamo se le era anche nelle

cellule germinali. Problema è che i diversi topini

possono aver integrato frammento in punti diversi e

quindi presentare fenotipi diversi perché hanno

distrutto geni diversi. Quindi oggi prodotti

diversamente.

Oggi come si formano topi knock-in (alteriamo gene

che però continua a fare la proteina) e knock-out

(distruggiamo la f del gene): cellule staminali

embrionali e ricombinazione omologa. Topo maschio e femmina e femmina resta incinta. Sappiamo quando

embrione è in stadio di blastocisti, quindi sopprimiamo topa e prendiamo

blastocisti. Le facciamo crescere in coltura, dissociamo le sue blastocisti

in cellule singole che sono staminali embrionali e queste crescono

all’infinito. Quindi posso farle replicare o posso inserire diversi terreni di

coltura e farle differenziarle in cellule diverse.

Ora io le ho replicate e voglio distruggere un gene e per farlo devo

trasfettarle, devo inserire in queste cellule un plasmide con un costrutto

fatto ad hoc: inserisco in questo gene ad esempio un gene per la

resistenza ad un antibiotico e quindi l’ho distrutto e poi lo posso anche

selezionare mettendo antibiotico. In più ha a fianco un gene per la

timidina chinasi che aiuta a selezionare i cloni positivi. Ora trasfetto le

cellule staminali embrionali con questo plasmide e posso identificare le

cellule che hanno il plasmide perché resistente all’antibiotico. Trasfezione

stabile: fa ricombinazione e si integra nel genoma. Trasfezione transiente:

plasmide non si integra nel genoma. Noi vogliamo che il plasmide

ricombini in maniera omologa in maniera da distruggere il gene:

neomicina entra nell’allele sano e distrugge il gene ma è un evento raro

quindi lo dobbiamo selezionare. Iniziamo a coltivare sull’antibiotico e

dopo un mese sopravvivono sole le cellule che hanno ricombinato la

cassetta della neomicina quindi ci rimangono solo quelle trasfettate in

stabile. Quindi quelle che non hanno integrando il plasmide muoiono per

forza. Se c’è ricombinazione ci sono due eventi possibili:

- ricombinazione omologa: la cassetta della neomicina entra nel

gene che è quindi distrutto ma la timidina chinasi non ricombina

e quindi non entra nel genoma e la perdiamo

- ricombinazione non omologa: avviene a caso nel genoma, può avvenire che pezzi diversi del plasmide

ricombinano in punti diversi del genoma e allora abbiamo dentro tutto.

Io voglio quelle che hanno fatto ricombinazione omologa. Perdo quelle che non hanno fatto ricombinazione

perché le perdo con coltivazione su neomicina. Quelle che sono

cresciute le prendo e aggiungo farmaco che uccide cellule che

hanno la timidina chinasi e quindi ho eliminato tutte le cellule

tranne quelle che hanno fatto ricombinazione omologa. Ora

faccio esperimento per essere sicura di essere integrata nel

posto giusto: Southern Blotà se tutti i frammenti sono quelli

attesi allora è entrato dove ci aspettavamo.

Ora abbiamo le cellule staminali trasfettate in modo stabile in

modo da aver distrutto il gene. Ora dobbiamo fare il topo che

riceve le cellule: prendo le cellule staminali embrionali

geneticamente modificate e le metto nella blastocisti di un topo

fecondato wild type. Se tutto va bene le cellule staminali

modificate si mettono a partecipare alla formazione

dell’individuo che quando nasce sarà una chimera. Come faccio

a capire se le cellule hanno partecipato alla formazione

dell’individuo: guardo la pelliccia. Le cellule staminali che ho

trasfettato derivano da topo che aveva mantello bianco e le

metto nella blastocisti di topo che ha mantello nero. Se nessuna delle cellule staminali partecipa alla

formazione dell’individuo i nascituri avranno pelliccia nera, in caso contrario il topo è pezzato, è una chimera.

Quanto è pezzato dipende dal numero di staminali che sono riuscite ad attecchire. Devono avere almeno il

30% della pelliccia bianca per definire il fatto che le staminali hanno partecipato alla linea germinale. L’unica

possibilità che il gene sia andato nella linea germinale è che se io rincrocio tra loro i topo devo poter riavere

un topo non wildtype, allora posso dire che è ereditabile.

Se io incrocio tra loro due eterozigoti della popolazione sarà

¼

omozigote che studierò. Se il gene è letale non nasceranno mai i piccoli

ed è un problema perché allora non posso studiare la malattia. Allora

oggi si fanno in modo diverso.

Topi condizionali: si creano degli alleli, l’allele che avevamo modificato

geneticamente invece che essere distrutto viene floxato ossia abbiamo

inserito sito di taglio per la ricombinasi che invece che distruggere il

gene, fa ricombinazione omologa tra i due siti e taglia. Quindi abbiamo

gene floxato, gene funziona. Ha allele floxato su uno o entrami gli alleli

ma quando lo incrociamo con un topo che esprime la Cre recombinasi

(ce ne sono di tutti i tipi): se ha cre recombinasi muscolo specifica,

nascerà un topo che ha gene wild type in tutte le cellule tranne nel

muscolo che è knock out, qui il gene è distrutto. Posso quindi capire

ruolo del gene nel muscolo. Stesso per i linfociti T come nell’esempio,

cre recombinasi solo nei linfociti T dove il gene viene distrutto e quindi

capsico ruolo del gene nei linfociti T. Posso decidere quando spegnere

il gene mettendo una cre recombinasi ad esempio che si attiva solo

nell’adulto o alla blastulazione ecc. Si comprano topi che hanno le Cre recombiansi che vogliamo.

Maturazione dell’RNA

È raro che un trascritto sia il prodotto finale, quello che succede è che il trascritto primario viene processato

in maniera diversa per ottenere il trascritto maturo a seconda della funzione che deve svolgere. Ci sono vari

tipi di processamento:

- Splicing

- Tagli

- Modificazioni chimiche

RNA batterici vengono in genere meno processati. In genere quasi tutte le molecole di RNA sono processate,

poi a volte possiamo anche trovarli negli organismi inferiori. Negli eucarioti il processamento dell’RNA di

classe II ha spesso un ruolo regolativo, mentre per gli rRNA e i tRNA le modificazioni migliorano le funzioni

delle stesse molecole.

Il processamento può essere suddiviso in due sottogruppi:

Taglio:

Ø RNA più lungo del prodotto finale, poi

§ ribonucleasi che processano estremità del

trascritto e le accorciano.

Oppure due molecole A e B e quindi enzimi li

§ tagliano.

Oppure taglio e unione come eliminazione

§ degli introni

Alterazione delle basi:

Ø Modificazione della base (es da guanina a

§ guanina metilata come nel CAP) la cui funzione

presunta è quella di rafforzare stabilità del trascritto e renderlo più funzionale.

Gene da un trascritto ma se sequenziamo il trascritto scopriamo che questo è in qualche modo

§ cambiato: RNA editing. Quindi possiamo avere da un gene due trascritti: uno normale e uno

editing. Solitamente A convertita in U o U convertito in C. Da queste variazioni possiamo

ottenere di tutto: proteina non funzionante, parzialmente funzionante ecc

Oppure inserzione/rimozione di basi

§ RNA ha già tutte le informazioni per gli RNA ribosomiali e questo è il pre-

RNA con anche dei geni per tRNA. Poi ribonucleasi tagliano e vengono

prodotte tre molecole di rRNA non ancora mature parte attività

à

esonucleasica che toglie estremità e abbiamo rRNA maturi

Processamento degli rRNA negli eucarioti: RNA ribosomiali viene

trascritto come unica unità poi per avere

un trascritto maturo c’è bisogno di

esonucleasi ed endonucleasi che

cremino. Non hanno introni gli rRNA, non

c’è splicing, c’è solo cutting e creaming.

Anche tRNA non prodotta come molecola

matura: ha info più lunga al 3’ e 5’ e ha

anche una sequenza intronica quindi va

incontro ad uno splicing: viene eliminata

la sequenza e poi viene congiunta. Poi

tRNA non ancora maturo: aggiunta di una sequenza CCA all’estremità 3’

deposta da un enzima specifico che li sintetizza e li aggancia al 3’OH senza

bisogno di nessun templato. Quindi ora tRNA ripiegato nella maniera giusta, non ha introne e ha CCA. Poi ci

sono delle basi che vengono modificate chimicamente, è la molecola di RNA più modificata.

Per i geni che codificano per proteine: trascrizione accoppiata a traduzione nei

procarioti quindi al trascritto subito si agganciano i ribosomi che iniziano a tradurre.

Quindi se si legano subito non c’è spazio per modificare la trascrizione. Può variare

però la lunghezza del trascritto a carico di un esosoma. La vita media di un trascritto

in un procariote (quanto ci vuole perché il 50% di quella molecola venga degradata) è

molto breve, i procarioti non regolano molto quanto può rimanere il trascritto nella

cellula mentre gli eucarioti si, i trascritti possono durare più tempo ed essere tradotto più volte.

Maturazione dell’mRNA negli eucarioti: più complesso perché c’è un nucleo. Nel nucleo possono succedere

tante cose prima che trascritto vada nel citoplasma. Gli viene messo un Cap al 5’,

rimossi introni e coda di PolyA al 3’. Allora può uscire dal nucleo. Se non ha subito

tutte le modificazioni, l’mRNA non passa nel citoplasma. Nel citoplasma verrà

tradotto e quando deve essere degradato la degradazione parte dalla PolyA.

Esistono diversi Cap, più importante è GTP legato al 5’P del trascritto con legame

5’-5’ trifosfato.

Trascrizione con esoni e introni e segnale per mettere la coda processamento:

à

Cap: legata una guanosina trifosfata al 5’ (non sapere che ce ne sono diversi

§

tipi) Rimossi introni quindi rimane parte codificante

§ Coda di PolyA: lunga da 80 a 250 nucleotidi

§

Cap serve a:

- Legare proteine per far si che il trascritto maturo vada dal nucleo al citoplasma. Tutte le porzioni che

hanno subito maturazione si associano a proteine grazie al Cap che indica che il trascritto è pronto

per andare nel citoplasma. Nucleo è fatto da dei pori nucleari con delle proteine che fanno il controllo

di qualità, guardano se il trascritto che arriva è maturo e pronto per andare nel citoplasma

- Proteggere RNA dalla degradazione

- Sintesi proteica: come è stato dimostrato? Lo stesso mRNA radioattivo è stato prodotto con o senza

cappuccio e assemblato in vitro ad un complesso

proteico molto efficiente per fase sintesi proteica.

Incubiamo e poi centrifughiamo su un gradiente di

saccarosio: mRNA si posiziona su un gradiente

diverso a seconda del PM prevalentemente quindi

mRNA non associato ai riposami perché non

tradotto peserà di meno quindi in cima al

gradiente. Se lo faccio vedo che la radioattività

quando ho Cap è sia in fondo alla provetta che in

alto. Se mRNA senza cappuccio, mRNA è tutto in

alto quindi i ribosomi non si sono attaccati.

Solo mRNA subiscono il capping perché enzima responsabile del capping (guaniltransferasi) riesce a mettere

il cap su un trascritto perché interagisce con la RNA polimerasi II: ha una lunga coda che è un ectapeptide

che viene diversamente fosforilato a seconda delle fasi e quindi enzima si associa a questa coda a seconda di

come è fosforilata e quindi viaggia con lei finchè inizia ad emergere RNA al di fuori dall’RNA polimerasi: allora

enzima si sposta dalla coda all’RNA e gli mette il cappuccio. Enzima non sa associarsi alle altre RNA polimerasi

perché non hanno la coda e quindi solo i trascritti di classe 2 vengono cappati.

Poliadenilazione: i fattori di poliadenilazione sono associati di nuovo alla coda carbossiterminale della RNA

polimerasi II quando fosforilata in un certo modo. La trascrizione avviene fino alla sequenza AAUAAA e

allora i fattori di poliadenilazione si staccano quando viene trascritta e si

attaccano al trascritto e questo è il segnale per iniziare a processare

l’estremità 3’ del trascritto: a questo punto portano delle endonucleasi che

tagliano poco dopo. Ora viene portata la Poliadenilato Polimerasi che

sintetizza la coda poliA sena alcun templato.

La coda di poliA serve:

- proteggere l’estremità del trascritto

- influenza il passaggio nel citoplasma e la traduzione del trascritto. Ci

sono però trascritti che non hanno la PoliA e sono comunque stabili.

Ma se non ha la coda di poliA ha delle caratteristiche specifiche che

le garantiscono di non essere degradati subito. Però mediamente i

trascritti sono fatti per avere la PoliA e se non l’hanno vengono

degradati subito senza essere tradotti.

Quindi viene tutto coordinato temporalmente a seconda della

fosforilazione della coda della polimerasi, anche lo splicing.

Splicing: La sequenza codificante di un gene è una serie di codoni

a tre nucleotidi che specificano la sequenza lineare degli

amminoacidi presenti nel prodotto polipeptidico. In genere nei

fagi e batteri questa sequenza è continua. In genere negli

eucarioti la sequenza codificante viene periodicamente interrotta

da segmenti di sequenza non codificante. Le sequenze che

rimangono nel trascritto maturo sono gli esoni mentre gli introni

sono quelli che vengono rimossi. Esoni sono quelli che non vengono rimossi dallo splicing, anche 5’ e 3’ UTR

che non sono codificanti. Lo splicing è quel processo che in maniera precisa e puntuale rimuove gli introni e

congiunge tra loro gli esoni in modo da dare l’mRNA maturo da tradurre. Deve essere estremamente preciso.

Come è stato scoperto:

se diamo una radiomarcatura veloce, vado a vedere la marcatura che trovo nel nucleo e la marcatura che

trovo nel citoplasma. Una enorme quantità di RNA non passa nel citoplasma. Quindi si è iniziato a pensare

che doveva esserci una degradazione nel nucleo. Ma cos’è questo RNA che viene degradato (oltre all’RNA

non corretto)? Poco dopo viene fatto esperimento di ibridazione degli acidi nucleici e analisi su griglia di

microscopia elettronica: Presa una sonda identica a RNA maturo (es. cDNA della

miosina), lo rendo radioattivo e lo vado ad ibridare con il genoma in modo tale che

vada a riconoscere la sua sequenza complementare. Al microscopio elettronico si

vede che troviamo radioattività continua su una linea ma anche

delle anse che non sono radioattive e quindi si pensa che non

tutta l’informazione del DNA si ritrova nell’RNA maturo e

questa si ripiega a formare un’ansa perché non si può appaiare.

