Nanotecnologie per lo sviluppo di un integratore a base di resveratrolo

TM

Waters).

Come fase mobile è stata utilizzata una miscela di metanolo, acetonitrile, acqua e acido acetico

(75: 22,5: 2,4: 0,1, v/v). l, 

Il volume di iniezione è stato di 2 il flusso 0,8 ml/min, = 306 nm.

In tali condizioni cromatografiche è stata fatta la calibrazione utilizzando una soluzione standard

di resveratrolo a concentrazione nota.

3.7 Preparazione delle capsule

Le polveri di promicelle sono state impiegate per preparare delle capsule mediante incapsulatrice

manuale. Si sono preparate 6 capsule di tipo 0, aventi volume unitario di 0,68 ml e volume totale

di 4,08 ml.

È stato calcolato il volume apparente, ovvero il volume occupato dall’intera massa di polvere che

è comprensivo degli spazi d’aria intra- e inter-particellari, in ml.

A questo scopo, 1 g di polvere è stato versato in un cilindro graduato. Senza scuotere il cilindro,

si è effettuata la lettura del volume apparente. Conoscendo il volume apparente, si è calcolata e

pesata una quantità di polvere di promicelle sufficiente a riempire 6 capsule. Sapendo che in ogni

capsula sono inclusi 0,68 ml di polvere, conoscendo il volume apparente è possibile determinare

il peso di polvere in ciascuna capsula e, noto il titolo in RSV (tabella 1), è possibile calcolare la

quantità di farmaco per dose.

Le capsule così preparate sono state sottoposte al saggio dell'uniformità di massa. Brevemente, le

capsule sono state pesate singolarmente ed è stato calcolato il peso medio; se il peso individuale

di ogni singola capsula si discosta ±10% dal peso medio, è necessario ripetere la preparazione.

Sono state anche preparate delle capsule di controllo contenenti RSV e carrier (senza

tensioattivi). 19

Fig.7 (a) Incapsulatrice manuale con capsule di tipo 0, pressore unito alla spatola spargipolvere, (b) inserimento

delle capsule negli alveoli, (c) procedura per aprire le capsule. 20

3.8 Test di dissoluzione

Le capsule sono state sottoposte a test di dissoluzione in vitro al fine di determinare i profili di

rilascio del farmaco in ambiente gastrico simulato.

Per lo svolgimento del test è stato utilizzato un dissolutore Erweka DT 126 light corredato di un

sistema di agitazione a palette.

In ogni cestello sono stati versati 200 ml di SGF con una capsula, a temperatura di 36-37°C e

velocità di rotazione 180,0 rpm.

Ad intervalli di tempo stabiliti (2, 5, 10, 15, 20 e 30 minuti) sono stati prelevati 10 ml con una

siringa.

Dopo ogni prelievo, un volume uguale di mezzo di rilascio è stato reintegrato nel becker. I

prelievi sono stati filtrati, liofilizzati e ridispersi in 1 ml di etanolo. La soluzione così ottenuta è

stata analizzata al HPLC per quantificare il RSV disciolto. 21

4. RISULTATI E DISCUSSIONE

4.1 Preparazione delle promicelle

In questo lavoro di tesi, allo scopo di migliorare la solubilità del resveratrolo, sono state

“promicelle”

preparate delle polveri di costituite da una miscela solida di un carrier solubile in

grado di formare una polvere scorrevole (lattosio o maltodestrina) e un tensioattivo che disperso

in acqua forma aggregati micellari (polisorbato 20 o polisorbato 85). Tutti i componenti usati

sono approvati per uso umano.

La preparazione avviene per semplice dissoluzione del resveratrolo nel polisorbato, assieme alla

minima quantità di etanolo per formare una soluzione, che è quindi fatta assorbire su una polvere

inerte (composta da uno zucchero) per miscelazione manuale in capsula di vetro.

L’aggiunta di etanolo alla dispersione di polisorbato e resveratrolo ha permesso la

solubilizzazione di quest’ultimo, evitando l’adesione di cristalli di grandi dimensioni alle

particelle di zucchero. Il solvente è quindi rimosso ponendo la povere sotto vuoto.

