Tesi di laurea su incidenza di isolamento miceti

MATERIALI E METODI

I campioni che giungono alla U.O.S di Microbiologia

dai reparti vengono processati routinariamente sia per

la ricerca di batteri, che di miceti lievitiformi e seguiti

per 5 giorni in automazione con il sistema Bactec B.D.

L’emocoltura viene effettuata inoculando i flaconi

Bactec direttamente al letto del malato

immediatamente prime del picco febbrile o, almeno,

in corrispondenza del rialzo termico. Vengono

prelevati circa 10 ml di sangue e generalmente

vengono effettuati più prelievi.

E’ fondamentale l’accuratezza del prelievo con

disinfezione della cute per evitare contaminazione con

flora batterica locale.

Il Sistema BD BACTEC™ 9120 comprende una

ampia gamma di Flaconi, valida per soddisfare, nel

modo ottimale, tutte le esigenze cliniche (Flaconi per

Aerobi; Flaconi per Anaerobi; Flaconi Pediatrici;

Flaconi per Miceti; Flaconi per Micobatteri)

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Nelle tipologie normali, ovvero per Aerobi e

Anaerobi, i Flaconi BD BACTEC™ contengono 25

ml di terreno di crescita costituito da brodo alla

caseina di soia con CO2 e arricchimenti come estratto

di lievito, saccarosio, emina, vitamina B6 e altre

sostanze.

Flaconi BD BACTEC™ Aerobi e Anaerobi, nonché i

Flaconi Pediatrici, contengono Resine cationiche e

non ioniche per l’assorbimento degli Antibiotici

eventualmente presenti nel campione e consentono

quindi la eliminazione del loro effetto inibitore nella

crescita dei microorganismi presenti.

Nel tipo per Anaerobi sono presenti sostanze riducenti

atte ad assicurare il giusto ambiente per la crescita

degli Anaerobi.

Nei vari tipi di Flaconi è altresì presente, come

anticoagulante, il " Sodio Polianetolsulfonato " o SPS,

ad una concentrazione di 0.025%, sufficiente e al

tempo stesso corrispondente al valore minimo

possibile di tossicità ( alcuni microorganismi come

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Neisserie, Emofili e Pneumococco sono sensibili

all’SPS )

Al fondo del Flacone è presente, protetto in una

matrice solida, il Sensore di Fluorescenza sensibile

alla CO2.

La protezione del Sensore è importante ad evitare

influenze esterne negative sulla sua conservazione e

sulla sua azione.

Tutti i Flaconi BD BACTEC™ sono etichettati e

facilmente distinguibili nella tipologia per mezzo di

simboli e colorazioni differenziate.

Sono dotati di Codice a barre e riportano in etichetta la

quantità di sangue da inoculare nel prelievo.

La loro esclusiva forma li rende direttamente

compatibili con i Sistemi di prelievo tipo Vacutainer.

Il Sistema BD BACTEC™ 9120, con tecnologia di

rilevazione in Fluorescenza, per l’esame delle

Emocolture, è costituito da un modulo strumentale

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completamente automatico, che comprende in

combinazione: incubatore, agitatore, lettore.

L’ incubazione continua dei Flaconi in esame è

consentita da una struttura a stazioni termostatata ( a

35 °C +/- 1.5 ), nella quale le stazioni sono disposte in

file orizzontali di 20 all’interno di rack indipendenti

da 40 stazioni ciascuno.

I campioni sono mantenuti in agitazione da un sistema

meccanico di inclinazione ( da orizzontale a 20°).Ogni

rack effettua 30 movimenti completi al minuto.

La lettura in continuo, per la quale ogni Flacone

risulta letto ogni 10 minuti, è legata ad un sofisticato

meccanismo su base ottica che sfrutta la produzione di

CO2 del metabolismo batterico.

La informazione sulla situazione dei Flaconi

all’interno dello Strumento è continua e avviene

attraverso la visualizzazione a monitor dello schema

dei rack con i vari numeri di stazione e lo stato dei

relativi Flaconi. 11

La segnalazione dei Flaconi Positivi è immediata e

avviene attraverso segnali ottici e, facoltativamente,

acustici.

La rilevazione della crescita batterica in fase liquida

avviene mediante un metodo fluorimetrico.

Il sensore, posto sul fondo del Flacone e incorporato

in una matrice solida protettiva, contiene composti

fluorescenti che reagiscono in presenza di CO2. Tale

matrice solida consente la diffusione selettiva della

CO2 dal brodo di coltura.

Con un diodo ad emissione luminosa, un rivelatore di

fotodiodi e filtri adeguati, il BD BACTEC™ 9120

misura la fluorescenza proveniente dal sensore

fluorimetrico.

La luce che colpisce il rilevatore è solo quella

proveniente dalla fluorescenza del sensore e non

quella riflessa da altre superfici.

La tecnologia della fluorescenza nel Sistema BD

BACTEC™ 9120, utilizzando un segnale ad

emissione di fondo molto bassa, consente al Computer

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di gestione la costruzione di curve di crescita molto

precise e quindi l’applicazione di sofisticati parametri

di positività per determinare le condizioni di crescita

dei microorganismi in tempi abbreviati. (5)

Le emocolture positive sono state seminate su terreni

solidi quali Agar Sangue e McConkey ed incubati a

37°C per 24/48 ore. Nel caso in cui abbiamo ottenuto

un coltura pura di lieviti, si può procedere ad allestire

la card biochimica per l’identificazione; in caso

contrario, c’è bisogno di una sub-coltura su terreni

selettivi come Agar Sabouraud.