Quindi non c’è un appaiamento perfetto ma ci sono dei loop, quindi nel DNA c’è

dell’informazione aggiuntiva che non è presente nell’RNA maturo. Ma perché mRNA è

più corto del DNA? Ipotesi che trascrive tutto e poi taglia via quello che non serve. Per

dimostrarlo faccio una Northern sui trascritti nucleari in fase di processamento e quindi

trovo tutte le fasi intermedie. Viene fatta la Northern e l’idea è: se la RNA polimerasi

salta non devo mai trovare l’intero trascritto, ma se trascrive tutto e poi taglia devo

partire da prodotto più lungo e poi lentamente degradarlo. Si è trovato che a fronte di

un gene che doveva dare un mRNA maturo di 1.1kb si sono trovate delle bande

intermedie che erano tutti i prodotti intermedi in cui erano stati eliminati introni. Questa

è stata la prova finale che lo splicing avviene nel nucleo dalla radio marcatura, con

ibridazione si vede che DNA forma delle anse e quindi c’è dell’informazione che non

trovo nel trascritto, con Northern blot di RNA nucleari mi accorgo che trovo all’inizio molecole più grosse

(quindi RNA pol non salta da un introne all’altro) e quindi mi rendo conto che prima viene fatta una molecola

più lunga e poi introni vengono rimossi.

Si sono sequenziati tanti geni e si è andato a vedere se c’era una sequenza

ricorrente che indicava dove avveniva lo splicing. C’è un segnale ma è molto

meno specifico di quanto ci si aspettava. Un introne porta l’informazione

che deve essere eliminato: informazione è in punti fermi:

- Sito di splicing al 5’ o sito donatore che ha una sua consensus (che

va anche nell’esone)

- Sito di splicing al 3’ o sito accettore che ha una consenus che va per

un paio di nucleotidi anche nell’esone

- Sito di ramificazione che ha sempre una A in una consensus e delle

polipirimidine

Come avviene: lo splicing è un processo in cui ci sono due reazioni di

transesterificazione (disfiamo e ricreiamo due legami fosfodiesterici), no

consumo di energia (bilancio energetico è 0) quindi no consumo di ATP. Dal

punto di ramificazione, l’adenina e con OH attacca il sito donatore al fosfato

creando un legame fosfodiesterico e libera l’esone (quel legame

fosfodiesterico si rompe). Esone libero ha 3’OH libero che lega il sito

accettore al 3’ creando legame fosfodiesterico con l’esone e l’introne viene

staccato (si rompe legame fosfodiesterico tra introne ed esone 2). L’esone 1 e 2 sono legati insieme e introne

ha forma a lazzo e viene degradato. Però ho creato disordine: ho liberato introne e l’ho degradato e quindi

reazione spostata verso lo splicing. C’è un complesso enzimatico chiamato splicesoma che è un complesso di

ribonucleoproteine: non solo proteine ma dentro c’è anche RNA. 6 piccole ribonucleoproteine e altre

proteine che aiutano. Le ribonucleoproteine a cosa servono: RNA in queste ribonucleoproteine si appaiano

alla giunzione Esone-Introne e dicono allo spliceosoma qual è la giunzione in modo preciso. Questo piccolo

RNA nucleare (snRNA) lungo 100-300 nt c’è una ribonucleoproteina riconosce il sito donatore e uno il sito

accettore, introne ripiegato ed esoni vengono avvicinati così che il

processo di cui abbiamo parlato avvenga. Aiutano o catalizzano il taglio e

la giunzione dell’RNA.

All’inizio viene riconosciuto sito donatore al 5’ dal U1 e si lega. Poi altra

ribonucleoproteina U2AF che riconosce il sito di splicing al 3’, poi

riconosciuto punto di ramificazione, poi si aggiungono le altre

ribonucleoproteine, si ripiega tutto e avviene splicing.

U1 ha RNA U1 che ha una sua struttura e si appaia perfettamente con la

giunzione esone-introne (ultimi 3 nucleotidi dell’esone e i primi

dell’introne). Quindi indica in modo preciso dove avviene lo splicing al 5’.

Lo stesso vale per il 3’. Fanno posizionare in modo corretto tutto lo splicosoma.

Se io muto il sito donatore lo splicing non avviene più o avviene poco efficacemente. Appaiamento non stabile

con RNA di U1 e quindi errore di splicing: o non avviene o avviene meno efficacemente. Si provano a

correggere delle patologie fornendo delle molecole U1 modificate fatte in modo tale da appaiarsi solo al

trascritto mutante e si vede se restora lo splicing (risposta positiva). Influenza solo lo splicing di questo gene.

Di malattie nello splicing ce ne sono tantissime.

O nelle sequenze introniche o nelle esoniche ci sono delle sequenze che fanno da enancher o silencer dello

splicing. Questo ci garantisce che lo splicing avvenga nel sito che vogliamo e non in altri siti che magari hanno

sequenza simile. Le proteine Sr che riconoscono Enancher ad esempio sono essenziali per:

- assicurarci efficacia e accuratezza dello splicing

- possono essere coinvolte nello splicing alternativo

Abbiamo malattie genetiche (15%) dovute ad errori di splicing perché meccanismo non è perfettamente

controllato, non c’è una sequenza perfetta che viene riconosciuta.

Splicing alternativo: possiamo combinare in modo differenze esoni e introni. Trascritto primario può subire

diversi processamenti e quindi posso ottenere diversi prodotti dallo stesso trascritto. Un tipico gene umano

consiste di 8-10 esoni che possono essere

uniti in disposizioni diverse mediante

splicing alternativo. Almeno il 60-70% dei

geni umani è sottoposto a splicing

alternativo. Studi recenti hanno

dimostrato che oltre il 90% dei geni umani

è sottoposto a splicing alternativo. Lo

splicing alternativo rappresenta un mezzo

versatile per regolare l’espressione genica.

Negli esoni e negli introni dei pre-mRNA

esistono elementi regolatori cis-agenti. A

questi elementi si legano proteine trans-agenti che regolano lo splicing. Gli elementi regolatori cis-agenti

agiscono stimolando o inibendo lo splicing.

Ci sono degli splicing aberranti che sono causati da varianti che agiscono in cis o in trans.

Terapie che agiscono sullo splicing come la distrofia di Douchenne: gene molto lungo con tanti esoni che non

sono del tutto fondamentali. Individuo con mutazione nell’esone 50 manda la proteina fuori frame e

à

proteina viene degradata distrofia. Ma esone 49 e 51 sono in

à

frame tra loro. Quindi tecnica in cui vengono messi degli

oligonucleotidi che si appaia al sito accettore di splicing e quindi

blocca e quindi salta un esone. Proteina che manca dell’esone 50,

proteina è in frame e quindi abolisco la distrofia.

Quindi si fanno molecole antisenso che bloccano i siti di splicing.

Le mutazioni localizzate nelle regioni non codificanti, come quelle che costituiscono i siti di splicing 5’ e 3’, i

segnali di poliadenilazione o i segnali di scelta per il promotore, sono causa frequente di malattie genetiche.

Circa il 15% delle mutazioni patogeniche influenzano il corretto splicing del pre mRNA.

Spesso le mutazioni

sinonime, ma anche quelle nonsense e missense, in regioni codificanti si sono rivelate mutazioni che

influiscono sulla maturazione dell’mRNA. Queste infatti possono:

creare nuovi siti di splicing

rafforzare siti di

splicing criptici

provocare cambiamenti del processo di polimerizzazione che può alterare la scelta dei siti di

splicing.

Editing dell’RNA:

- Come lo splicing l’editing dell’RNA può aumentare la

capacità di sintesi del genoma attraverso la creazione di

un mRNA non direttamente codificato dal DNA.

- A differenza dello splicing l’editing appare un meccanismo

insorto di recente nell’evoluzione e in maniera

indipendente nei diversi gruppi di organismi.

2 tipi:

a. L’inserzione o la delezione di un nucleotide; questo

meccanismo utilizza un RNA guida come stampo.

b. La modificazione di una base che viene sostituita da una

differente.

La reazione di modificazione per inserzione o delezione è

catalizzata

dall’editosoma,

un complesso di almeno 16 proteine.

Nei mammiferi esiste solo l’editing da C a U o da A a I. Nelle

piante è frequente C a U e U a C.

Sintesi proteica

Processo mediante il quale l’informazione contenuta nella sequenza nucleotidica dell’mRNA viene usata per

generare una proteina. È uno dei processi più conservati tra gli organismi. Ha un elevatissimo dispendio

energetica (es. Coli sintesi proteica usa fino 80% del bilancio energetico della cellula). Serve azione coordinata

di più di 100 proteine diverse.

Vuol dire formare legami peptidici: condensazione ed eliminazione di una molecola d’acqua tra carbossilico

dell’aa e gruppo amminico dell’aa successivo. La sintesi procede da estremità amino-terminale alla carbossi-

terminale.

Componenti della traduzione:

mRNA

Ø tRNA

Ø Ribosomi

Ø Amminoacidi

Ø Amminoacil-tRNA sintetasi

Ø Fonte di energia (ATP,GTP)

Ø Fattori di inizio, allungamento e di rilascio

Ø

Perché tRNA è stato scoperto? Quando Watson e Crick hanno scoperto la doppia elica, questa aveva in se la

possibilità di replicare. Ma qual è collegamento tra mRNA a proteina? Introno agli anni 60 Crick capendo che

non può mRNA direttamente dettare la sequenza della proteina ipotizza che gli aa si attaccano ad una

molecola adattatrice che sa leggere la sequenza nucleotidica.

Poi segue scoperta che gli aa prima di entrare nelle proteine sono attaccati ad una classe di RNA che

rappresenta il 15% dell’RNA totale (RNA transfer). tRNA si appaia e legge.

tRNA: molecola che viene definita a trifoglio, piccole (60-100 nucleotidi), 3 braccia tipiche con loop + 1 braccio

senza loop. Braccio dell’anticodone crea legami idrogeno con

codone e quindi di fatto legge info genetica. All’estremità

opposta c’è braccio dell’aa: ha le estremità 3’, sequenza CCA

che viene deposta da un enzima e all’A finale viene legato

l’aa. Ci sono una serie di basi che possono essere modificate,

tante basi modificate. Anticodone e aa sono molto lontani,

massima lontananza possibile. Le modificazioni di queste basi

prese una alla volta non è essenziale ma se facciamo in vitro

e non ci sono modificazioni il tRNA non è funzionale. Le

modificazioni quindi nel loro insieme servono per la struttura

del tRNA e per far riconoscere tRNA alla amminoacil tRNA

sintetasi che carica l’aa.

tRNA deve leggere i diversi codoni del codice genetico:

triplette, abbiamo 20 aa. Se abbiamo 4 basi abbiamo 64 basi possibili e quindi 64 codoni. AUG codifica per

la Metionina ed è il codone di inizio. Quella metionina non è detto che sia inclusa nella proteina. Se è

all’interno del corpo del gene codifica sempre per la metionina. Poi ci sono i codoni di stop (UAA, UAG, UGA).

Restano 61 codoni per gli altri 19 aa (metionina ha solo un codione), quindi più codoni specificano per uno

stesso aa codice genetico è degenerato: ad ogni aa non corrisponde necessariamente un solo codone. Se

à

io dico che una proteina ha Met-Phe-Ser-Tir le sequenze nucleotidiche possibili sono 1x2x6x2. Questo è il

codice migliore, non esiste un codice più intelligente: permette di

meglio assorbire le mutazioni. Qualunque mutazione sul 3

nucleotide la mutazione rimane silente, codifica per lo stesso aa.

Per la leucina anche se muta ad esempio il primo aa in U continua

ad essere leucina. Inoltre quando portano a sostituzione

amminoacidica molte volte porta ad un aa che ha proprietà simili.

Come è stato decodificato e quanti tRNA esistono (non ci

sono tRNA che leggano il codone di stop)? 61 codoni

possibili quindi per logica dovrebbero esserci 61 tRNA ma

in realtà ne abbiamo di meno: non obbligatorio di avere

un terzo nucleotide perfettamente complementare, terzo

nucleotide può vacillare. Es U può appaiarsi anche con G,

quindi no appaiamento perfetto ma è tollerato

nell’ambito del ribosoma. E quindi anche G può leggere la

U oltre alla C. inoltre se è presente una inosina sul tRNA

questa può appaiarsi con C, G o A. Il minimo numero di

tRNA sono 32-34 che sono in grado di leggere tutti i codoni.

L’informazione della sintesi proteica si trova nell’mRNA sotto forma di codoni

formati da tre nucleotidi. Open reading frame: cornice di lettura aperta.

Come è stato decifrato il nostro codice? È non sovrapposto o è sovrapposto?

Si sono usati i mutanti: indurre mutazioni nei batteriofagi e vedere le

conseguenze. Es indotto mutazione di una G che va a C: o un unico

cambiamento amminoacidico e allora non è sovrapposto o cambiano 3 aa e

allora è sovrapposto. Il codice genetico non è sovrapposto.

Il codice ha una punteggiatura? Dopo ogni codone c’è una virgola es. un

codone e inosina, un codone e inosina dove inosina è punteggiatura? Avrebbe vantaggio che a ogni evento

di inserzione o delezione non

distruggo tutta la proteina. Però non

è così, non c’è una punteggiatura.

Inducevano mutazione in

batteriofagi di inserzione o

delezione: se c’era segno di

punteggiatura effetto minore, se

non c’era andava fuori frame e

quindi effetto devastante.

Poi si cercava di decifrare il codice: è

a triplette? Piccoli oligonucleotidi di RNA con informazione nota che in vitro riuscivano a tradurre che non

aveva AUG quindi in vivo non tradurrebbe (tanto mg in provetta).

Prendono un oligonucleotide con alternanza U e C, e dicono che se

è letto a triplette allora sia se parti dal primo o dal secondo

nucleotide non varia, si ha sempre un peptide con l’alternanza di

due aa alternati. Se fosse letto a doppiette avremmo o UC o CU a

seconda che parta dalla U o dalla C e otterremo sempre un peptide

con un solo aa. La risposta è che entrano due aa alternati

dimostrando che viene letto a triplette. Quindi il codice genetico è

continuo e si legge a triplette.

Come decifriamo il codice? A volte era semplice. Se abbiamo una sequenza di

RNA specificata tutta da stesso nucleotide come U, facciamo sintesi proteica in

vitro e ogni volta diamo un aa radioattivo diverso e vediamo quale è quello che

è stato incorporato. UUU fenilalanina. Però questo lo posso fare solo per

à

pochi aa ma non sufficiente per tutto il codice.

Ma non era sufficiente a decifrare tutto il codice: Nirenberg si rende conto che

in opportune condizioni possiamo in vitro far si che ribosoma si leghi anche se si

c’è un solo codone di mRNA. E così faccio legare sopra tRNA carico con il suo aa.

