Appunti esame di Genetica 2° anno

l’85%; gli altri geni devono rimanere presenti in doppia dose, quindi si dice che “sfuggono alla

compensazione del dosaggio”.

Perché l’X spento lo vedo come una macchia condensata?

Lo spengo tramite meccanismi epigenetici, vado a metilare i geni, quindi il cromosoma risulterà molto

condensato, sarà costituito da eterocromatica. L’X che viene spento viene

condensato, ma non così tanto da cambiare dimensione, per questo

l’eterocromatina è chiamata eterocromatina facoltativa, non costitutiva.

L’X che si spegne va a formare l’eterocromatina facoltativa. La regione scura

all’interno del nucleo viene chiamato corpo di Barr, e non è altro che il modo in

cui mi si presenta il cromosoma X spento.

Quando passo in metafase non mi serve tenere la condensazione, mi serve solo

ereditare i cromosomi in modo corretto, quindi il corpo di Barr sparisce.

Un maschio Klinefelter ha due X, si attivano i meccanismi di compensazione del dosaggio.

Perché il corpo di Barr è sempre alla periferia del nucleo?

Perché essendo spento non è usato, viene quindi spostato alla periferia (posso così distinguerlo dal

nucleolo).

Un individuo con trisomia XXX, spegne due X, perché l’informazione che passa è “tieni un solo X”, non

“spegni un solo X”.

in questo caso posso contare i cromosomi X senza vederli: se vedo due corpi di Barr, sicuramente l’individuo

avrà tre cromosomi sessuali.

Se una cellula ha spento l’X paterno, questa informazione verrà ereditata alle cellule figlie, le cellule hanno

una memoria epigenetica (per i processi di mitosi).

La distribuzione delle ghiandole sudoripare avviene su base genetica. Se vado a prendere due gemelle

identiche, esse comunque non hanno spento gli stessi cromosomi X. Se vado a fare la mappatura delle

ghiandole sudoripare vedo che sono diverse proprio perché avranno spento cromosomi X diversi.

Come spengo il cromosoma?

Essi contengono una regione chiamata XIC, che non è altro che il

centro di inattivazione del cromosoma X. All’interno di questa

regione c’è un gene chiamato Xist: serve per spegnere il

cromosoma.

Avendo due cromosomi omologhi avrò anche due centri di

inattivazione, un Xist materno e uno Xist paterno; uno dei due si

attiva e spegne il cromosoma. Il primo meccanismo utilizzato per

spegnere l’X è un meccanismo legato ad una RNA interferenza (non

permette la sintesi delle proteine che arrivano): un RNA per essere

tradotto da un ribosoma deve essere a singolo filamento, un

bicatenario non può essere tradotto, quindi si fanno arrivare ai ribosomi RNA a doppio filamento in modo

che non possano essere tradotti.

Siccome voglio silenziare il cromosoma tolgo i gruppi acetilici, ma per mantenerlo spento aggiungo anche i

gruppi metilici.

Siccome esiste una memoria genetica quell’X rimarrà spento in tutte le cellule che da esse derivano.

IMPRINTING E DOSAGGIO IN ALTRE SPECIE



1. Drosophila melanogaster.

I suoi cromosomi sessuali non servono per le stesse funzioni per le quali servono agli umani. Le femmine

sono XX e maschi XY, ma è solo l’X che determina il sesso, l’Y serve solo per conferire la capacità,

all’individuo maschio, di fare la spermatogenesi. Questo vuol dire che in Drosophila un individuo Y0 sarà

maschio ma sterile.

Per determinare il sesso Drosophila fa un rapporto matematico:

ha tre paia di cromosomi autonomi e un paio di cromosomi sessuali. Il sesso in Drosophila è determinato

dal rapporto tra il numero di cromosomi (X) e il numero di gruppi di autosomi (A):

a) In una normale femmina diploide A=2 e X=2. Il rapporto X/A è uno.

b) In un normale maschio diploide A=2 e X=1. Il rapporto X/A è 0,5.

c) Nei casi di aneuploidia possiamo avere diversi casi:

- quando il rapporto X/A è 1, l’individuo è femmina

≧

- quando il rapporto X/A è 0,5 l’individuo è maschio

≦

- un rapporto tra 0.5 e 1 dà come risultato un individuo sterile con tratti misti tra quelli maschili e quelli

femminili.