La card fa parte del sistema VITEK® 2, il software

per test diagnostici in vitro utilizzato per

l’Identificazione (ID) e l’ antibiogramma (AST) di

microrganismi. I VITEK® 2 Systems sono concepiti

per l’identificazione e l’antibiogramma automatizzati

della maggior parte dei microrganismi clinicamente

e/o industrialmente significativi (batteri e lieviti)

isolati abitualmente in un laboratorio di microbiologia.

La procedura test richiede una sospensione salina di

microrganismo da inoculare in un pannello di test di

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substrati biochimici e un pannello di test di

antibiotici . Questi pannelli, noti come “card”, sono

materiali di consumo monouso che vengono inoculati

in base alla procedura standard. Le card sono

preparate con un inoculo del microrganismo da una

coltura pura in base alla buone pratiche di laboratorio.

In caso di colture miste, si rende necessario un

reisolamento.

La procedura è la seguente:

-Trasferire asetticamente 3,0 mL di soluzione salina

sterile (allo 0,45% NaCl, pH 4,5-7) in una provetta di

plastica trasparente precedentemente allestita nella

cassetta Vitek;

-Utilizzare un tampone sterile per trasferire un numero

sufficiente di colonie morfologicamente simili nella

provetta contenente la soluzione salina. Utilizzare un

Vitek 2 DENSICHEK calibrato per preparare la

sospensione batterica omogenea ad una

concentrazione pari a un McFarland n.1.80-2,20;

-Inserire la card YST nella cassetta;

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-Inserire i dati e caricare la cassetta nello strumento.

Questo sistema consente di identificare, in

automazione, i lieviti di più frequente riscontro nei

campioni clinici. La card di identificazione lieviti è

composta da 46 test biochimici che misurano l’utilizzo

della fonte di carbonio, l’utilizzo della fonte di azoto e

le attività enzimatiche. Il contenuto dei pozzetti è

indicato nella Tabella V e VI. I risultati finali sono

disponibili in circa 18 ore. (6)

La card YST è in grado di identificare 55

microrganismi differenti.

In seguito all’identificazione viene effettuato un

antimicogramma con sistema SENSITITRE che è un

pannello antibiogramma in microdiluizione per

funghi.

Su questo pannello sono distribuiti in forma

disidratata 9 Antifungini. Viene effettuata diluizione in

acqua del ceppo ad uno standard 0.5 McFarland.

Vengono trasferiti 20 µg nel brodo di inoculo RPMI e

in seguito dal brodo si trasferiscono 100 µg in ogni

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pozzetto del pannello Sensititre e infine lo stesso

viene incubato a 34-36°C.

La lettura è effettuata in manuale dopo 24-48 ore per

Candida spp e dopo 72 ore per Criptococcus

neoformans.

Lo schema del pannello è visibile nella Tabella IV.

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RISULTATI

Nel corso dell’anno 2015 sono pervenute nella U.O.S.

di Microbiologia 7249 emocolture, di cui negative

5074 (70%), positive 2175 (30%). Di queste, le

positive per gram negativi sono 625 (29% delle

positive) le positive per gram positivi sono 1386 (64%

delle positive) e le positive per lieviti sono 164 (7%

delle positive).

I risultati relativi ai miceti isolati sono riassunti in

Tabella I ; mentre i risultati relativi agli altri germi

sono riportati nella Tabella II.

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DISCUSSIONE

I dati ottenuti rivelano che il maggior numero di

miceti isolati nelle emocolture appartengono al genere

Candida e in particolare alla specie parapsilosis, che è

il lievito più frequentemente isolato, della quale

l’origine più probabile è endogena. Infatti è

tipicamente un commensale della pelle umana (la sua

patogenicità è limitata dal tegumento intatto) ed è uno

dei funghi più frequentemente isolati dallo spazio

sublinguale e nelle mani dell’uomo.

Candida parapsilosis è un importante patogeno umano

emergente che ha aumentato enormemente la sua

importanza e la sua prevalenza nel corso degli ultimi

due decenni, in modo tale che C. parapsilosis è oggi

una delle principali cause di malattia invasiva da

Candida.

I soggetti a più alto rischio di infezione grave

includono neonati e pazienti in unità di terapia

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intensiva. Le infezioni da C. parapsilosis sono

particolarmente associate con soluzioni di

iperalimentazione, protesi, e cateteri a permanenza,

così come la diffusione nosocomiale di malattie per le

mani di operatori sanitari. Fattori coinvolti nella

patogenesi della malattia comprendono la secrezione

di enzimi idrolitici, adesione a protesi, e la formazione

di biofilm.(8)

Il secondo lievito più isolato è stato Candida albicans,

comune commensale del tratto digerente e, nel

comtempo, lievito molto virulento, la cui origine è

endogena.(7)

Meno frequente è stato, invece, il riscontro di altre

specie di Candida come C.glabrata, C.krusei,

C.tropicalis, C. lipolytica etc.

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CONCLUSIONI

L’isolamento di miceti nei campioni da noi presi in

esame e il confronto dei dati ottenuti con i dati del

biennio 2001-2002 ha messo in evidenza due aspetti

nelle infezioni micotiche:

di natura epidemiologica perché:

1. molte specie di Candida sono attualmente la

a) quarta causa principale di infezione

nosocomiale nel sangue;

infezioni fungine invasive provocano

b) mortalità tra il 55 e il 70%;

sono la 4° tra le specie isolate nelle Terapie

c) Intensive.

2. lo shift verso