Quindi fa esperimento chiamato di filter binding: imbuto con alla base un filtro

di nitrocellulosa e faccio passare soluzione che ha codoni di RNA e tRNA e non rimangono intrappolati nel

filtro. Se invece il ribosoma ha trattenuto il codone e quindi ci si è agganciato tRNA con aa radioattivo, il

ribosoma che ha tante proteine rimane attaccato al filtro di nitrocellulosa e quindi sul filtro vedo che c’è

radioattività. Se io ai ribosomi do volta per volta codoni differenti e tRNA differenti (con

aa marcato diverso es. se prima era valina ora marco leucina), man mano si decifra il

codice (non tutto, ha dovuto aggiungere informazioni derivanti dall’esperimento che

dimostrava che tRNA porta aa). Questo esperimento può essere usato anche per verificare

la proteina dove lega un filamento di RNA o DNA marcando il filamento e facendolo

passare sul filtro: se lega la proteina allora sul filtro rimane radioattività.

Ultima cosa per decifrare il codice è la domanda: è uguale per tutti? Si clonano geni

differenti per diversi organismi e si vedeva se codice veniva mantenuto. Il codice è

universale (anche se in realtà qualche organismo può avere qualche piccolo

cambiamento, ci sono delle piccole eccezioni).

La traduzione in che direzione va? ribosomi che stanno traducendo mRNA noto. Ribosoma avrà fatto

lunghezze diverse ma da questo momento in poi do una leucina radioattiva. Quindi da questo momento in

poi tutte le leucine sono radioattive e faccio andare avanti sintesi proteica. Posso aspettarmi che la maggior

parte dei ribosomi finiscano la proteina (non riniziano) e liberano la proteina nel mezzo. Centrifugo: ribosomi

vanno nel pellet e le proteine stanno nel sovranatante –> li separo e quindi prendo solo le proteine

completamente sintetizzate. Le

digerisco con degli enzimi come la

tripsina e quindi avrò vari

frammenti della proteina. Vado a

vedere questi frammenti quali

sono marcati vedendo che la

traduzione va dall’ammino-

terminale al carbossi-terminale

perché la radioattività è dalla parte

carbossi-terminale. (in realtà questo esperimento lo hanno usato per capire che ribosoma non saltava).

Ribosomi: sono dei complessi ribonucleoproteici: RNA e proteine. 2 subunità (una minore e una maggiore)

che si possono associare tra loro a dare il ribosoma integro (sia negli eucarioti che nei procarioti).

Nei procarioti:

La maggiore è 50S in cui c’è rRNA 23S e 5S e circa 30 proteine (indicate con L)

o La minore è 30S (si usa gradiente di saccarosio e picco maggiore è ribosoma integro e poi vedo gli

o altri due picchi). C’è rRNA minore che è 16S + 20 proteine

Il ribosoma intero non è 80S ma 70S perché coefficiente di sedimentazione dipende dal peso e dalla forma

quindi per il tipo di conformazione scende meno.

RNA pesa tanto nel ribosoma. Ribosoma è un ribozima, chi svolge attività catalitica è l’RNA mentre le proteine

aiutano a mantenere la giusta struttura. Senza RNA non funziona più, se togli alcune proteine funziona

ancora. È incredibilmente conservato ed è orologio molecolare: per capire quanto due specie sono vicine

confrontiamo le sequenze di geni che hanno diverse velocità di evoluzione, RNA ribosomiale ha una velocità

di evoluzione bassissima perché estremamente importante ed altamente conservato. Quindi rRNA si usa per

confrontare specie lontane evolutivamente.

Struttura del ribosoma è stata vista tramite microscopio elettronico.

Negli eucarioti:

Ribosoma completo 80S:

La maggiore è 60S che contiene tre rRNA: 5S, 28S e 5.8S e circa 50 proteine

o La minore è 40S contiene un rRNA 18S e circa 30 proteine

o

rRNA sono altamente conservati. Ribosoma ha un solco centrale dove ci passa mRNA per la sintesi proteica

e c si è accorti che vicino al sito catalitico (solco) ci sta solo rRNA, non le proteine non sono le proteine che

à

svolgono attività catalitica. RNA ribosomiale pesa tantissimo.

Ci sono due tecniche per vedere se traduzione è efficiente:

Uso della microscopia elettronica: nei procarioti si vede immagine del

Ø DNA con attaccati i ribosomi. Un gene viene trascritto e man mano

questo trascritto viene tradotto da più ribosomi uno dopo l’altro a

formare i polisomi.

Gradiente di saccarosio: posso vedere le subunità dei ribosomi e ribosomi intero. Se io metto mRNA

Ø se sintesi proteica sta avvenendo in modo efficiente si vede questo:

vanno a vedere dove trovano mRNA e trovano vari picchi: 3 picchi

sono quelli delle due subunità dei ribosomi + ribosoma completo,

gli altri picchi riguardano la quantità di ribosomi che sono legati

all’mRNA. Dove ci sono più ribosomi l’efficienza è maggiore perché

ci sono più polisomi. Se c’è una buona traduzione ci sono i polisomi,

se c’è una scarsa traduzione si vedono molto bene i 30S, 50S e 70 S

e ci sono pochi o non ci sono polisomi. È la chiava per capire la

traduzione. Gradiente di saccarosio usato anche per capire come si assemblano le divere proteine:

prendo 16S e messo la proteina small 1: si lega o non si lega? Faccio gradiente perché cambierà la

posizione nel gradiente. Continuando a vedere lo shift del gradiente hanno capito l’ordine di

assemblaggio delle proteine. Negli eucarioti non riescono a ricostruire il ribosoma in vitro.

Ribosoma ha subunità maggiore che si assembla con la minore e ci sono quindi poi 3 siti di legame per il

tRNA: tutti entrano nei tre siti tranne il tRNA iniziatore che entra solo nella P e nella E.

• Sito A: dove entra tRNA

• Sito P: c’è tRNA che ha agganciato la catena

crescente polipeptidica

• Sito E: sito di uscita del tRNA scarico

Il legame peptidico avviene a livello della subunità

maggiore: l'attività catalitica risiede nella subunità

maggiore. Nella subunità minore risiede l’attività di

decodificazione del codice. Ribosoma è

piattaforma che posiziona estremamente vicini i

due aa in modo tale da favorire il legame peptidico,

quindi favorisce una reazione che avverrebbe comunque, è un enzima.

Nomura fa esperimento:

Prende rRNA 16S e lo rende radioattivo, se lo migriamo su un gradiente di saccarosio andrà nella sua

posizione. Se aggiungiamo un’estratto che contiene diverse proteine della subunità minore e leggiamo

l’assorbanza vediamo che non c’è colocalizzazione nel gradiente quindi non si sono assemblati. Quindi manca

qualcosa che permette di assemblarsi all’rRNA. Fanno esperimento aggiungendo sostanze e vanno a vedere

che c’è colocalizzazione: S17 è

proteina essenziale perché si possano

associare.

Come avviene la traduzione:

Come tutti i processi ci sono le tre

fasi: inizio, allungamento e

terminazione.

Inizio riconoscere mRNA e

à

posizionare ribosoma in modo

corretto in modo che si leghi al

codone di inizio in modo perfetto se

no va fuori frame. Il codone di inizio

deve essere esattamente

sovrapposto con il solco P. Quindi abbiamo:

1. Fase di preinizio: sub minore che decodifica il codice si lega a mRNA in modo corretto e posiziona

codone di inizio in sito P e si lega il primo tRNA carico.

2. Si unisce ora la subunità grande e finisce la fase di inizio

Secondo aminacil tRNA si lega al sito A e si forma primo legame peptidico. Ribosoma ora si sposta di tre

nucleotidi e tRNA scarico si trova nel sito E, il tRNA con i due aa nel sito P e sito A è vuoto. Allora arriva nuovo

tRNA scarico sul sito A e si crea un nuovo legame peptidico. E così via e questa è la fase di allungamento.

Quando arrivo al codone di stop non ci sono più tRNA che leggono, fattori di rilascio entrano e si dissocia

tutto il complesso e il sistema ricicla.

Ogni passaggio della traduzione è agevolato da fattori proteici (inizio, allungamento e di terminazione) che

servono ad assicurare al processo accuratezza ed efficienza elevate. Fattori idrolizzando GTP (GTPasi)

permettono di verificare la correttezza delle interazioni tra molecole e il corretto progredire della sintesi

proteica (idrolisi di ATP); l’idrolisi porta a un cambiamento conformazionale. Altri fattori di traduzione si

legano al ribosoma al fine di prevenire interazioni inappropriate. Spesso le GTPasi assomigliano ai tRNA

(fenomeno di mimetismo molecolare).

Come viene caricato il tRNA sull’aa: il tRNA se non ha l’aa legato è detto

scarico. Se ha legato aa si parla di tRNA carico o amminoacil-tRNA. Il

caricamento è mediato da enzimi che sono le amminoacil tRNA

sintetasi che fanno si che si viene a formare un legame ricco

energeticamente tra il tRNA e l’aa che quindi poi favorirà la formazione

di un legame peptidico. L’elevata energia di questo legame è

fondamentale per la formazione del legame peptidico. Il caricamento

deve essere molto preciso perché il ribosoma accetta a scatola chiusa

qualsiasi tRNA carico. Come faccio a dirlo: preso amminoacil tRNA carico con la cisteina radioattiva che è

stato trattato con una sostanza in maniera tale da trasformare la cisteina in alanina. Il ribosoma capisce che

sta mettendo l’aa sbagliato? No non lo capisce: se faccio sintesi proteica si mette tRNA per la cisteina carico

con alanina e si vede che c’è radioattività, quindi lo incorpora. Ribosoma prende quello che i tRNA gli porta

quindi amminoaciltRNA sintetasi è importante che non facciano errori, sono enzimi che devono funzionare

alla perfezione. Quanti ne abbiamo? 64 codoni, 32 tRNA e 20 amminoacil tRNA sintetasi che quindi è specifico

per un amminoacido ma può riconoscere più tRNA. Cosa deve fare:

Riconoscere tRNA e aa e legare aa al tRNA. Aa che lega al tRNA però gli deve dare tanta energia e quindi lo

deve fare adenilare: aa va ad interagire con ATP e viene adenilato, gli viene attaccata una molecola di AMP,

si libera pirofosfato e la reazione è favorita. Quindi deve avere tasca che riconosce tRNA, una che riconosce

ATP e una che riconosce aa. Riconoscimento deve essere

super specifico e il ciclo che deve avvenire è:

1. Lega ATP

2. Lega aa

3. Libera pirofosfato e ho adenilato aa quindi si è

formato un legame ad alta energia

4. Lega tRNA

5. Agganciato aa a CCA e libero AMP

6. Ho il tRNA carico con l’aa che a questo punto se ne

va percè cambio di conformazione e quindi non è

più affine all’enzima

è tutto un gioco di cambiamento di conformazioni.

Amminoacil-tRNA sinstetasi deve riconoscere più tRNA: cosa viene riconosciuto sui tRNA e cosa sull’aa? Per

i tRNA ci sono tante regioni vicino al CCA (stelo accettore) che hanno una sequenza nucleotidica chiave per

l’amminoacil tRNA sintetasi per riconoscere il tRNA. Analogamente c’è forte riconoscimento del braccio

dell’anticodone. Discrimina tRNA a seconda della sequenza che c’è vicino a CCA e al braccio

dell’anticodone. Per quanto riguarda aa: riconosce le proprietà dell’aa (carica, idrofobicità, dimensione e

forma). Quindi facile riconoscimento per gli aa che differiscono di molto, ma ci sono alcuni aa che sono tra

loro molto simili in struttura: come fa a discriminarli? Es. fenilalanina e tirosina hanno differenza di un solo

ossidrile. Enzima per tirosina ha capacità di riconoscere ossidrile che gli da una energia di legame molto

forte rispetto alla fenilalanina. Ma questo non basta. Es tra valina e isoleucina c’è una differenza di un

gruppo metilene. La differenza di energia di legame tra le due è di circa 200 volte ma la frequenza di errore

tra valina e isoleucina è di circa 3000 volte. Cosa permette allora di selezionare così bene tra un aa e l’altro?

Un meccanismo di setaccio molecolare. Dentro all’Ammicoacil tRNA sintetasi c’è una tasca in cui si deve

allocare l’aa, questa deve avere le dimensioni giuste per avere il max di interazioni. Valina tRNA sintetasi ha

una tasca piccola, la valina ci sta alla perfezione ma isoleucina non ci sta perché gruppo sporgerebbe quindi

facile non sbagliare tra le due. Ma isoleucina ha una tasca in cui ci sta alla perfezione isoleucina ma ci sta

anche la valina. Energia di legame non giustifica la bassa frequenza di errore. Infatti enzima ha una seconda

tasca adiacente più piccola: se entra isoleucina che è giusta questa entra, si lega e rimane per un tempo

sufficiente per essere adenilata. Se entra la valina la sua forza di legame è leggermente minore perché non

c’è gruppo metilene e il tempo con cui rimane lì gli da la possibilità di scivolare nella tasca di fianco dove ci

sta ma se va lì questa tasca è idrolitica e quindi la valina viene distrutta. Quindi quello che riesce a passare

alla tasca adiacente è sbagliato, quello che rimane nella tasca giusta è giusto.

Ora abbiamo gli amminoacil-tRNA carichi. Come inizia la traduzione nei procarioti: inizio della traduzione è il

più regolato di tutti, dobbiamo iniziare dal codone

di inizio che deve essere riconosciuto in modo

estremamente esatto: ribosoma deve mettere

AUG nel sito P. La subunità piccola si lega all’mRNA

in modo da posizionare codone di inizio nel sito P e

poi entra amminoacil t-RNA carico di metionina. La

subunità maggiore ora lega sulla minore e

possiamo andare avanti. Ci sono dei fattori che

entrano in gioco: fattori di inizio. Scoperti perché

se al ribosoma piace stare insieme, o arriva come

particella unita (ma si vedeva che non era così) o

arrivano come subunità separate ma deve essere

presente un fattore che le tiene dissociate fattori di inizio. Scoperto che le particelle erano separate sia

à

mediante gradiente di saccarosio sia con esperimento: coli cresce in un

mezzo pesante e quindi le sue sub le riconosco perché sono marcate. Prendo

coli e lo metto in un mezzo leggero. Se non si separano mai le due subunità

devo ottenere dei ribosomi tutti leggeri e tutti pesanti. Se non è così devo

trovare ribosomi pesanti + leggeri + metà leggeri e metà pesanti è come

à

nel secondo caso. Si scambiano le subunità. Iniziano a purificare delle

proteine che si associano ai ribosomi. Purificazione di ribosomi su gradiente

di saccarosio che non è stata incubata con fattori di inizio che sono stati

purificati: picco 70S, poco 50S e poco 30S. la maggior parte è integro quindi.