La compensazione dei dosaggi in Drosophila produce una maggiore espressione di geni legati a X nei

maschi, quindi il livello di trascrizione equivale a quello di due cromosomi X di una femmina:

i maschi vengono equiparati alle femmine per compensazione del dosaggio, per questo motivo i soggetti

maschi over esprimono i livelli del loro cromosoma X, viene trascritto il doppio rispetto al normale.

La modificazione epigenetica presente sull’X trascritto il doppio è l’acetilazione: l’X dei maschi di Drosophila

viene iper acetilato per compensare i livelli di trascrizione.

2. C. elegans

Nematode; hanno un numero di cellule finito e il destino di ogni cellula è uguale in tutti i viventi. La sua

popolazione non è fatta da maschi e da femmine, ma da ermafroditi simultanei e da maschi. Gli ermafroditi

sono XX, gli individui maschili sono X0.

Perché avere dei maschi? Per fare ricombinazione.

In questo caso la determinazione si regola perdendo un cromosoma X: il sesso è determinato causando

un’aneuploidia, un gamete ha un cromosoma X in meno. Si forma un gamete che non ha un cromosoma X, è

X0, quindi maschio. Tendenzialmente è una mancata disgiunzione primaria.

Maschio un solo X, femmina XX.

In questo caso l’ermafrodito mantiene attivi tutti e due gli X, ma ne esprime la metà di quello che

normalmente fa. Il maschio trascrive normalmente il suo X, abbiamo compensato il dosaggio.

Per dimezzare in questo caso devo fare una ipo acetilazione rispetto al normale.

3. Ci sono molti viventi che non hanno cromosomi X Y, hanno cromosomi sessuali ma un

meccanismo diverso.

I cromosomi sessuali in questi organismi non sono chiamati X e Y ma sono chiamati W e Z.

Individui ZZ sono maschi, altri ZW sono femmine. in questi casi non c’è omogamia femminile, ma ‘è

omogamia maschile.

Si è cambiata la nomenclatura dei cromosomi per far capire che la determinazione del sesso e il

meccanismo degli stessi cromosomi sessuali sono diverse.

In questi cromosomi non ci sono meccanismi che agiscono nello stesso modo su tutto il cromosoma, non

esiste un meccanismo del dosaggio, si lavora sui singoli geni.

4. Alcuni viventi non hanno dei cromosomi sessuali, come ad esempio una parte dei rettili.

Essi non hanno meccanismi genetici di determinazione del sesso: il sesso è determinato dall’ambiente.

Usano la temperatura per determinare un sesso o l’altro: nella tartaruga, se l’uovo è tenuto al di sotto dei

28° si svilupperà un maschio, mentre al di sopra di 28°si svilupperà una femmina. Il determinate primario

non è genetico, ma è ambientale.

Nei coccodrilli avviene lo stesso processo delle tartarughe ma con le temperature e i sessi al contrario.

Che problema ha questo sistema di determinazione?

Se la temperatura di quel determinato ambiente cambia drasticamente in modo permanente, lo sviluppo

degli individui non sarà più pari, potrebbero risultare o solo individui maschi o solo individui femmine.

Solo i meccanismi genetici mi assicurano una sex ratio del 50%.

I sistemi ideali di determinazione del sesso mi assicurano una popolazione di metà maschi e metà femmine

(in termini statistici).

5. In alcuni modelli la determinazione del sesso è ambientale, ma deriva da una molecola prodotta

dalla madre.

In questi individui la madre produce un ormone mascolinizzante; per questo motivo se l’individuo nasce

fisicamente sopra alle madre diventerà maschio. Se l’individuo nasce, ad esempio, su una roccia allora

diventerà femmina. In seguito il maschio andrà a vivere nelle vie genitali della madre con cui si accoppierà.