Le preparazioni, la cui composizione è riportata in tabella 3, dopo evaporazione del solvente e

dopo idratazione sotto agitazione si sono presentate con aspetto differente a seconda del valore di

HLB della miscela dei tensioattivi impiegati. Le dispersioni micellari con HLB 16.7 erano

limpide, quelle con HLB 13.5 quasi trasparenti, ma leggermente opache, mentre invece le

dispersioni con HLB 11, presentavano un aspetto torbido e, dopo poco tempo, si separavano in

due fasi. Per questo motivo sono state scartate..

Tween 20 Tween 85 RSV Carrier EtOH

PMLac 16.7 184 mg 10 mg 736 mg Lattosio 15 gtt

PMMal 16.7 184 mg 10 mg 736 mg Maltodestrine 15 gtt

PMLac 13.5 79 mg 157 mg 10 mg 736 mg Lattosio 15 gtt

PMMal 13.5 79 mg 157 mg 10 mg 736 mg Maltodestrine 15 gtt

PMLac 11 275 mg 10 mg 736 mg Lattosio 15 gtt

PMMal 11 275 mg 10 mg 736 mg Maltodestrine 15 gtt

Tab.3 Composizione delle promicelle 22

4.2 Caratterizzazione chimico-fisica

Le polveri idratate sono state analizzate con lo strumento zetasizer e il pHmetro.

Diametro medio (nm) PDI Potenziale Z (mV) pH

PMLac 16.7 7.3 ± 1.5 0.241 -17.2 ± 9.4 5.88

PMMal 16.7 6.0 ± 0.8 0.521 -16.2 ± 0.4 5.45

PMLac 13.5 31.5 ± 11.8 0.306 -35.1 ± 23 5.55

PMMal 13.5 69.7 ± 43.4 0.312 -30.5 ± 20.5 5.36

Tab. 4 Analisi dimensionale, potenziale Z e pH delle micelle

In Tabella 4 sono riportati i valori dimensionali, l’indice di polidispersione (PDI) e la carica

superficiale (PZ) delle dispersioni micellari.

I campioni con HLB 16.7 presentano valori di diametro medio tra 6-7.3 nm, PDI tra 0,241-0,521

e PZ tra -16.2 e -17.2 mV.

Invece i campioni con HLB 13.5 presentano valori di diametro medio tra 31.5-69.7 nm, PDI tra

0,306-0,312 e PZ tra -30.5 e -35.1 mV.

Inoltre è stato osservato che i campioni con il lattosio come carrier presentano un diametro

medio inferiore rispetto ai corrispondenti con maltodestrine e anche un PDI più basso, indice di

una maggiore omogeneità.

La spiegazione del PDI più alto delle PMMal può essere dovuta all’interferenza delle

maltodestrine con la lettura. Tale valore è, infatti, calcolato a partire dalle popolazioni di

particelle rilevate in base alla loro intensità di scattering e non è stato, quindi, possibile

sopprimere l’interferenza (al contrario a quanto effettuato con il diametro medio).

Per quanto riguarda invece il PZ, campioni con carrier lattosio presentano carica superficiale più

negativa.

È stato inoltre misurato il pH delle formulazioni realizzate, e i valori si attestano tra 5.36-5.88

per tutti i campioni.

Sono anche state analizzate con lo zetasizer le stesse preparazioni con SGF (Tab. 5) mostrando

valori simili alle micelle in acqua. 23

SGF Diametro medio PDI

PMLac 16.7 7.6 ± 1 0.236

PMMal 16.7 6.8 ± 1.2 0.591

PMLac 13.5 53.0 ± 2.1 0.269

PMMal 13.5 72.6 ± 56.7 0.605

Tab. 5 Analisi dimensionale e potenziale Z delle micelle in SGF

4.3 Efficienza di incapsulazione

Per verificare la possibilità di somministrazione delle promicelle come polvere (ad esempio sotto

forma di capsule) in grado di idratarsi direttamente nel fluido gastrico per formare micelle, è

stata valutata l’efficienza di incapsulazione delle promicelle idratate con fluido gastrico simulato

(SGF).

