La funzionalizzazione superficiale attenua gli effetti biologici di MWCNT in macrofagi e cellule epiteliali

I nanomateriali e, in particolare, i nanotubi di carbonio (CNT), stanno assumendo sempre maggiore importanza in vari settori produttivi. Non è stato ancora chiarito con certezza se questi materiali siano o meno potenzialmente tossici per l’uomo. In questo senso, data anche l’elevata somiglianza morfologica con l’asbesto, negli ultimi anni sono stati condotti numerosi studi per indagare la loro tossicità sia in vivo che in vitro. Tuttavia, dal complesso di questi studi non è ancora emersa in modo definito una chiara correlazione tra caratteristiche chimico-fisiche (diametro, lunghezza, morfologia, presenza di metalli contaminanti o di gruppi funzionali superficiali, ecc.) e tossicità. A questo fine sono particolarmente utili studi in cui siano confrontate le tossicità di preparazioni di CNT che differiscano per una specifica caratteristica.
In questo lavoro di tesi vengono confrontati tre tipi di nanotubi di carbonio a parete multipla (MWCNT): MWCNT pristini (Ref1, privi di gruppi funzionali superficiali), MWCNT funzionalizzati con gruppi carbossilici (Ref2) e MWCNT funzionalizzati con gruppi amminici (Ref3). Quello che è stato indagato e che si è cercato di evidenziare nei risultati riportati in questo elaborato, è il ruolo che le diverse funzionalizzazioni dei MWCNT potrebbero avere nel determinare fenomeni di tossicità.
Data la tendenza dei MWCNT in soluzioni acquose ad aggregarsi e precipitare, in primo luogo è stata valutata la velocità di sedimentazione delle tre preparazioni, come indice indiretto di aggregazione. L’esperimento di sedimentazione ha mostrato che Ref1 sedimenta con una velocità decisamente minore rispetto a Ref2 e Ref3, indicando indirettamente che il materiale non funzionalizzato tende ad aggregarsi in misura minore rispetto alle altre due preparazioni funzionalizzate.
Per valutare gli effetti biologici dei MWCNT in vitro, come modelli cellulari sono state utilizzate cellule epiteliali alveolari umane A549 e macrofagi murini Raw264.7.
Gli endpoint biologici valutati sono stati: a) vitalità cellulare in cellule mediante il metodo della resazurina, b) Colony Forming Efficiency (CFE) assay, c) valutazione dell’espressione di marker pro-infiammatori, come la produzione di NO e l’induzione di geni pro-infiammatori (Nos2, Ptgs2 e Il6) mediante Real Time PCR, nonché d) l’interazione tra gli aggregati di MWCNT ed i macrofagi, analizzata mediante la microscopia confocale.
Tutti e tre i materiali sono risultati scarsamente citotossici in cellule Raw264.7 con valori di IC20 maggiori della massima dose utilizzata di 80 µg/cm2. Gli effetti citotossici erano più evidenti in cellule A549, dove Ref1 ha determinato un calo dose-dipendente della vitalità con un valore di IC50 di circa 80 μg/cm2, mentre Ref2 e Ref3 hanno prodotto cali molto modesti e solo alla massima dose utilizzata. Ref1, oltre ad aver prodotto il maggior effetto citotossico in cellule A549, è risultato anche il solo materiale in grado di produrre un calo significativo nell’efficienza di formazione di colonie rispetto al controllo.
Per quanto riguarda la capacità di attivare i macrofagi, tutte e tre le preparazioni di MWCNT hanno prodotto un incremento dell’espressione dei marker infiammatori, ma con diversa potenza. In particolare Ref1 ha determinato il maggior incremento nella produzione di NO e la più elevata induzione dei geni pro-infiammatori analizzati. Le immagini ottenute al confocale mostrano come nel caso di Ref1 gli aggregati siano di dimensioni più piccole rispetto a quelli formati da Ref2 e Ref3, e che numerosi aggregati del materiale non funzionalizzato siano stati fagocitati dai macrofagi. Nel caso invece dei due materiali funzionalizzati, sono presenti aggregati di notevoli dimensioni, la maggior parte dei quali non risulta fagocitabile dai macrofagi.
Alla luce dei risultati ottenuti è dunque possibile affermare che gli MWCNT non funzionalizzati (Ref1) hanno effetti citotossici e pro-infiammatori maggiori rispetto alle controparti funzionalizzate. In particolare è possibile individuare un rank di tossicità: Ref1 > Ref2 > Ref3. La tossicità maggiore di Ref1 potrebbe essere riconducibile ad un maggior grado di dispersione del materiale in ambiente acquoso, con formazione di aggregati di dimensioni minori rispetto a Ref2 e Ref3 che essendo fagocitabili potrebbero favorire l’attivazione dei macrofagi.