Il problema in questo caso è che non avviene ricombinazione genica nel caso del maschio.

6. In alcuni animali è presente il cambiamento di sesso, come ad esempio nei pesci pagliaccio.

Nascono tutti individui femmine, ad un certo punto diventano maschi. In questo caso, data la

trasformazione, non sono presenti cromosomi sessuali. Il sesso è determinato dalle dimensioni

dell’individuo: se è piccolo sarà femmina, appena si ingrandisce diventa maschio.

Questo meccanismo di determinazione del sesso è usato in sistemi in cui i maschi devono combattere per

avere la femmina, quindi è vantaggio essere grossi.

LA REPLICAZIONE DEL DNA NEGLI EUCARIOTI E NEI PROCARIOTI

La replicazione è quel processo per cui il materiale genetico deve essere replicato nel modo più accurato

possibile.

Watson e Crick, dopo aver spiegato la teoria sulla forma del DNA, fecero ipotesi anche sul suo modo di

replicare.

Secondo loro la cosa più facile ed economica in termini di dispendio energetico era che le due eliche del

DNA dovevano essere separate, ovvero denaturate, in modo che ciascuna delle due potesse fungere da

stampo per una nuova elica figlia. Per definizione si chiama DNA parentale il filamento stampo, mentre i

nuovi filamenti sono chiamati filamenti di neosintesi.

La replicazione, quindi, è quel processo in cui da una molecola di DNA si passa a due molecole, contenente

ciascuna un filamento parentale e uno di neosintesi.

Che cosa mancava a questo modello?

Una dimostrazione sperimentale per verificare che questo era il vero meccanismo di replicazione del DNA.

Il filamento di DNA è una doppia elica parallela; un filamento va da 3’ 5’ mentre l’altro da 5’3’.

Questo è importante perché le DNA polimerasi possono sintetizzare DNA solo a partire dall’estremità 5’ e

arrivando a quella 3’. Dato che i filamenti sono paralleli questo meccanismo mi dice che non potranno

essere replicati allo stesso modo.

La fase di replicazione del DNA è quella chiamata S nel ciclo cellulare.

Nel corso del tempo sono state fornite tre diverse teorie riguardo al meccanismo di replicazione:

1. Modello semi-conservativo: Watson e Crick propongono questo modello. È chiamato così per il

destino dell’elica parentale: nella prima generazione ottengo un DNA ibrido, il filamento parentale è

stato conservato in due molecole diverse. Si dice che è semi-conservativa perché nelle eliche figlie

finisce solo un filamento parentale. In altre parole in questo modello ogni elica avrebbe potuto

essere lo stampo per una nuova elica figlia.

2. Modello conservativo: Secondo alcuni autori accadeva che il DNA parentale si denaturava, fungeva

da stampo, ma poi le eliche parentali si riassemblavano tra di loro e così anche per le due eliche

figlie. Questo modello è chiamato conservativo perché l’elica parentale che trovo all’inizio è la

stessa che trovo nella prima generazione figliale. Questo modello era più complesso: non c’era

risparmio energetico. Questo modello avrebbe avuto anche uno svantaggio: tutte le volte che avrei

replicato il DNA questa non sarebbe mai stata perfetta; in questo modello di replicazione, tutte le

mutazioni le ritroveremmo su una cellula figlia.

3. Modello dispersivo: secondo alcuni autori i filamenti di DNA venivano copiati a piccoli pezzi. In

questo modello tutto il DNA veniva replicato a piccoli pezzi e poi assemblati tra di loro facendo in

modo che le eliche figlie fossero un ibrido tra pezzi di DNA parentale e pezzi di DNA neosinetizzato.

Questo modello è ancora più improbabile di quello precedente perché si va a compromettere la

continuità del DNA che è fondamentale.

Nel 1958 Meselson e Stahl impostarono un esperimento per capire come funzionava la replicazione del

DNA: volevano capire quale dei modelli era vero.