Ora aggiungo IF1 che è uno dei 3 fattori di inizio (I sta per initiator, F per factor

e poi 1,2,3) non cambia niente quindi IF 1 non aiuta i ribosomi a stare

dissociati. Se metto IF3 è diminuito in modo drastico 70S e sono aumentati i

picchi del 50S e del 30S. Quindi il fattore IF3 è il fattore chiave per tenere

separati tra loro le subunità dei ribosomi. Quindi perché si scambino le

subunità prima si devono separare e per separarsi hanno bisogno dei fattori

di inizio se no energia vorrebbe che stessero sempre uniti. IF3 è associato alla

subunità 30S e sposta l’. Se arriva IF3 questo si lega nel sito E ed impedisce (perché cambia conformazione)

alla sub maggiore di legarsi alla sub minore. Ma IF3 non è unico fattore di inizio. Inizio abbiamo solo subunità

minore legata a IF che la tiene separata dalla maggiore ma in realtà una volta tenuta dissociata alla tasca A si

lega IF1. Ora tasca P è libera e quindi il primo amminoacil tRNA può entrare solo nella P. Ma come fa a

posizionare ora il codone di inizio nella posizione corretta? Per i procarioti il

codone di inizio è molto vicino alla sequenza di Shine-Dalgarno. Questa

sequenza che è presente nella maggior parte dei trascritti è complementare

all’rRNA 16S della sub minore. Quindi la subunità minore si ibrida alla sequenza

di S e D e quindi il codone di inizio è automaticamente posizionato in P. Ora

mRNA è perfettamente posizionato.

Il primo tRNA carico arriva però grazie a IF2. Quindi IF2 lega il tRNA iniziatore e

controlla il suo legame alla subunità 30S. La Formilmetionin-tRNA è il primo

tRNA carico che arriva a P e può solo entrare nel sito iniziatore perché se

entrasse dopo la formil metionina bloccherebbe tutta la sintesi proteica a causa

del gruppo formilico. Il gruppo formilico viene rimosso da una deformilasi

durante o dopo la sintesi proteica. Spesso le amminopeptidasi rimuovono anche

la metionina iniziale insieme ad uno o due altri aa.

Arriva IF2 che è legato al GTP quindi si riconsuma energia per far associare l

tutto, infatti: tRNA iniziatore entra nel sito P accompagnata da IF2+GTP, IF2

posizionato in modo da interagire in modo corretto con IF1, iF3 ecc cambia

conformazione, viene attivato e idrolizza GTP liberando GDP e ora si scatena

un cambio conformazionale che libera i tre fattori di inizio. Ora si può legare

50S. Quindi si chiude il ribosoma. Se tutto è entrato in modo corretto, di

questo se ne accorge IF2.

Esperimento per dimostrare come viene stimolata l’attività GTPasica di IF2:

abbiamo una sub minore con tutto legato ma IF2 ha legato GTP radioattivo e

voglio vedere e il radioattivo viene liberato. Se diamo solo IF2 non c’è

liberazione di GDP radioattivo, se diamo solo i ribosomi non si ha liberazione di nulla ma se mettiamo IF2 e

l’intero ribosoma si scatena idrolisi. Quindi se non ci fosse anche la

subunità maggiore che cerca di legarsi non si scatenerebbe l’idrolisi

da parte di IF2.

Esperimento per vedere a cosa serve idrolisi di GTP: se prendo IF2

(blu) e tRNA (rosso) che sono associati al ribosoma intero perché gli

danno una molecola di GTP non idrolizzabile, stanno forzando il

sistema. Se gli danno una molecola di GTP non idrolizzabile IF2

rimane nel complesso, ma se ha GTP normale non esiste un

complesso 70S con IF2 legato. Quindi idrolisi di GTP è funzionale al

rilascio di IF2 dal ribosoma.

Se il nostro mRNA è policistronico quello che succede è che il ribosoma si dissocia e poi si associa alla seconda

regione codificante. Solo se il codone di inizio della seconda proteina è attaccato al codone di stop della prima

proteina, il ribosoma scorre e quindi non si ha la dissociazione e riassociazione.

Negli eucarioti l’inizio è diverso e più complicato, richiede più fattori di inizio. Non abbiamo una Shine-

Dalgarno ma abbiamo un cappuccio. Quindi viene riconosciuto per primo questo cappuccio. La 40S (minore)

viaggia con i fattori di inizio (eIF), al metionin tRNA e al GTP e questi fattori di inizio gli permettono di

riconoscere e legarsi al Cap. Ora come trova ora il codone di inizio? Non è necessariamente il primo che

incontra, è l’AUG dentro ad una sequenza Kozak. Quindi deve scorrere fino a trovarla, e mentre scorre

potrebbe dover risolvere delle strutture secondarie dell’RNA: la 40S che si muove tra i suoi eIF ne ha uno che

ha attività elicasica: disfa legami ad idrogeno per risolvere queste strutture secondarie. Il fattore di inizio più

importante è eIF4F: fatto da più proteine di cui:

- G: quella su cui si attaccano le altre proteine

- E: quella che lega il Cap

- A: è la elicasi

Con la fosforilazione di eIF4F favoriamo o sfavoriamo la sintesi

proteica.

Elicasi: se abbiamo due molecole di DNA o RNA che sono unite la elicasi

le separa, scinde legami H che tengono insieme due catene di acidi

nucleici.

Sono stati fatti due oligonucleotidi di 30 nucleotidi che si possono

appaiare per gli ultimi 10 nucleotidi. Li possiamo rendere radioattivi.

Se migrano su elettroforesi migrano in un certo modo, se sono separati

migrano più velocemente. Prendiamo dimero e lo mettiamo in presenza dei fattori proteici che ci chiediamo

se sono elicasi: se lo sono devono idrolizzare ATP per funzionare. Quindi in un esperimento usiamo ATP e

eIF4A si crea un pochettino di monomero ma non significa nulla. Se ora prendiamo eIF4A, ATP e eIF4B

vediamo che eIF4B stimola attività elicasica. eIF4B è la elicasi? Metto solo eIF4B con ATP ma non succede

niente. L’attività RNA elicasi di eIF4A è stimolata da eIF4B.

Negli eucarioti il trascritto è circolare perché oltre ad avere eIF4F esiste eIF4G insieme ad altre proteine che

lega anche la coda poliA e quindi tutto viene mantenuto circolare: le estremità rimangono protette dalle

esonucleasi perché protette dalle proteine + riciclo dei ribosomi è più semplice, più efficiente traduzione.

Negli eucarioti i complessi che si vengono a formare hanno nomi diversi a seconda del coefficiente di

sedimentazione.

1. Sub 40S che si associa a eIF3 che lo tiene separato (come nei procarioti)

2. Entrano eIF2 e la metionin tRNA (prima che si agganci all’mRNA, differenza rispetto ai procarioti)

3. Si associa all’mRNA, eIF4 riconosce Cap e scansiona fino a trovare codone di inizio nella sequenza

Kozak

Allungamento: ribosoma ha nel sito P tRNA carico iniziatore. Ora deve entrare un amminoacil-tRNA carico

nel sito A, si forma legame peptidico tra i due aa: tRNA con peptide nel sito A, un tRNA scarico nel P e sito E

vuoto. Ora tRNA con peptide va nel P, lo scarico nel sito E e sito A disponibile per ingresso del nuovo aa. Tutto

velocemente. Però deve esserci controllo di qualità quindi la

sintesi proteica è compromesso tra velocità e fedeltà: ci

sono dei momenti di rallentamento in cui si controlla la

qualità. Quando Coli si accorge di un errore accelera la

sintesi proteica aggiungendo tanti errori e così manda a

degrado la sua proteina. Arriva tRNA carico successivo con

un EF-Tu associato alla GTP quindi fattore di controllo della

qualità: scambia GTP con GDP, diventa affine all’RNA ed

entra nel sito A. Ora dobbiamo essere sicuri che

appaiamento codone-anticodone sia corretto, ma abbiamo

visto che oscilla il codice, 3 codone meno preciso. 2 controlli

di qualità qui:

• Dobbiamo avere un appaiamento perfetto codone-anticodone che determina una geometria

perfetta, se non corretto è appaiamento meno stabile e geometria non perfetta. In cosa si riflette

questo: se appaiamento corretto tRNA con EF-Tu GTP hanno geometria giusta e quindi si inserisce

perfettamente in A e questo attiva idrolisi di GTP quindi abbiamo EF-Tu GDP e perde affinità per il

ribosoma e se ne va. Se l’appaiamento invece è scorretto, sistema non è esattamente inserito nella

tasca e quindi idrolisi del GTP si rallenta e quindi statisticamente ho elevata probabilità che tRNA

esca dalla tasca A prima che si sia idrolizzato il GTP.

• Il secondo passaggio di qualità: aa quando entra e viene posizionato nel sito A è orientato nella

maniera sbagliata rispetto la catena che si sta formando, non è alla distanza giusta dal peptide in

formazione perché si crei il legame. Deve avvenire un accomodamento (movimento all’interno del

ribosoma, una rotazione) e quindi ora aa è verso la catena polipeptidica e quindi può avvenire il

legame. Quando però ruota il tRNA deve essere stabilmente associato all’anticodone perché se non

lo è l’energia di legame è troppo debole e la rotazione fa uscire il tRNA, Quindi se tRNA è scorretto

questo ha energia di legame debole e quindi elevata possibilità che il sistema si sciolga nella

rotazione.

Il ribosoma è un ribozima. La formazione del legame peptidico è completamente catalizzata dall’RNA 23S.

Dimostrazioni:

i. La subunità maggiore sa formare questo legame anche se privata della maggior parte delle sue

proteine

ii. La struttura cristallografica ad alta definizione mostra l’assenza di amminoacidi a meno di 18A° dal

sito attivo (catalitico).

Come trasloca il ribosoma di un codone in modo esatto: sito E vuoto, sito P con tRNA scarico e

sito A carico. Dobbiamo fare in modo che ribosoma scorra esattamente di un codone e per farlo

ha bisogno di un altro fattore di allungamento: fattore EF-G accompagnato da GTP (quindi

consumiamo altra molecola ad alta energia), questo si infila nel sito A e spinge il tutto in avanti

fenomeno di mimetismo molecolare: Fattore di allungamento ha conformazione del tRNA

à

con il fattore di allungamento EF-Tu. Quindi si inizia a infilare e interagisce con la sub maggiore

a livello del sito A, non con RNA non può formare legame codone-anticodone. Una volta che ha

interagito idrolizza GTP, cambia conformazione e assume conformazione tale che lo fa allungare

perfettamente come tRNA-EF-Tu e prende contatto con la subunità piccola e infilandosi spinge

via il tRNA carico con il dipeptide che si sposta nel sito P, lo scarico si sposta nel sito E e la

traslocazione è avvenuta. Ora il fattore di allungamento non ha abbastanza affinità per rimanere

legato perché non interagisce con l’mRNA e se ne va. Ora sito A è libero.

Ogni volta si usa energia per controllare il processo, fino a quando incontra un codone di stop.

A questo punto per il codone di stop non c’è un tRNA, ogni tanto entra qualche tRNA ma non si

può legare perché non ha un codone simile all’anticodone. Finché entra un fattore di rilascio:

proteina che si infila e attiva l’idrolisi del polipeptide dal peptidil-tRNA ancora fenomeno di

à

mimetismo molecolare. In coli ci sono due fattori di rilascio che leggono codoni diversi. Il tutto

con giochi di cambiamenti conformazionali. Ora nel ribosoma c’è un fattore di rilascio e quindi entra un’altra

proteina che fa dissociare il tutto.

IL 40% degli antibiotici conosciuti ha come bersaglio il macchinario della traduzione: bloccano dei passaggi

della sintesi proteica dei procarioti (può esser qualunque passaggio). La nostra sintesi proteica è un po’

diversa da quella dei procarioti. Le molecole che funzionano nei procarioti hanno alta affinità per il ribosoma,

fattori di inizio ecc.. quindi non hanno alcun effetto su di noi o per avere effetti dovremmo avere

concentrazioni elevate. Procarioti sono più sensibili.

Le gentamicine permettono se le usiamo negli eucarioti di superare dei codoni di stop prematuri. Paziente

con codone di stop prematuro quindi sintesi proteina si arresta. In natura a volta i codoni di stop vengono

saltati perché entra al posto del codone di stop un tRNA coniato che introduce un aa. Se introduciamo un

tRNA coniato su un codone di stop sbagliato sarebbe un problema ma se entra nel codone di stop prematuro

se quell’aa non crea grossi problemi abbiamo risolto la patologia. Esistono antibiotico come le gentamicine

che favoriscono questo processo si re-true: se ho codone di stop prematuro e se metto gentamicina a elevate

concentrazioni il ribosoma spesso riesce a superare codone di stop e ci mette

un aa e arriva al codone di stop naturale. A volte non funziona perché elevate

concentrazioni di gentamicina sono tossiche per i reni.

Cosa succede se mRNA è sbagliato? La cellula deve difendersi da errori. Nel caso

dei procarioti abbiamo un mRNA tronco: arrivato ad un certo codone non ha più

informazione, sta stallando. Due problemi: proteina che non funziona +

ribosomi che rimangono bloccati. Coli ha risolto problema: ha creato fenomeno

di mimetismo molecolare, fa entrare molecola che si chiama tn-tRNA che

assomiglia a tRNA carico con alanina ma attaccato ha una certa informazione di

trascritto. Quando entra nel sito A porta una alanina che viene incorporata,

abbiamo traslocazione e ribosoma si trova a tradurre questa particolare

informazione del pezzo di trascritto. Questo però quando viene tradotto fa una

sorta di etichetta molecolare che dice alla cellula di coli di degradarla.

Il decadimento mediato da un non senso: negli eucarioti quando abbiamo un

trascritto che porta un codone di stop prematuro, questo spesso viene

degradato. Degradazione è mediante meccanismo di decadimento mediato da

un non senso. C’è codone di non senso non atteso e questo induce la cellula a

degradare il trascritto. Si avvale del gioco esone-introne. Normalmente il

codone di stop è sull’ultimo esone. Quando avviene lo splicing e gli esoni

vengono uniti e gli introni tolti vengono aggiunti dei complessi proteici che

segnalano che gli esoni sono stati uniti e che quindi possono essere trasferiti nel

citoplasma: complessi di giunzione dell’esone.

Questi complessi vengono eliminati dal ribosoma la prima volta che traduce.