I valori ottenuti, riportati in Tabella 6, sono compresi tra 61-79% per le micelle in acqua, e 67-

89% per le micelle in SGF, indicando che il sistema è adatto ad incorporare efficacemente il

principio attivo.

In particolare le promicelle di maltodestrine mostrano un’efficienza di incapsulazione più alta

rispetto a quelle di lattosio, e soprattutto quando idratate con SGF.

Idratazione con acqua Idratazione con SGF

PMLac 16.7 67 ± 8 67 ± 2

PMMal 16.7 73 ± 12 76 ± 9

PMLac 13.5 61 ± 14 80 ± 4

PMMal 13.5 78 ± 8 89 ± 13

Tab.6 Efficienza di incapsulazione del resveratrolo nelle promicelle reidratate con acqua o con fluido gastrico

simulato (SGF) 24

4.4 Studi di rilascio in fluido gastrico simulato (SGF) e fluido intestinale simulato (SIF)

Al fine di ottenere dati quantitativi che possano essere predittivi del rilascio del RSV in vivo

dopo somministrazione per via orale sono stati effettuati degli studi di rilascio in SGF (Fluido

Gastrico Simulato) e SIF (Fluido Intestinale Simulato).

l)

Le promicelle ricostituite in acqua (1000 sono state esposte al SGF o al SIF (100 ml),

termostatati a 37°C, per 120’ nel caso di ambiente gastrico e, fino a 8 ore nel caso di ambiente

intestinale. I differenti tempi di esperimento sono stati programmati in funzione del tempo di

transito nello stomaco e nell’intestino.

In figura 8 viene mostrata la percentuale di RSV rilasciato dalle micelle ai diversi tempi di

incubazione in SGF.

70

60

50

(%)

rilasciato LAC 16.7

40 MAL 16.7

30 LAC 13.5

RSV 20 MAL 13.5

10

0 0 50 100 150

Tempo (min)

Fig.8 Percentuale di RSV rilasciato dalle micelle in SGF

Come si può osservare dall’analisi delle curve, le formulazioni con il lattosio come carrier

rilasciano il RSV con velocità superiore rispetto alle formulazioni con le maltodestrine,

indipendentemente dal valore di HLB della miscela di tensioattivi. Infatti, dopo due ore di

esperimento, il RSV rilasciato dalle polveri di lattosio è compreso in un intervallo del 35-40%

dell’ incapsulato per entrambe le preparazioni. Il RSV rilasciato invece dalle due formulazioni

con maltodestrine non supera il 25%. Probabilmente la differente struttura chimica dei due

carrier influenza la loro velocità di dissoluzione e, di conseguenza, la diffusione del RSV. 25

Le maltodestrine hanno infatti una struttura macromolecolare che, impiegando più tempo ad

idratarsi e disperdersi nel veicolo, rallenta la liberazione del RSV

Questa ipotesi è supportata dai risultati degli studi di rilascio in SIF. Osservando infatti le curve

di rilascio nelle prime 2 ore, queste presentano un andamento molto simile a quelle ottenute dagli

gli esperimenti in SGF. Proseguendo l’esperimento fino alle 8 ore, periodo sufficiente alla

completa dissoluzione dei carrier, tutte le formulazioni rilasciano il RSV in un range percentuale

compreso nell’intervallo 52-58%.

In figura 8 è riportato il grafico della percentuale di RSV rilasciato dalle micelle in SIF.

70

60

50

(%)

rilasciato LAC 16.7

40 MAL 16.7

30 LAC 13.5

RSV 20 MAL 13.5

10

0 0 2 4 6 8 10

Tempo (ore)

Fig.9 Percentuale di RSV rilasciato dalle micelle in SIF 26

4.5 Test di dissoluzione

Una capsula è stata introdotta nel cestello del dissolutore, dopo due minuti è stato osservato che

questa si disgrega rilasciando quindi il contenuto e si sono fatti i prelievi.

Il test di dissoluzione in vitro in SGF ha portato a risultati anomali, in quanto i dati dell’HPLC

ottenuti dai prelievi hanno presentato valori alti di deviazione standard e quindi poco precisi.

Questo perc