Per questo esperimento dovevano distinguere il filamento parentale e quello di neo sintesi. Per fare ciò gli

serviva un modello sperimentale, utilizzano E.coli (replica in vitro ogni 20 minuti).

Per distinguere le due eliche decidono di ricorrere alla marcatura con diversi isotopi dell’azoto:

- Azoto N14

- Isotopo dell’azoto N15

Fanno crescere E.coli in un terreno arricchito di azoto N15, e gli fanno fare molti cicli replicativi per far si che

tutto l’azoto incorporato nel DNA fosse azoto N15. 15 15

Questo era il loro controllo di partenza, e lo chiamano: N -N (i due filamenti hanno solo N15).

In seguito usano la tecnica chiamata centrifugazione in gradiente di concentrazione: una provetta riempita

con cloruro di cesio, non forma una soluzione omogenea, ma si forma un gradiente di concentrazione,

ovvero man mano che scendiamo sul fondo sarà più concentrato.

Se prendiamo un campione di DNA, lo inseriamo nella provetta e centrifughiamo vediamo che il DNA va a

concentrarsi dove c’è una densità equivalente alla propria. Il DNA N15 va a formare una banda sul fondo

della provetta. Eliminazione del modello conservativo

A questo punto fanno un altro ciclo di replicazione di DNA e vogliono distinguere le eliche. Tolgono i batteri

e li mettono in un terreno con azoto N14. I batteri vengono messi in condizioni di replicare, ma questa volta

incorporano N14.

Fanno un ciclo replicativo e ripetono la centrifugazione. Osservano una banda che è più spostata verso l’alto

14 15

che non verso il basso, banda un po’ più leggera, meno densa. Questo DNA è ibrido N -N . Se avessero

trovato una banda N14-N14 sarebbe stata ancora più verso l’alto.

A questo punto della replicazione potevano già escludere un modello, quello conservativo: avremmo visto

14 14 15 15

due bande, una N -N e una N -N .

Eliminazione del modello dispersivo

14 15 14 14

Fanno un altro ciclo replicativo e vedono due bande: una N -N e l’altra N -N .

Nel caso del modello dispersivo avrei avuto solo una banda.

MECCANISMI ED ENZIMI CHE INTERVENGONO NELLA REPLICAZIONE:

Durante la replicazione intervengono vari enzimi, tra i quali le polimerasi a cui spettano due compiti:

- Integrare il nucleotide corretto

- Creare il legame fosfato tra i nucleotidi

La polimerasi può sbagliare, ci sono meccanismi che cercano di correggere gli errori.

Negli eucarioti ci sono tre tipologie di DNA polimerasi:

- DNA polimerasi I (rimuove i tratti di DNA e li risintetizza)

- DNA polimerasi II

- DNA polimerasi III (fa la maggior parte del lavoro)

Quello che accomuna le tre DNA polimerasi è il fatto di sintetizzare solo in direzione 5’ 3’

.



I. Le DNA polimerasi possono avere un’altra attività: attività esonucleasica, ovvero la capacità di

rimuovere dei nucleotidi. Tutte e tre le DNA polimerasi possono sintetizzare in direzione 5’3’,

ma possono togliere nucleotidi anche in direzione 3’5’. Se si accorgono di aver sbagliato

tornano indietro e correggono.

Questa attività è chiamata appunto “correzione di bozza”. È in direzione opposta a quella polimerizzazione

perché deve tornare indietro nel caso sbagli.

Nel DNA umano si trovano due o tre mutazioni ogni miliardo di nucleotidi replicati anche in presenza delle

correzioni di bozza. Se non esistessero le correzioni di bozza sarebbero due o tre nucleotidi ogni milioni di

nucleotidi replicati.

Le correzioni di bozza a questo punto sono molto importanti.