Dopo primo giro di traduzione non ho più questi complessi. Ma questo non

succede quando abbiamo un codone di stop prematuro: ribosoma non elimina

quel complesso di giunzione perché la sintesi si è arrestata prima. La presenza

di un complesso esone-esone alla fine del primo giro di traduzione porta il

trascritto ad essere degradato e quindi abbiamo fatto solo una proteina sbagliata. Si può fare terapia che non

fa degradare la proteina perché magari la degrada quando mancano solo pochi aa e che funzionerebbe

comunque. Per certe malattie possiamo usare terapia personalizzata a seconda della mutazione del paziente.

Replicazione del DNA

Passare da una copia del DNA a due copie identiche quindi è il processo che permette di trasmettere l’info

genetica in modo preciso alle due cellule figlie. La sintesi del DNA avviene nella fase S, ma prima c’è la fase

G1che serve a produrre materiale per la sintesi del DNA. Fase G2 preparazione alla mitosi e fase M mitosi.

Quando una cellula smette di replicare il DNA è una cellula post mitotica e quindi generalmente si dice che è

nella fase G0. Tutte fasi molto controllate. Cosa succede nella fase S: Watson e Crick capiscono subito che il

modello che avevano trovato aveva una struttura tale che permettesse la duplicazione dell’info genetica.

Avendo una molecola di DNA con filamenti complementari per la regola dell’appaiamento possiamo

garantirci di formare due molecole di DNA figlie identiche.

Come viene replicato il genoma? 3 modelli possibili:

1. Modello di tipo dispersivo: le due molecole di DNA

figlie siano rappresentate su entrambi i filamenti un po’

da vecchia info e un po’ da nuova info.

2. Modello semiconservativo: un filamento fa da stampo

per la sintesi di un filamento parentale e quindi avremo

due molecole di DNA figlie ciascuna delle quali avrà un

filamento di origine paternale e un filamento di nuova

sintesi.

3. Modello conservativo: alla fine si ottengono due

molecole, una tutta parentale e l’altra tuta di nuova

sintesi.

Come hanno dimostrato che il meccanismo è semiconservativo: esperimento di Meselsohn e Stahl:

Sfruttano Coli che crescono su un terreno di tipo pesante o di tipo leggero. Quindi creano molecole di DNA

che siano tutte più pesanti perché contengono azoto 15 invece che 14. Crescere coli per tante generazioni

su azoto 15 perché i loro genomi siano tutti di tipo pesante. Se poi lo mettiamo su terreno leggero la nuova

sintesi avverrà formando un filamento leggero. Posso discriminare se genoma è di tipo pesante, leggero o ua

via di mezzo separando su gradiente di cloruro di cesio: se è pesante va in fondo alla provetta, se leggero in

alto, se intermedio starà in mezzo alla provetta. Prima si vede se Coli cresce in terreno leggero dove si

posiziona il suo genoma sul gradiente e lo stesso se cresce su terreno pesante. Dimostrato che i due genomi

possono essere separati a seconda se sono leggeri o pesanti inizia esperimento vero e proprio.

Partono da genoma tutto pesante e vedono cosa succede se trasferisco batteri su terreno leggero e cosa

succede a tempi diversi (ogni 30 min): prelievo di DNA e per ciascuno faccio gradiente e vediamo dove si

sedimentano. All’inizio il DNA è tutto pesante quindi si ritrova sul fondo della provetta. Ora:

Se è semiconservativo al ciclo successivo avremo un filamento leggero e uno pesante quindi DNA

Ø avrà una densità intermedia. Al ciclo dopo il filamento pesante darà origine ad un ibrido mentre il

leggero ad una molecola tutta leggera: devo trovare

due bande di stessa intensità (perché ho una molecola

ibrida e questa mi da una molecola leggera e una

ibrida), una a livello intermedio e una in alto mentre la

pesante sparisce. Man mano che vado avanti nei cicli

aumenta la banda leggera e diminuisce quella ibrida.

Se è conservativa al primo ciclo ne ho una pesante e

Ø una leggera e quindi permane la pesante. Ciclo

successivo rimangono le due bande ma diventerà più

spessa le leggera e man mano aumenterà sempre la

leggera.

Se è dispersivo: al primo ciclo è un ibrido tra pesante e

Ø leggero. Al ciclo successivo è ancora ibrido ma tende a spostarsi al più leggero: progressivamente

abbiamo sempre una sola banda che si sposta verso il più leggero ma non rimane la banda pesante.

Quello che si vede è che a generazione 0 DNA tutto pesante, generazione 1 DNA

si è spostato, sempre una sola banda ma si è spostata verso intermedio quindi o

conservativo o semiconservativo. Poi la banda si sposta sempre più verso la banda

leggera mentre la intermedia man mano sparisce e quindi è di tipo

semiconservativo.

Si può dimostrare in altro modo: DNA viene marcato, se si divide poi in un mezzo

che non ha marcatura avremo un cromatide marcato ed uno non marcato.

Si studia poi il meccanismo di replicazione: inizialmente tramite microscopia

elettronica e se si guarda il genoma di Coli per vedere come è la sua

replicazione. Si vede che si formano delle bolle di replicazione. Poi la

replicazione va avanti e sembra che genoma diviso in due emisferi e quando

finisce tutto è stato replicato e i due filamenti sono rimasti legati dall’ultimo

pezzettino. Allora una sola origine di replicazione in Coli ed è il punto da cui la

replicazione prende inizio. Chiamiamo forca replicativa i punti in cui i due

filamenti di DNA si aprono e il DNA viene replicato. Quindi avevano compreso

che in Coli c’è una sola origine di replicazione che poi avanza ma non ci

permette di capire se è uni o bidirezionale.

Se vediamo cosa succede negli eucarioti vediamo che non c’è una sola bolla di replicazione ma più punti dove

genoma è stato replicato e quindi parte da più origini la replicazione. Se ci fosse una sola origine di

replicazione il tempo di replicazione non sarebbe compatibile con la vita.

Se mi aspetto che la replicazione sia unidirezionale allora va avanti una forca mentre l’altra sta ferma, se

bidirezionale allora entrambe le forche si muovono. Si fanno esperimenti di pulse and chase: Pulse è un

impulso quindi qualcosa che avviene per pochissimo tempo, do per un tempo breve una grossa quantità di

uno o più deossinucleotidi trifosfati radioattivi perché dal momento in cui lo diamo questo entrerà nel DNA

e quindi dal momento in cui lo fornisco il DNA sarà radioattivo. Es 5 min e per quei 5 min avrà incorporato

nucleotidi radioattivi. Quindi si da pulse di radioattività ma le cellule stanno crescendo nel terreno radioattivo

e dobbiamo far si che statisticamente dopo 5 min smettano di incorporare deossinucleotidi radioattivi à

metto una quantità enorme di desossinucleotidi non radioattivi, freddi e questo è chase: diluisco talemente

tanto radioattivo dando nucleotidi non radioattivi che

statisticamente il DNA sintetizzato dal chase in poi sarà freddo.

Come lo fanno: durante pulse incorporano tanta radioattività ma al

momento del chase invece che fare 0 radioattività faccio poca

radioattività, es do solo le deossiadenine radioattive. Voglio vedere

segnale fortemente radioattivo seguito da segnale poco radioattivo

perché mi aspetto che nel momemnto del pulse DNA fortemente

marcato, nel momento del chase devo federe filamento un po’

meno radioattivo ma distinguibile. Se il sistema è unidirezionale

quando do pulse marco la forca di replicazione e le sue vicinanze (2-

3 min) e vedo una sola forca marcata, se è bidirezionale vedo due

forche marcate. Poi per dimostrare in che direzione vanno le forche do il chase che mi garantisce una

radioattività più blanda. Quindi quello che mi aspetto è nell’immagine sopra. Quello che vedo è che ci sono

due forche marcate e in mezzo c’è una marcatura che man mano si dirada e poi c’è la vecchia sintesi in mezzo.

Quindi abbiamo dimostrato che abbiamo due forche e che la replicazione si muove in direzioni opposte.

Oggi si possono usare fluorocromi: nel momento del pulse diamo un fluorocromo e poi facciamo la diluizione

con l’altro fluorocromo. Es. pulse rosso e chase verde. Dove c’è giallo è sovrapposizione tra rosso e verde

(quando abbiamo iniziato a fare chase incorpora ancora un po’ di radioattività quindi è mix quindi giallo)

mentre quando chase è prolungato si incorpora solo verde.

La replicazione quindi parte da una origine in Coli (da più origini negli eucarioti), generalmente è bidirezionale

ed è semiconservativa. Abbiamo fase di inizio, allungamento e terminazione:

• Inizio: devono essere riconosciute le origini ed è il meccanismo chiave. Si deve formare la bolla di

replicazione e devano essere reclutati tutti i fattori necessari alla replicazione. una origine al massimo

può essere usata una e una sola volta.

• Allungamento: polimerizzazione quindi sintesi del DNA

• Terminazione: avviene quando due forche convergenti si incontrano. Vale sia in Coli che negli

eucarioti. Differenza tra i due: nei procarioti c’è davvero una sequenza di terminazione mentre negli

eucarioti non c’è una sequenza determinata (giusto che sia così perché certe origine vengono usate

mentre altre no e quindi avremmo terminazione in posti che non sono ancora stati replicati).

Per la sintesi del DNA sono richiesti due substrati:

- I 4 dNTP’s: dATP, dCTP, dGTP, dTTP e viene incorporato il fosfato alfa.

- Innesco: estremità 3’OH su cui legare il primo legame fosfodiesterico. Quindi deve essere sintetizzato

un primer che viene sintetizzato da un enzima chiamato Primasi. Primer è piccolo segmento di RNA

complementare al DNA stampo a cui poi si

attacca la DNA polimerasi che replicherà in

direzione 5’à3’

La DNA polimerasi legge il filamento stampo in

direzione 3’->5’ dall’innesco. La sintesi procede in

direzione 5’->3’ (nuovo filamento). I nucleotidi

vengono aggiunti al 3’OH dell’innesco. Incorpora

un deossinucleotide trifosfato liberando

pirofosfato che viene scisso dalla pirofosfatasi a

dare due atomi di fosfato e questo sposta

l’equilibrio verso destra.

Problema: se la doppia elica del DNA è antiparallela ci sono 3 possibilità:

La replicazione avviene in maniera continua: ci sarà una DNA polimerasi che copia un filamento e

§ prosegue in direzione 5’->3’ ma l’altro filamento deve andare nella direzione opposta 3’->5’. Quindi

due DNA polimerasi che si mettono sui due filmanti e

partono insieme sintetizzando in direzioni opposte

Metodo sia semidiscontinuo: un enzima va in

§ direzione 5’à3’ sintetizzando in maniera continua

mentre l’altro filamento è sintetizzato a pezzettini 5’-

>3’ e poi i pezzettini vengono uniti. In entrambi i

filamenti però la sintesi va nella stessa direzione

Tutto avvenga discontinuamente: su entrambi 5’à3’

§ ma in entrambi i casi vengono fatte piccole molecole

che poi vengono unite tra loro.

Il modello giusto è quello semidiscontinuo quindi abbiamo

un filamento replicato in maniera continua 5’->3’ che è il

filamento guida o leading strand e un filamento che viene invece sintetizzato in maniera ritardato quindi si

chiama filamento ritardato o lagging strand.

Esperimento di Okazaki:

Lo hanno scoperto gli Okazaki con un esperimento in cui vengono usati ancora impulsi di radioattività perché

voglio vedere molecole che sono state sintetizzate per poco tempo. Se vedo molecole che sono state

sintetizzate per tempi via via crescenti

quello che mi aspetto è che se sintesi è

continua vedo molecole che crescono via

via sempre di più in lunghezza quando le

separo su n gradiente, se la sintesi è di

tipo discontinuo vedrò molecole che

crescono sempre più in grandezza e

molecole che rimangono piccole perché

ci sono frammenti che vanno in maniera

continua e altri frammenti più piccoli. Se

la sintesi è di tipo discontinuo non vedrò

mai il crescere della lunga molecola.

Tutto questo lo vedo solo se inibisco la

ligasi che se no legherebbe tutti i

frammenti.

Usano un fago e danno dei piccoli impulsi

di radioattività per seguire la sintesi ma inibiscono la ligasi. Ottengono quello che c’è nell’immagine. A diversi

intervalli di tempo dall’impulso vanno a separare le molecole e separano. Nell’immagine a sinistra non hanno

usato dei mutanti quindi la DNA ligasi è funzionante e a tempi diversi hanno estratto DNA e quindi si vede

che ci sono sempre corti frammenti ma man mano questi vengono uniti in un frammento grande e questo

dimostra che il metodo continuo non esiste. Nella figura a destra invece è inibita la ligasi e quindi c’è un

accumulo di piccoli frammenti di DNA marcati anche ad impulsi di marcatura più lunghi.

Come è stato scoperto che la sintesi di Dna richiede un innesco a RNA? Si è visto che se seguivamo la

replicazione del fago M13 e inibivamo con rifampicina che inibisce la sintesi di RNA allora non si aveva sintesi

di DNA. Prima evidenza che era coinvolto RNA nella replicazione. Poi si è visto che se predavamo frammenti

di Okazaki e li degradavamo con la DNAsi 1 non si degradava tutto il frammento ma veniva lasciato un

frammento di circa 10-12 basi. Questo dimostra che frammenti contengono anche RNA. E questa è la

dimostrazione che la sintesi di DNA parte dal primer che è costituito da una molecola di RNA.

La replicazione è un vecchio meccanismo quindi altamente conservato. Processo suddiviso in 3 fasi.

Mella fase di inizio origine deve essere riconosciuta da delle proteine e viene srotolata da delle Elicasi che

sono enzimi che idrolizzando ATP aprono la doppia elica del

DNA. Quindi si formano due forche replicative ad opera di

due elicasi e questo permette di svolgere il DNA in modo

tale che la replicazione possa proseguire. Il DNA a singolo

filamento non lo vogliamo mantenere così perché non è

termodinamicamente favorito quindi tende a fare

conformazioni secondarie + oggetto di enzimi che

idrolizzano DNA quindi è pericoloso lasciarlo così quindi

appena viene denaturato viene ricoperto da delle proteine

che si chiamano Single Strand Binding Protein. Poi la

Primasi depone i primer e a questo punto è finita la fase di

inizio. Dopo viene caricata sulle forche di replicazione la

DNA polimerasi che però è un enzima che potrebbe non

essere molto processivo: scorre e cade ma noi non

vogliamo questo: prima di caricare la Dna polimerasi viene caricata la Pinza scorrevole (Sliding Clamp) che è

un anello che si mette intorno al DNA che quindi non si stacca. Attaccato all’anello si attacca la DNA

polimerasi che sintetizza e se tende a staccarsi la pinza la riporta subito sul DNA e questo rende l’enzima

processivo. Arrivati al termine della replicazione: negli eucarioti quando le bolle si incontrano.