II. Alcune DNA polimerasi possono avere un’attività esonucleasica che va da 5’ 3’, non tornano

indietro quindi non è una correzione, ma è una riparazione del DNA. Questo meccanismo non

serve per la replicazione del DNA. Può capitare che si formi un buco in un filamento di DNA

appena sintetizzato, grazie alla DNA polimerasi può essere riempito. Questo riempimento

continua anche un po’ dopo la fine del buco in modo tale da essere sicuri di aver riparato tutto il

danno.

III. Le DNA polimerasi intervengono anche quando, ad esempio sostanze chimiche, danneggiano il

DNA.

Per molto tempo si è pensato che ogni gene avesse un particolare enzima. In realtà non c’è correlazione,

perché una proteina funzionale può essere un eteropolimero, ovvero un insieme di proteine.

REPLICAZIONE DEL DNA NEI PROCARIOTI:

Come primo step il DNA deve essere decondensato per essere replicato, deve tornare “nudo”. Non tutto il

DNA contemporaneamente viene liberto dagli istoni, essi vengano spostati in modo che sia replicato un

pezzo alla volta di DNA.

Il DNA deve essere “nudo” perché può essere aperto solo se non compattato.

L’inizio della replicazione non avviene in punti casuali, ma ci sono precisi punti di inizio chiamati punti di

origine della replicazione o ori-C.

C’è un’unica origine di replicazione nei cromosomi batterici e nei plasmidi.

Quindi la cellula nei procarioti deve identificare il punto di origine della replicazione.

Una proteina, chiamata proteina iniziatrice della replicazione, sa fare due cose:

- riconoscere l’origine di replicazione

- richiama una proteina che serve per la tappa successiva

Questa proteina iniziatrice lega la proteina successiva che non è altro che la DNA elicasi. La DNA elicasi è

l’enzima che svolge l’elica del DNA. Il DNA che era a doppia elica viene dentaurato solo in un tratto e si

forma una sorta di ansa. All’interno dell’ansa avviene la replicazione del DNA: la struttura nel complesso è

chiamata bolla di replicazione.

La bolla di replicazione si forma al sito di origine della replicazione. Il tratto in cui il DNA è in denaturazione

viene chiamato forca replicativa.

La tappa successiva è

leggere il DNA, per fare

questa operazione non

posso usare

direttamente la DNA

polimerasi perché

questi enzimi hanno bisogno di un innesco chiamato primer: breve filamento di RNA che si lega al DNA

all’interno della bolla a cui poi si legherà la DNA polimerasi.

Il primer è costituito da RNA e alla fine viene degradato e sostituito con DNA.

A mettere il primer (15-20 nucleotidi) sul filamento di DNA è un enzima specifico chiamato DNA primasi.

A questo punto arriva la DNA polimerasi e può iniziare la replicazione.

Da questo punto in poi la replicazione diviene uguale negli eucarioti e nei procarioti, l’unica differenza sta

nel fatto che negli eucarioti le origini di replicazioni sono molteplici e non solo una come nei procarioti.

1. Quando la DNA polimerasi ha replicato tutto il DNA dentro alla bolla, la forca di replicazione deve

avanzare 5’3’. Essa va avanti fino alla fine del filamento del DNA.

[Ogni cromosoma è un filamento di DNA].

La polimerasi innescata dal primer comincia a lavorare, sintetizza in direzione 5’3’, quando arriva alla

forca di replicazione essa si deve spostare e la polimerasi continua.

Il filamento di neo sintesi è chiamato anche

filamento a sintesi continua perché è

sintetizzato in modo continuo in direzione 5’3’

con lo stesso primer fino alla fine de filamento.

Sul filamento in ritardo, dal momento che la

sintesi del DNA avviene in direzione 5’3’, la

sintesi può procedere solo fino ad un certo

punto. Per poter continuare la sintesi del DNA

sul filamento stampo , è necessario un nuovo

inizio di sintesi del DNA; un primer di RNA è sintetizzato dalla DNA primasi nella forca di replicazione. La

DNA polimerasi III aggiunge DNA al primer di RNA per sintetizzare un nuovo segmento di DNA. Questo

filamento è sintetizzato in modo discontinuo, segmento dopo

segmento, per questo motivo la replicazione del DNA nel suo insieme

procede con modalità semidiscontinua.

Complessivamente la replicazione del DNA è chiamata semi-continua

o semi-discontinua.

Il filamento 3’5’ viene chiamato anche filamento ritardo.

Il filamento sintetizzato in modo continuo è chiamato leading strand

in inglese, mentre quello discontinuo è chiamato lagging strand.

Una volta sintetizzato anche il filamento in ritardo non si possono

lasciare tutti i primer attaccati, ma devono essere tolti prima di

riunire i filamenti, per questo motivo si chiama “filamento in ritardo” perché la sua sintesi è completata in

ritardo rispetto alla intesi dell’latro filamento.

Un ricercatore, Okazaki, ha osservato per la prima volta che effettivamente un filamento di DNA era

frammentato: evidenza empirica che la replicazione del DNA è discontinua su un filamento.

Per questo motivo i frammenti sono chiamati frammenti di Okazaki.

2. Una volta che ho ottenuto i frammenti, i primer vengono tolti e interviene una DNA polimerasi che

sintetizza i tratti di DNA corrispondenti ai primer. I frammenti di Okazaki non possono essere legati

tra di loro perché perderei dei tratti di DNA, quindi delle informazioni.

3. Una volta che ho tolto i primer e messo il DNA sintetizzato, la DNA ligasi, può intervenire e legare

tra di loro i frammenti di Okazaki tramite legami fosfodiesterei tra due nucleotidi adiacenti.

Al termine di questo processo allora anche il filamento in ritardo è stato completamento replicato.

La bolla di replicazione rimane aperta grazie a proteine che svolgono questo compito: proteine che legano

DNA a singolo filamento, sono proteine che si legano ala bolla facendo si che essa non collassi su se stessa.

Un’altra cosa importante durante la replicazione è che la bolla non si fermi, ma vada avanti in modo

continuo; esistono sostanze però che mandano in stallo la forca replicativa: queste molecole fermano la

replicazione, è pericoloso perché queste sostanze tendono a favorire danni al DNA e quindi mutazioni (la

nicotina e la caffeina).

Nei procarioti la forca replicativa può andare avanti in entrambe le direzioni, quando le due bolle replicative

si incontrano, si fondono e la replicazione finisce (replicazione simmetrica).

I mitocondri contengono DNA simile a quello dei procarioti e sembra che sia la replicazione sia asimmetrica,

non avviene negli stessi tempi nei due filamenti di DNA: se un filamento tende a rimanere denaturato più

tempo accumulerà anche più mutazioni.

REPLICAZIONE DEL DNA NEGLI EUCARIOTI:

il meccanismo è lo stesso ma con alcune modifiche:

- La bolla di replicazione procede solo in direzione 5’3’

- Gli enzimi che intervengono sono:

1. DNA polimerasi alfa è la prima che interviene ed è una

primasi, funziona come primasi e fa la prima fase di estensione

dei primer.

2. DNA polimerasi delta sintetizza i due filamenti ma è questa

stessa polimerasi che riempie i frammenti di Okazaki (fa il grosso

del lavoro come la polimerasi III).

3. DNA polimerasi beta interviene solo nella riparazione del

DNA, non nella sintesi.

4. DNA polimerasi gamma non lavora nel nucleo ma nei

mitocondri e serve per replicare il DNA mitocondriale

5. DNA polimerasi epsilon è equivalente alla delta.

La dinamica della replicazione è uguale ma sorge un problema di tipo quantitativo: la quantità di DNA da

replicare è molto diversa, negli eucarioti è molto più abbondante. Per questo ho più punti di inizio della

replicazione.

Per far avanzare la replicazione si apre la bolla di replicazione ma il DNA si super avvolge più vado avanti,

quindi servono enzimi che tolgano i super avvolgimenti: essi agiscono sulla fine del DNA per avvolgerlo dalla

parte opposta alla parte in cui si sta avvolgendo. Questo enzima è chiamato girasi.