Le origini sono multiple. Si è guardato come si muovono enzimi nei diversi organismi. Vedi tabella.

Le cellule eucariotiche, avendo un genoma molto più grande di quelle procariotiche, hanno più forche

replicative sulla stessa molecola di DNA. Con una sola forca replicativa per ogni cromosoma le cellule umane

avrebbero bisogno di più di 100 ore per duplicare il loro DNA.

La replicazione in tempo limitato del DNA in un cromosoma eucariotico avviene grazie alla sua suddivisione

in tanti repliconi. L’inizio della replicazione di ciascun replicone avviene in tempi diversi. In alcuni organismi

il DNA eucromatico viene replicato prima di quello eterocromatico. Normalmente la replicazione è

bidirezionale. La dimensione degli repliconi è abbastanza ridotta: 40-100 kb (lievito e mammiferi). La

velocità è ridotta rispetto ai batteri (2000 bp/min invece di 50.000 bp/min) - probabilmente causata

dall’organizzazione del DNA in cromatina.

Per l’integrità del genoma è importante che il DNA venga replicato COMPLETAMENTE e SOLO UNA VOLTA

per ogni divisione cellulare. Questo è un problema particolare per le cellule eucariotiche perché ogni

cromosoma contiene molte origini di replicazione. Il DNA

eucromatico viene replicato nella prima fase S mentre il DNA

eterocromatico la cui cromatina è più difficile da replicare viene

replicato nella fase tardiva della fase S.

Una replicazione incompleta porta alla rottura del cromosoma

durante la segregazione.

Per assicurare che il DNA viene replicato solo una volta per ogni

divisione i replicatori attivati vengono successivamente bloccati. I

replicatori replicati passivamente vengono bloccati. La presenza di

più replicatori garantisce la completa replicazione. le origini di

replicazioni vengono attivate nella fase S da delle proteine che gli

dicono che è un’origine di replicazione e possono sparare: se

sparano poi le proteine vengono inattivate e non sparano ma

vengono coinvolte passivamente nella replicazione anche questo determina una inattivazione delle proteine.

Saggio di complementazione in vitro: DNA a singolo filamento e lo mettiamo in presenza di un estratto di

cellule wild type e facciamo avvenire la replicazione a 37 gradi o 42 gradi e quell’estratto farà replicazione e

quindi il DNA diventa a doppio filamento. Ma se abbiamo mutante termosensibile che ha mutazione in una

proteina per la replicazione a 37 gradi viene sintetizzato il nuovo filamento ma a 42 gradi no perché la

proteina non funziona. Allora prendiamo questo mutante ma all’estratto del mutante termosensibile diamo

aliquote di proteine modificate per capire quale era quella proteina mutata che mi permette di far avvenire

la replicazione. Faccio la colonna cromatografica e vedo quali frazioni contengono l’attività fino a purificare

la proteina che è stata complementata dall’estratto wild type.

Così hanno individuato le diverse proteine che servono alla replicazione:

• DNA polimerasi

• Proteine iniziatrici che riconoscono origine di replicazione

• Primasi

• Elicasi: enzima che utilizza energia libera donata dall’ATP per separare i due filamenti. La DNA elicasi

catalizza la separazione dei due filamenti di DNA

utilizzando l’energia dall’idrolisi di ATP. L’elicasi è

un’omoesamero che circonda uno dei due

filamenti di DNA formando un anello che si mette

intorno al DNA a singolo filamento. La direzione di

movimento dell’elicasi è caratteristica di ogni

particolare elicasi (direzione 5’->3’ o 3’->5’). Nella

forca replicativa l’elicasi di E.coli si muove con polarità 5’->3’ (associata al filamento lento); quella

eucariotica va in direzione opposta. Quindi sono legati su un solo filamento per bolla di replicazione

dato che vanno in una sola direzione. La DNA elicasi agisce in modo processivo, non si stacca perché

è un anello.

• Single Strand Binding Protein (SSBP): stabilizzano DNA a singolo filamento legandosi con legame

cooperativo: una volta che se ne è legata una recluta il legame anche delle altre coprendo tutto il

filamento. Stimolano le DNA polimerasi corrispondenti. Essenziali per la vitalità. Il binding copre i

legami fosfodiesterici ma lascia libere le basi che se no non sarebbero leggibili dalla DNA polimerasi

ma coprendo l’ossatura le nucleasi non accedono. Impediscono anche la formazione delle strutture

secondarie.

• Proteine come la Clamp che stimolano le DNA polimerasi e le mantengono processive

• Ligasi

• Topoisomerasi che eliminano i superavvolgimenti

Kornberg fu il primo capace di sintetizzare Dna in vitro e primo a purificare una DNA polimerasi. Purifica una

DNA polimerasi da Coli, la chiama DNA polimerasi 1 che si è pensato fosse enzima chiave ma non lo è,

modificazioni non letali. Importante per poi capire come funzionano le altre DNA polimerasi in Coli.

La DNA polimerasi I:

Sintetizza legami fosfodiesterici in direzione 5’->3’.

o Ha un’attività di correzione di bozze in direzione 3’->5’. Se ha incorporato nucleotide sbagliato torna

o indietro, ripara e poi riparte. Farebbe un errore ogni 10.000-100.000 incorporazioni in assenza di

correzione di bozze. Tasso di errore di questo passaggio è analogo quindi permettendo un errore

-10 -11

ogni 10 . Errore stimato è 10 per ulteriore meccanismo di controllo. Unendo grossa precisione

sia sistema di correzione di bozze e sistemi di riparazione di DNA passiamo ad un tasso di un

10

nucleotide sbagliato ogni 10 .

Ha un’attività esonucleasica in direzione 5’->3’. Può smangiare filamento. Fondamentale perché

o questo è l’enzima principalmente coinvolto nella riparazione del DNA e rimozione e sostituzione degli

inneschi.

Mutante di polI è vitale. Testimonia che non è l’enzima fondamentale per la replicazione.

o

La DNA polimerasi 3 che è quella fondamentale per la replicazione di Coli non ha attività esonucleasica.

La replicazione del DNA richiede magnesio, se non c’è non c’è sintesi di DNA, non avviene in presenza di

chelanti del magnesio. Magnesio è parte attiva della catalisi e sono coordinati dagli aa.

La DNA polimerasi di tipo1 viene rappresentata come una mano destra. Nel palmo c’è un foglietto beta dove

è contenuto sito catalitico. DNA viene in contatto, il pollice si piega e prende contatto con il DNA che sta

entrando e lo stabilizza. Nel sito catalitico Dna a singolo filamento e la mano è aperta, ancora non è stato

preso nucleotide da incorporare. Nella forma APERTA un

dNTP si lega al dominio dita. Nella forma CHIUSA il dominio

dita subisce cambiamento conformazionale che muove il

dNTP nella posizione di appaiamento formando una cavità

che si adatta perfettamente a un appaiamento di basi e

permette quindi la formazione del legame fosfodiesterico.

Quello che l’enzima prende prende, prende il nucleotide che

gli capita ma deve vedere che la geometria nel sito catalitico

sia quella giusta e se non lo è allora non si forma in tempo utile il legame fosfodiesterico e quindi viene sciolto

il nucleotide prima di formarlo. L’accuratezza della polimerasi si basa sul riconoscimento della forma. Tutto

va bene finché non viene incorporato il nucleotide sbagliato, allora processo si rallenta e la porzione a singolo

filamento che viene sintetizzato e che ha il nucleotide sbagliato scivola (a causa del rallentamento) in una

tasca con attività esonucleasica e viene degradata. Quindi abbiamo una porzione di enzima che è la porzione

catalitica ma anche una porzione di correzione.

Le dita causano una curvatura del DNA stampo: il ssDNA viene escluso dal palmo in modo che solo il 1°

nucleotide dello stampo viene esposto al sito catalitico. Le dita legano il dNTP per tenerlo in posizione

ottimale con il sito catalitico. Una volta formato il legame fosfodiesterico le dita si aprono permettendo il

movimento della giunzione innesco/stampo di una coppia di basi. Il pollice interagisce con il DNA

neosintetizzato e serve per stabilizzare il complesso tra DNA polimerasi e substrato aumentando il numero

di nucleotidi che possono essere aggiunti ogni volta che la polimerasi lega una giunzione innesco/stampo.

Quindi l’enzima deve discriminare nucleotide e deossinucleotide rispetto a ribonucleotide, non deve

incorporarli. Ma la concentrazione degli ribonucleotidi (rNTP)

è circa 10 volte più alta rispetto ai deossinucleoditi (dNTP),

quindi come fa? La DNA polimerasi distingue e i dNTP

vengono incorporati 1000 volte più velocemente. Il

deossinucleotide entrante deve inserirsi nel sito catalitico in

una precisa posizione. Gli rNTP non si inseriscono bene nel

sito catalitico della polimerasi grazie alla presenza del 2’OH e

il 3’OH dell’innesco non viene posizionato in vicinanza del

fosfato. Quindi ribonucleotide trifosfato non trova spazio,

non fa sufficienti iterazioni e se ne va. Per dimensione del sito catalitico discriminiamo tra deossi e ribo.

Per quello che riguarda invece la discriminazione tra A,G ecc: l’enzima non discrimina, va a vedere che la

geometria dell’appaiamento sia di tipo corretto. L’enzima usa un unico sito catalitico che non distingue tra i

4 dNTP. Riconosce le coppie di basi A:T e G:C. Solo in presenza di una corretta coppia di basi il 3’OH del

innesco è posizionato correttamente per fare il legame fosfodiesterico con l’a-fosfato del dNTP.

L’incorporazione di una coppia di basi non corretti è più lenta (10-1000 volte). Cinetica rallentata da al dNTP

scorretto il tempo di dissociarsi. Quando succede che viene incorporato nucelotide sbagliato, l’enzima è

come incastrato. Possono succedere due cose:

- Prosegue comunque, fa il legame fosfodiesterico

- Più probabile è che il 3’OH scivola nella tasca esonucleasica perché rallenta e poi si riparte.

Attività esonucleasica 3’->5’: 4 5

La DNA polimerasi incorpora nucleotidi sbagliati 1 volta ogni 10 -10 nucleotidi.

- La presenza di una coppia di basi errata cambia la geometria del 3’OH e la formazione di alcune paia di

- basi non appaiate.

Il sito attivo della DNA polimerasi (il palmo) ha bassa affinità per ssDNA;

- Un’attività 3’ esonucleasica (DELETE KEY) è associata alla DNA polimerasi e possiede un’affinità per

- l’ssDNA 10 volte maggiore del sito attivo della polimerasi;

L’ssDNA si sposta verso il sito attivo dell’esonucleasi e il nucleotide scorretto viene rimosso riportando il

- DNA ad essere correttamente appaiato spostando il 3’OH al sito attivo della polimerasi;

Importante notare che non è soltanto un’inversione delle reazioni di sintesi (non è coinvolto il PPi);

- Il sistema del “DELETE KEY”(l’esonucleasi) permette la correzione di bozze (PROOF READING)

- aumentando la fedeltà della reazione di replicazione di circa 100-1000 volte (portando gli errori a 1 errore

7

per ogni 10 nucleotidi); 10

Il DNA contiene 1 errore per circa ogni 10 nucleotidi;

- La riparazione del DNA è responsabile dell’eliminazione della maggior parte degli errori.

-

L’attività esonucleasica 5’->3’ della DNA polimerasi 1:

La DNA polimerasi I possiede entrambe le attività esonucleasiche (5’->3’ e 3’->5’); (polIII non ha attività

- 5’-3’).

L’attività 5’->3’ degrada il DNA contemporaneamente con la polimerasi poiché procedono nella stessa

- direzione;

Chiamato meccanismo di NICK TRANSLATION = SCIVOLAMENTO DELL’INTERRUZIONE. Sposta il nick:

- interruzione di un legame fosfodiesterico, enzima smangia il primer e sintetizza DNA e quindi

interruzione del legame si sposta sempre di più finchè la ligasi salda il tutto

La discontinuità nello scheletro fosfodiesterico viene spostata progressivamente lungo la lunghezza del

- filamento;

Viene ricucita dalla DNA ligasi.

- Usato per generate sonde radioattive

-

Tabella da sapere sicuramente tutte quelle dei procarioti, eucarioti vedere dopo (alfa, gamma, delta e

epsilon):

Replicazioni translesionali: enzimi che intervengono quando DNA è così danneggiato che non c’è possibilità

di recupero. Recuperano il danno a costo di mettere delle mutazioni.

Attività proofreading è tipica delle polimerasi che fanno effettivamente polimerizzazione.

Un enzima per poter svolgere attività in modo efficace deve essere processivo: sintetizza tanti legami

fosfodiesterici prima di staccarsi (fino a 50.000 basi per legame della DNA pol). La processività della DNA pol

è data da un fattore proteico (anello) che la tiene assemblata al templato.

Sliding clamp: è un anello proteico che si mette intorno al DNA a doppio filamento, lo circonda ed è affine

alla DNA pol quindi la aggancia. Negli eucarioti si chiama PCNA. Siccome l’anello è affine al DNA quando la

DNA pol tende a dissociarsi non cade dal templato perché associato allo sliding clamp o PCNA se siamo negli

eucarioti. In assenza dello sliding camp o PCNA polimerizza 20-100bp e poi si stacca, con l’anello fino a

50.000bp. Se siamo sulla lagging strand quando raggiungono fine del frammento di Okazaki ha il doppio

filamento nel sito attivo della polimerasi cambiamento conformazionale che induce DNA pol a staccarsi

à

dallo sliding clamp, la clamp non si stacca ma rimane lì per altre funzioni.

Problema: essendo anello come lo infilo? Cellule utilizzano una proteina ad hoc che è il clamp loader che

carica il clamp: è affine al punto in cui c’è un innesco attaccato al DNA e in questa posizione il caricatore della

sliding clamp interagisce con questa, la apre e la fa richiudere sul DNA. Questo richiede energia. Clamp loader

e DNA pol competono per il legame allo sliding clamp quindi se è legato uno non può legarsi l’altro.

Ordine in cui i diversi componenti si associano. Tutti i passaggi sono coordinati:

1. Le proteine iniziatrici riconoscono l’origine di replicazione e si legano. Non hanno solo compito di

riconoscere l’origine ma anche di favorire la denaturazione del DNA.

2. Ora vengono reclutate le elicasi sul DNA a singolo filamento, uno su una forca e l’altra sull’altra.

3. Elicasi iniziano a svolgere e favoriscono reclutamento delle SSBP,

primasi, della pinza scorrevole e della DNA pol.

Nei procarioti una proteina iniziatrice chiamata DnaA mentre negli eucarioti

abbiamo il complesso di riconoscimento delle origini detto ORC.