La girasi fa parte degli enzimi chiamati topoisomerasi, enzimi che lavorano sulla forma del DNA.

Anche l’elicasi è una topoisomerasi. 8

Ogni cromosoma eucariote consiste di un DNA lineare a doppia elica ed è lungo circa 10 bp. Questo

significa che e ci fosse un’unica origine di replicazione di ogni cromosoma, la replicazione stessa

richiederebbe parecchi giorni. In effetti i cromosomi degli eucrioti si replicano in modo veloce ed efficace

perché la replicazione del DNA viene iniziata nel genoma in parecchi punti contemporaneamente. In ogni

punto di origine il DNA si srotola in filamenti singoli e la replicazione procede in modo bidirezionale; infine

ogni forca di replicazione corre verso la forca di replicazione adiacente, che ha avuto origine in un’origine di

replicazione attigua. Negli eucarioti il tratto di DNA compreso tra un’origine di replicazione e le due

terminazioni della replicazione a ciascun lato dell’origine si chiama replicone o unità di replicazione.

Per girare il DNA la girasi compie un taglio a singola elica, in seguito fa girare il filamento facendo perno sul

legame covalente: faccio tanti giri quanti mi servono. Una volta che ha compiuto i giri

rimetto i filamenti vicini e si ricrea il

legame covalente, non si rompono

mai tutti e due i filamenti del DNA

sarebbe un danno molto grave da

riparare.

Ci sono moltissimi viventi che hanno molto più DNA di noi, quindi hanno più unità di replicazioni ma non c’è

nessuna correlazione tra quantità di genoma e numero di geni: gli anfibi hanno 22 mila geni come i rettili gli

uccelli e i mammiferi. TELOMERI E TELOMERASI

Ad ogni ciclo replicativo potenzialmente viene persa la parte terminale di DNA ovvero i telomeri, con la

conseguente “erosione di telomeri”. Questi sono riconducibili nella maggior parte dei casi ad alcune

caratteristiche principali:

sono costituiti da brevi sequenze nucleotidiche ripetute in tandem n volte (nei vertebrati la

- sequenza ripetuta è TTAGGG). L’unica cosa che li differenzia è il numero di ripetizioni.

sono costituiti da lunghe (tra i 300 e i 500 nucleotidi) sequenze nucleotidiche ripetute in tandem n

- volte. Questo modello non è comune, perché si possono trovare solo in particolari insetti. In questo

tipo di sequenze può avvenire la Slippage replication (libro) dove nel caso dei telomeri si tende a

far scorrere il filamento di neosisntesi in questo modo possono essere generate le impronte



genetiche.

in drosophila melagonaster i telomeri sono caratterizzati da “elementi genetici mobili”, ovvero tratti

- di DNA che possono spostarsi autonomamente all’interno del genoma e svolgono un ruolo

importante perché costituiscono i telomeri grazie alle sequenze di HeT-A e TART.

I telomeri svolgono varie funzioni come la protezione delle estremità cromosomiche dalla degradazione e

dalla fusione e la capacità di assicurare la replicazione completa di sequenze di DNA.

In ogni caso siccome il processo di perdita dei

telomeri è inevitabile, viene utilizzato da tutte

le cellule somatiche come “orologio biologico”

per capire quante volte la cellula si è replicata.

È stato studiato che dopo aver adempito alla

replicazione per 30 volte la cellula va incontro a

morte spontanea senescenza. Ciò avviene



perché una cellula che replicata tanto continua

ad accumulare mutazioni.

Vi sono alcune cellule, vedi le cellule staminali

e le germinali, in cui questo invecchiamento viene bilanciato grazie ad un enzima chiamato telomerasi che

sintetizza DNA o meglio i telomeri nel momento in cui la cellula li perde.

La telomerasi usa uno stampo di RNA per sintetizzare porzioni di DNA per cui viene definita polimerasi RNA

dipendente.