Come sono state cercate le origini di replicazione: con un saggio genetico. Se

siamo in Coli possiamo prendere plasmide che se è dentro alle cellule darà

vantaggio come la possibilità di sopravvivere all’antibiotico. Preparo un

plasmide che non ha la sua origine di replicazione e ci clono dentro tanti pezzi

del DNA di Coli frammentato in modo che possiamo rappresentare tutto il

genoma di Coli. trasformiamo Voli e poi lo inseriamo su terreno selettivo (es

ampicillina) che se crescono vuol dire che hanno ottenuto Ori. Analogamente

lo si fa nel lievito. Vediamo quali porzioni del genoma del lievito danno la

capacità al plasmide di replicarsi nel lievito e queste avranno in sé le info per

una origine di replicazione. Sono state definite così le origini di replicazione

di Coli e del lievito che si chiamano ARS: sequenze che si replicano

autonomamente, sequenze sufficienti per dare una replicazione.

I replicatori sono le origini di replicazione, quale è la sequenza sul DNA che ci

permette di replicare? Sia in Coli che nel lievito si trova che abbiamo delle

sequenze che sono quelle riconosciute da una proteina iniziatrice (DnaA o ORC

negli eucarioti) e sono in verde mentre in blu sono regioni ricche in AT che quindi si

denaturano facilmente.

Abbiamo sequenza in cis (origine di replicazione) che viene riconosciuta dalla proteina

iniziatrice che si lega. Ora lei stessa media la denaturazione del DNA in vicinanza del sito

in cui si è legata. Una volta che DNA è stato denaturato vengono portate le altre

proteine per la replicazione.

In coli diverse copie di DnaA legano OriC con legame cooperativo, se ne legano tante

copie. Ora fa assumere una conformazione al DNA che fa Tante proteine iniziatrici si

legano e fanno alterare la conformazione al DNA favorendo la formazione del complesso

aperto: favorisce la denaturazione del DNA nella regione ricca in AT. Una volta

denaturato vengono assemblati sulla stessa sequenza: caricatore (DnaC) che aiuta DNA

elicasi (DnaB) ad assemblarsi al complesso. Una volta che elicasi si è avvolta a DNA a

singolo filamento cambia conformazione, DnaC se ne va e attiva elicasi. Finito l’inizio. Le

elicasi si Coli si muovono in direzione 5’->3’. Le elicasi favoriscono ora il reclutamento

della primasi che sintetizza il primer. Una volta che il primer è stato sintetizzato ed è

arrivata la sliding clamp può arrivare l’oloenzima (DNA polimerasi 3 con tutto quello che

gli serve per sintetizzare DNA). All’inizio finché viene posto primer elicasi è associato alla

primasi, poi elicasi si sposta e si associa alla DNA polimerasi con cui camminerà. In coli

c’è una e una sola DNA polimerasi (3).

Negli eucarioti il primer non viene messo da una primasi ma da un complesso che è dato da primasi +

polimerasi alfa. Quindi all’inizio abbiamo enzima poco processivo che non ha attività di correzione di bozze

(DNA polimerasi alfa). Primasi mette primer, polimerasi alfa mette pochi nucleotidi e poi si ha uno switching

della polimerasi ed entrano le polimerasi processive.

Quini all’inizio interviene il complesso della Primasi: DNA polimerasi alfa e

primasi mettono primer a RNA (10-30 nucleotidi). Si aggancia la DNA polimerasi

alfa che inizia a sintetizzare un po’ di DNA ma poi si stacca e quindi viene

attaccata sulla sliding clamp la Dna polimerasi delta e epsilon e polimerizza fino

al frammento di Okazaki successivo. Problema. Se abbiamo una polimerasi che

sintetizza in una direzione e una che polimerizza nella direzione opposta

aumentiamo la probabilità che rimanga del DNA a singolo filamento.

In realtà le due polimerasi camminano insieme. Come fanno? L’oloenzima sono due molecole di DNA

polimerasi tenute insieme da delle proteine tau: uno sintetizza il leading e l’altro il lagging. Come fa ad

avvenire questo se i filamenti sono antiparalleli? Il DNA forma un’ansa: la lagging strand si gira su sé stessa e

quindi i due filamenti ora hanno stesso orientamento e quindi le due polimerasi possono procedere insieme.

Sulla forca replicativa c’è quindi un oloenzima:

Due molecole di DNA polimerasi 3

- Proteina tau che le tiene assieme

- Caricatore della clamp

- Sliding clamp.

-

Cosa succede però sulla lagging: incapperà nel

frammento di Okazaki successivo. Nei

procarioti siccome abbiamo doppio filamento

nel sito catalitico della DNA polimerasi cambia

conformazione e si dissocia. Se DNA

polimerasi 3 se ne va allora si lega la DNA

polimerasi 1 che ha attività 5’->3’

esonucleasica, che quindi smangia e sintetizza

e quindi smangia il primer a RNA. Arriva in

prossimità del DNA e arriva una ligasi che lega

i due frammenti di Okazaki.

Negli eucarioti: non abbiamo lo scambio della

DNA polimerasi delta ma questa incontra

frammento di Okazaki e lo spinge via

continuando a polimerizzare. Il frammento di

Okazaki si tende a scollare e assume una

conformazione tridimensionale particolare

riconosciuta da una endonucleasi che taglia.

Poi ligasi cuce i due frammenti e DNA

polimerasi 1 se ne va.

Come fa a terminare la replicazione: replicazione termina quando due forche replicative si scontrano l’una

con l’altra. Esistono dei siti di terminazione che fanno sì che la replicazione non possa

andare avanti. Nei procarioti quando siamo al termine della replicazione abbiamo due

molecole di DNA incatenate l’una all’altra ma questo non è compatibile con la

segregazione nelle due cellule figlie. Risolta dalle topoisomerasi (topoisomerasi 4 nei

procarioti) che incide il DNA su entrambi i filamenti così si apre, anello si sgancia e poi lo

fa richiudere. Senza questo enzima Coli muore. Le topoisomerasi sono degli enzimi che

sanno incidere in maniera temporanea il DNA e poi lo richiude. Esistono due classi:

• Di tipo 1: incidono un solo filamento quindi creano un nick e con una sua tirosina

rimane legata covalentemente ad una estremità mentre l’altra sua porzione della

proteina tiene l’altra estremità libera vicina. Estremità libera fa un giro attorno all’altro

filamento, poi viene richiuso e questo serve per togliere tensione. Non serve energia

perché rompe e rifà i legami. Ne esistono vari tipi e le hanno sia i procarioti che gli eucarioti. Si dice

che risolvono un superavvolgimento per ogni ciclo di azione.

• Di tipo 2: crea due nick quindi una rottura del DNA ma non diventa lineare perché associato a

entrambi le parti con la proteina come prima, tiene vicino le estremità. Anche qui poi richiude.

Risolvono due superavvolgimenti per volta. Topoisomerasi IV è di tipo 2.

Sono bersaglio dei farmaci antitumorali perché se le inibiamo la replicazione non riesce ad andare avanti.

Inibiscono topoisomerasi dopo che lei ha aperto il DNA quindi si va a creare un danno, lei non può richiudere

il DNA quindi tutto il DNA è danneggiato. Creano un continuo danno perché lei lo ha aperto il legame ma non

può richiuderlo.

Dato che l’estremità del DNA è tenuta bloccata (perché DNA organizzato in anse che sono tenute ferme)

quando io le separo il DNA si superavvolge positivamente e questi devono essere risolti se no la forca non va

più avanti. Sono suoeravvolgimenti positivi e concatenati. Coli ha anche degli enzimi che superavvolgono il

DNA chiamate Girasi.

Tabella proteine che servono per la replicazione (no fattori di

terminazione).

Negli eucarioti abbiamo problema della terminazione: cromosoma è lineare. Sul filamento di nuova sintesi

c’è primer a RNA che viene rimosso DNA ha delle regioni a singolo filamento al 5’OH quindi polimerasi non

à

può legarsi e copiare le info. Non solo il primer viene rimosso ma le sequenze vengono anche smangiate e

quindi rimane un grosso pezzo di DNA a singolo filamento. A risolvere il problema c’è la Telomerasi senza la

quale perderemmo 100-150bp alle estremità ad ogni divisioni. Le nostre cellule somatiche non hanno la

telomerasi e quindi i cromosomi si accorciano.

Abbiamo un 5’ e un portruding 3’ telomerasi aggiunge un pezzo di informazione al 3’ quindi allunga

à

estremità protrudenti al 3’. Quando abbastanza lungo può essere target per inserire

un altro frammento di Okazaki. Non sarà esattamente a estremità piatte ma noi

abbiamo aggiunto info genetica e quindi anche se poi perdiamo il pezzettino non

importa. La telomerasi è una trascrittasi inversa: usa come stampo RNA ma

polimerizza DNA. RNA lo porta lei perché al suo interno c’è molecola a RNA (TERC)

di lunghezza e sequenza variabile a seconda delle specie. RNA andrà ad appaiarsi

con estremità 3’ per qualche nucleotide ma se si appaia questo è un primer per

l’enzima che copierà informazione: usa il suo RNA per sintetizzare pezzetto di DNA

e ha aggiunto sequenze GGTTAG. Questa sequenza la ripete per diversi cicli in modo

tale che alla fine abbiamo tante ripetizioni di questo esanucleotide. Ha allungato 3’

e poi arriva frammento di Okazaki che lo riempie. La telomerasi è una DNA

polimerasi e in comune ha che ha bisogno un primer, utilizza nucleotidi trifosfati, ha

una sua processività. È diversa dalle DNA polimerasi perché non necessita di uno

stampo esogeno perché lo stampo esogeno lo porta lei e perché è una trascrittasi

inversa.

Queste sequenze telomeriche vengono riconosciute da proteine che si legano: se DNA è rotto induce sistemi

di riparazione, check point, apoptosi. Invece telomeri sono tutti riconosciuti da proteine che segnalano che

queste sono telomeri e quindi dicono che non devono essere letti come punti di rottura e generare quindi

eventi di check point ecc. I telomeri formano le anse che probabilmente promuovono la stabilità.

Cosa succede nelle cellule adulte somatiche che non hanno la telomerasi (le hanno solo le staminali e le

tumorali): progressivamente i telomeri si accorciano e si crede che il numero di cellule di divisione sia

determinato dalla lunghezza dei telomeri, ad un certo punto la cellula non può più dividersi.

Si è cercato di capire se inibendo le telomerasi davvero si può curare il cancro. È stato fatto topo knock out

per la telomerasi che a logica non dovrebbe nascere, invece e nato e solo dopo 6 generazioni si è ottenuto

un topo sterile che muore. Quindi ci sfugge qualcosa. Facendo esperimento opposto e quindi facendo

overesprimere la telomerasi: abbiamo cellule più belle, sembrano più giovani ma non sono tumorali. La

telomerasi quindi di per se non è trasformante.

Riparazione del DNA

Meccanismo che ci permette di aggiustare DNA e quindi mantenere info genetica. Nel nostro DNA si

accumulano molte mutazioni che se non vengono riparate diventano mutazioni permanenti. I danni al DNA

causano cancro ed è anche uno dei principali trattamenti per curarlo. La risposta al danno è diversa nelle

cellule tumorali. Difetti nella risposta al danno:

- Sono molto comuni nel cancro

- Promuovono la tumorigenesi

- Influenzano le terapie

Solo 1:1000 modificazioni diventano mutazioni. Le reazioni di riparazione tra le più costose in termine di

energia. In genere sfrutta la struttura a doppia elica del DNA utilizzando il filamento complementare come

stampo per ripristinare il nucleotide nel residuo originale. Esistono meccanismi di riparazione che riescono a

ristabilire la sequenza originale senza la presenza del filamento complementare. Esistono meccanismi di

riparazione che per default sono mutagenici – l’alternativa è la morte cellulare causata da un blocco della

replicazione. I processi di riparazione si sono evoluti prima della diversificazione dei differenti tipi cellulari.

Simili nei batteri, negli archei e nelle cellule eucariotiche; Studiati in dettaglio nei batteri ma spesso validi

anche in cellule eucariotiche; Cellule eucariotiche in alcuni casi hanno sviluppati altri sistemi.

Origini:

• Endogene: Polimerasi sbaglia (misincorporazione), una base viene idrolizzata o fenomeno di

ossidazione.

• Esogena: agenti chimici e fisici

Tasso di mutazione: 2400 lesioni per cellule per ora= 3x10^17 lesioni per ora nell’uomo.

Intercalanti delle basi: si infilano tra le basi e alterano la distanza delle basi creando danni durante la

replicazione: inserzioni e delezioni.

Dimeri di pirimidina: dovuto alle radiazioni solari + caffeina inibisce i sistemi di riparazione. Collegano tra

loro le basi e bloccano la replicazione del DNA che quindi non piò andare avanti.

Depurinazione: persa una base e quindi non ho più info e al momento della replicazione o metto una base

sbagliata a caso o creo una delezione

Deaminazione e alchilazione: provoca cambiamenti di basi

Tipo di mutazione:

Mutazioni puntiformi: cambia un solo nucleotide

Inserzioni e delezioni

Dna polimerasi salta o aggiunge nucleotidi quando incontra microsatelliti. DNA microsatellite:

ripetizioni di brevi sequenze di 2-4 nucleotidi (tipo CA); difficile copiare le sequenze ripetute ->

fenomeni di “scivolamento” o slippage causando alterazioni del numero di ripetizioni.

Mutazioni puntiformi

In una regione codificante vengono classificate secondo il loro effetto sulla sequenza proteica;

Ø Mutazione SILENTE/SINONIMA: una sostituzione nucleotidica produce un codone che codifica per

lo stesso amminoacido (GAA e GAG codificano tutti e due per Glutammato).

Ø Mutazione MISSENSO: sostituzione nucleotidica che specifica amminoacido diversa (GAA e CAA

codificano per Glutammato e Glutammina);

Ø Mutazione NONSENSO: la tripletta cambia da codificare per un amminoacido codifica per un codone

di STOP terminando la proteina;

Sistemi di riparazione: da sapere bene quelli in grassetto

Riparazione del mismatch: associato alla replicazione, durante la replicazione. Quando la DNA

v polimerasi ha sbagliato il nucleotide questo sistema lo aggiunge aumentando la fedeltà di circa 1000

10

volte (arrivando a fedeltà del 10 ). Deve riconoscere mutazione, togliere regione mutata e

risintetizzare partendo dal DNA stampo. Coinvolto un complesso di proteine: Mut S riconosce la

deformità dell’elica dovuta agli appaiamenti sbagliati. Quindi scorre, vede che c’è deformità, la

riconosce e vi si lega aumentando ancora di più la distorsione. Ora recluta Mut L e Mut H che sono

le proteine che servono per capire quale è filamento mutato e tagliare. Ci serve anche una elicasi per

spostare elica che deve essere digerita. Poi interviene la DNA polimerasi III

che riempie il gap. Mut L interagisce con Mut H che si lega a GATC metilata

e quando interagiscono viene stimolato il taglio e viene tagliato quello non

metilato che è il filamento di nuova sintesi. Poi arriva elicasi che spiazza il

filamento e una esonucleasi che smangia. Gap risintonizzato dalla DNA

polimerasi. C’è anche negli eucarioti, meccanismo simile ma non riconosce

metilazione del DNA, non chiaro come funziona: sulla lagging riconosce

frammenti di Okazaki, sulla leading non sappiamo cosa riconosce. È una

riparazione di tipo indiretto perché smangia e risintetizza.

Fotoriattivazione: ripara i dimeri delle pirimidine;

v Rimozione del gruppo metile generato mediante alchilazione;

v Excision repair – riparazione: una base o nucleotide viene exciso

v direttamente e sostituito utilizzando il filamento complementare come

stampo.

BER (Base excission repair): dobbiamo togliere base danneggiata e

sostituirla. È presente una U ad esempio, questa non è corretta, viene

riconosciuta da una glicosilasi che taglia la base: abbiamo una regione

abasica (senza base) che viene riconosciuta da una endonucleasi AT che

incide al 5’ e 3’ della regione abasica togliendo l’intero nucleotide e quindi

rimpiazzato da una polimerasi. Vedi immagine a fianco.

NER (Nucleotide excission repair): rimozione di tanti nucleotidi, non solo di

una base. Quando c’è grosso danno, distorsione ma non associato alla

replicazione. Distorsione riconosciuta da sistema del NER, operata una

incisione su entrambi i lati della zona danneggiata. Rimozione del

frammento inciso, polimerizzazione e ligasi.

Sintesi da translesione (error prone repair) – la DNA polimerasi inserisce

v nucleotidi non-complementari nel filamento figlio; genera mutazioni.

Recombination repair – un gap viene riempito utilizzando un altro duplex come stampo;

v Riparazione del DSB per ricombinazione – riparazione delle rotture a doppia elica che si avvale dei

v cromosomi fratelli per recuperare la sequenza originaria;

Saldatura delle estremità non omologhe (Non homologous end joining – NHEJ) – sistema di

v riparazione delle rotture a doppia elica utilizzato quando non è disponibile un cromosoma omologo;

genera mutazioni.

Metodi diretti sono quelli che intervengono direttamente modificando un nucleotide senza la rimozione e

successiva sostituzione. Es. fotoriattivazione che noi non abbiamo.

Questi meccanismi non stanno creando errori ed intervengono dove ci sono 1 o 2 basi modificate. Se si

rompono le estremità del DNA ci sono altri sistemi di riparazione che però inducono mutazione (es rimossi

dei nucleotidi). A volte si può recuperare info.

Translesione:

DNA polimerasi translesione sono delle polimerasi che sanno replicare il DNA nonostante ci sia il danno. Es.

ho tanti dimeri di timina e NER non fa in tempo a ripararli tutti. Allora sul sito danneggiato si assembla la DNA

polimerasi translesione che è molto più grossa e quindi accetta quello che gli entra, non è selettiva. Quindi

inevitabilmente induce mutazioni. No attività proofreading. La sintesi di questo enzima è indotta quando c’è

situazione di emergenza, non c’è sempre. Non è processiva quindi poi si sgancia e si riattacca DNA polimerasi.

17.11.17 - Biologia Molecolare - Pagani

NON CODING RNA

HGP ha messo in luce che solo il 2-3% del genoma umano codifica per proteine e che il 97-98%

restante sembra essere fatto da sequenze all’apparenza non codificati -> significato regolatorio.

70-80%

Esperimenti successivi hanno dimostrato che il del DNA umano è effettivamente

ncRNAs.

trascritto, anche se in larga parte non viene poi tradotto -> scoperta dei

Definizione ampliata di gene: sequenza di DNA o di RNA codificante direttamente prodotti attivi,

RNA o proteine -> ripresa la teoria degli anni ’60 secondo cui l’RNA ha anche una funzione a se

stante, non legata a DNA e proteine.

Principali ncRNAs: rRNA, tRNA, scRNA, snRNA, snRNA, siRNA, miRNA, tmRNA

SMALL ncRNAs sotto i 200 nucleotidi, LONG ncRNAs sopra i 200 nucleotidi circa.

Attività HOUSEKEEPING (rRNA, tRNA, snRNA) o REGOLATORIA per i ncRNAs

-> ex. snoRNA per trascrizione e modificazioni chimiche degli rRNA, guidano gli enzimi che

tagliano o introducono basi atipiche negli rRNA formando doppie eliche coi tratti da modificare

(più di 200 tipi di snoRNA, uno per ogni modificazione possibile).

ncRNAs codificanti sul genoma sia entro sequenze geniche con più siti di inizio trascrizione sui

due filamenti, sia entro sequenze non geniche.

siRNA

Primi ncRNAs regolatori scoperti, individuati nel tentativo di capire se aggiungere RNA antisenso

ad una preparazione cellulare servisse a rallentare la traduzione di una proteina.

Small interfering RNA, parte del sistema RNAi (RNA interference) di difesa dalle infezioni virali e

dai trasposoni -> doppie eliche di RNA per inattivare quelli dannosi

I siRNA possono sia essere prodotti all’interno della cellula, sia provenire da una fonte esogena: in

entrambi i casi, il punto di partenza è un dsRNA che viene tagliato da Dicer per isolare un tratto da

21-23bp circa (sticky ends) poi trasferito a RISC, un complesso proteico che, attraverso PAZ,

sceglie tra i due filamenti quello più instabile al 5’ e lo incorpora -> CATENA GUIDA legata da

AGO2 per riconoscere i bersagli specifici

I siRNA si appaiono sia all’RNA esogeno , sia all’mRNA, a livello di sequenze ad essi

complementari di solito poste al 3’ delle molecole bersaglio (mRNA nel 3’-UTR

-> facilitato l’appaiamento perché il 5’ del siRNA è instabile.

Quando un siRNA si appaia al suo bersaglio specifico, il complesso RISC taglia tale RNA,

inattivandolo -> sia difesa, sia degradazione di mRNA non più da tradurre

I siRNA inducono il taglio dell’RNA solo nei casi di appaiamento perfetto

-> ogni siRNA ha un bersaglio particolare

Negli eucarioti, i siRNA attivati da RNA virali vengono riconosciuti da recettori citosolici detti LTR,

che, attivati a loro volta, inducono la sintesi di INTERFERONI I come ulteriore meccanismo di

difesa dai virus (efficienza di riproduzione virale ulteriormente ridotta)

miRNA

Micro RNA, facenti anch’essi parte del sistema RNAi, prodotti a livello nucleare in trascritti simili a

quelli codificanti (cap, poliA) e ricchi di forcine e loop; lunghi 80-100 nucleotidi.

pri-miRNA processato da Drosha e DGCR8 (microprocessore) per rimuovere le porzioni ss -> pre-

miRNA trasportato fuori dal nucleo attraverso l’esportina 5 -> taglio ad opera di Dicer rimuove la

forcina -> RISC seleziona la porzione da un unico pri-miRNA, per tutto il processo di sintesi RNA

binding protein associate ai miRNA per entrare in strutture secondarie

1

miRNA perfect match: un unico bersaglio riconosciuto per degradarlo tagliandolo -> lncRNA

miRNA mismatch più bersagli riconosciuti e temporaneamente silenziati come dsRNA.

Attività dei miRNA concentrata nei P-BODIES, aree di accumulo dell’mRNA maturo -> 3’-UTR

ricco di siti di legame per i miRNA, combinazioni per inattivare gli mRNA.

Seed region sito tipico di appaiamento dei miRNA, sia mismatch, sia perfect match, 8 nucleotidi.

-> specificità di legame garantita da AGO2, che imposta il miRNA ad emelica A per rafforzare

l’interazione col bersaglio (perfect match = ingresso in AGO2 = taglio).

Siti ATIPICI oltre il Seed per il legame accessorio o obbligato di alcune classi di miRNA.

Meccanismi di inattivazione: inibizione del sito di traduzione (cap rimosso, ribosomi aperti) o della

circolarizzazione dell’mRNA, taglio dell’RNA, rimozione poliA -> mediazione enzimatica.

Circa 2000 miRN regolano il 60-70% del trascrittoma (i.e. 100 bersagli ognuno) in maniera

finemente modulata -> aumento del numero di miRNA con l’evoluzione, bersagli difficili da definire

L’errata produzione dei miRNA causa patologie: mutazioni di let-7 danno tumori (regolato da

Liu28 -> cocktail iPS), miR-122 sfruttato dal virus dell’epatite C (LNA); SNPs patologici spiegati

con miRNA difettosi (miRNA abbondanti nel DNA fragile)

-> miRNA immobili con antagonisti o con sovrabbondanza di un bersaglio (saturati)

I miRNA caratterizzano le cellule in maniera molto specifica, in particolare quelle tumorali

(espressione alterata, in caso di metastasi si riesce a trovare la fonte)

miRNA presenti in tutti i liquidi corporei, sia liberi, sia in EXOSOMI (vescicole di comunicazione)

-> miRNA utili per diagnosticare alcuni tumori

lncRNAs

Esonici, intronici, cap, poliA, parzialmente sovrapposti a geni, intergenici (Liuc), senso o

antisenso, con più segnali di traduzione ma mai tradotti, ricchi di strutture secondarie complesse.

Coinvolti nelle modificazioni epigenetiche, orientano gli enzimi responsabili di tali processi sul

DNA o inattivano geni/cromosomi essi stessi -> tripla elica dsDNA-lncRNA (solo minore), XIST e

XACT per la formazione del corpo di Barr.

Possibilità di riprogrammare le cellule data anche dai lncRNAs -> linfociti molto plastici,

importante riprogrammarli per curare patologie (T-CD4+ regolano il SI intero).

2

LABORATORIO BIOLOGIA MOLECOLARE

1° giorno [11.12.17]

Alcune cellule sono state trasfettate con il plasmide per GFP e altre cellule con un plasmide con

GFP in frame con MeCP2. Le cellule contenenti il plasmide con la fusione di MeCP2 + GFP

(pEGFPC1hMeCP2) al microscopio a fluorescenza presenza un nucleo molto colorato (verde) -> i

dot saranno molto brillanti, colorati di verde -> il citoplasma è “buio”. Le cellule contenenti solo il

plasmide GFP (pEGFPC1) si colorano totalmente -> il citosol si colora di un verde intenso.

Il plasmide pEGFPC1 è un vettore che esprime la GFP poiché contiene il cDNA della GFP situato

CMV promoter.

a valle di un promotore, che si chiama Quindi la GFP (proteina) è regolata da un

citomegalovirus,

promotore del che è un promotore che viene espresso in qualunque cellula

CMV enhancer

E. coli.

eucariotica, ma anche in È presente anche un che serve a rafforzare un

MCS

po’ l’espressione del gene quando lo si trasfetta. Al termite della EGFP (cDNA) c’è il ovvero

mutiple cloning site polylinker,

il o che è il sito in cui ci sono tanti siti unici di restrizione per cui

si può clonare all’interno un pezzo di DNA d’interesse. -> Quello che abbiamo fatto è clonare nel

MCS la sequenza che codifica per la proteina MeCP2 (è una methyl binding proteine ovvero è una

proteina che lega il DNA metilato). Questa è stata clonata in maniera tale che sia in frame: quello

che succede è che la GFP non ha codoni di stop prima del MCS, in questo modo si è creata una

proteina che è GFPMeCP2, quindi sostanzialmente la proteina MeCP2 è diventata verde

fluorescente perché ha attaccata a se la GFP (che funge dunque da tag).

Nel western blot abbiamo usato come controllo negativo la soluzione senza plasmide, quindi non

si deve vedere il segnale (ad eccezione della tubulina); abbiamo anche aggiunto uno standard

interno (normalizzatore) per la tubulina poiché questa proteina è una proteina fissa, nel senso

che non si muove e quindi la sua concentrazione non cambia (in questo caso specifico!). Lo

standard interno serve per quantificare su gel la proteina -> si usa un anticorpo anti-tubulina. Si

potrebbe aggiungere anche un controllo positivo che corrisponde alla riuscita certa

dell’esperimento eseguito separatamente.

Preparazione del gel (SDS poliacrilammide)

RUNNING GEL 10% STACKING GEL

Bidistillata H2O 4.88ml Bidistillata H2O 3.2ml

Acrilammide 40% 2.53ml Acrilammide 40% 500ml

Lower Buffer 2.6ml Upper Buffer 1.3ml

APS 10% 100µl APS 10% 5µl

TEMED 6µl TEMED 5µl

Lower Buffer = 1.5M TRIS-HCl + 0.4% SDS pH 8.8

Upper Buffer = 0.5M TRIS-HCl + 0.4% SDS pH 6.8

stacking gel

Lo è la parte superiore del gel, la cui funzione è di impaccare il campione caricato nei

pozzetti, in modo che tutti i campioni incomincino la loro separazione dallo stesso pt di partenza.

-> non ha lo scopo di separare le proteine! Contiene una bassa percentuale di acrilammide.

running gel

Il è la parte inferiore del gel, la cui funzione è quella di separare le proteine del

campione sulla base del PM.

% di acrilammide usata = 10%

In contemporanea:

Le cellule che sono state trasfettate sono le NIH3T3 che sono cellule di topo (più precisamente,

sono dei fibroblasti). La ragione per cui sono state scelte è perché nel topo l’eterocromatina fa

delle “masserelle” molto vicine fra di loro e dato che l’eterocromatina è DNA molto condensato/

compattato, in una stessa regione c’è più DNA. Se si colorano i nuclei con un colorante (quello

che useremo si chiama DAPI), questo si infila nel DNA, lo colora di blu, ovviamente se c’è più

concentrazione di DNA in certi punti ci sarà più colorante. Se si dovesse utilizzare il DAPI su

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DESCRIZIONE APPUNTO

La dispensa tratta la sintesi proteica a livello molecolare, quindi replicazione, trascrizione e traduzione. Sono inoltre trattati i meccanismi di riparazione del DNA, la descrizione degli acidi nucleici e le modalità di estrazione. La dispensa prevede la descrizione della struttura della cromatina, accenni di epigenetica e metilazione del DNA. Una parte preponderante della dispensa riguarda tutte le tecniche di blotting, elettroforesi e tecniche immunorelate, microarray e sequenziamento.


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in biotecnologie mediche
SSD:
Università: Milano - Unimi
A.A.: 2018-2019

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher francescaputti di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biologia molecolare e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Milano - Unimi o del prof Landsberger Nicoletta.

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