PROBLEMI DELLA TELOMERASI:

Il gene della telomerasi è presente in tutte le cellule ma in alcune viene trascritto mentre in altre no. Nel

caso di una cellula tumorale abbiamo una cellula che arrivata al limite di 30 replicazioni continua a perdere

porzioni di DNA divenendo una cellula maligna. In alternativa vi sono cellule che diventano tumorali perché

in queste vi è presente la telomerasi anche se in realtà non dovrebbe esserci, per cui si avranno un numero

eccessivo di replicazioni.

La proteina P53 (oncoprotettore) informa la cellula che i propri telomeri si sono accorciati eccessivamente

ed impedisce l’ulteriore replicazione. Nel caso in cui questa proteina non funzioni si potranno creare le

cellule tumorali.

Un altro effetto della telomerasi è generare un filamento più lungo rispetto a quello originario in modo che

poi possa essere formata una struttura a laccio detta “non Watson e Crick” o meglio T-LOOP che

permetterà il riconoscimento e la stabilizzazione del telomero in quanto dotato di una struttura diversa dal

solito.

Ogni cellula prima di iniziare ogni replicazione verifica di avere entrambi i telomeri e in alcuni casi se un

cromosoma è privo di un telomero può essere riformato de-novo attraverso la telomerasi.

Gli elementi genetici mobili presenti in Drosophila melanogaster si dividono in due classi:

- classe 1 detti retrotrasposoni che attraverso la trascrittasi inversa viene duplicato e inserito in un

punto casuale del genoma (trasposizione replicativa). Ogni volta che avviene questo processo

aumenta il numero di copie di retrotrasposoni. Gli elementi HeT e TART appartengono sempre in

questo gruppo ma hanno la caratteristica di posizionarsi

sempre verso il telomero.

- classe 2 detti trasposoni ovvero tratti di DNA che si

spostano con un meccanismo che prevede il taglio di

questo tratto e spostato in un altro punto del genoma.

L’enzima che provoca questo processo si chiama

trasposasi (prodotta dallo stesso elemento genetico mobile).

Un’altra caratteristica dei telomeri è l’assenza di appiccicosità che evita l’attacco continuo tra due

cromosomi e problemi durante la replicazione.

In tutti gli eucarioti almeno la metà del genoma è dato da elementi genetici mobili. Questi sono presenti sia

nell’eterocromatina sia nell’eucromatina ma trasferendosi andranno principalmente nella prima perché non

verranno trascritti. tRNA, rRNA, mRNA

La trascrizione genera quattro classi principali trascritti, o di molecole di RNA:

- RNA messaggero è un intermedio per la sintesi proteica: molecola usata per sintetizzare una

proteina.

- RNA transfer porta l’amminoacido.

- RNA ribosomico contribuisce a costruire i ribosomi che sono sede della sintesi proteica.

- piccoli RNA nucleari o micro RNA (small nuclear) possono guidare i processi di modificazione

epigenetiche di specifici geni, ovvero sono frammenti di RNA che servono per riconoscere geni la

cui espressione deve essere modulata. Fanno si che un gene possa essere più o meno espresso in

funzione di specifiche necessità.

Questi micro RNA sono prodotti da tutte le cellule e le possiamo trovare anche nel nostro plasma, negli

spermatozoi, negli oociti, ecc.; essendo quindi presente sia negli spermatozoi che nelle cellule uovo si può

dire che c’è una sorta di trasmissione riguardo al modo in cui alcuni geni devono funzionare.

Procarioti ed eucarioti posseggono entrambi l’RNA messaggero, il tRNA e l’rRNA, mentre l’snRNA si trova

solo negli eucarioti. Per il momento è importante ricordare che soltanto le molecole di mRNA vengono

tradotte in proteine.

[Stiamo parlando di RNA quindi non abbiam la timina, ma uracile.]

Anche alcuni RNA possono presentare dei ripiegamenti che sono essenziali per il funzionamento delle

molecole.

Ci sono due categorie:

- RNA messaggeri che rimangono sempre lineari. Questi devono essere letti dai ribosomi, quindi non

possono presentare ripiegamenti o appaiarsi ad altre molecole.

- Gli RNA transfer e gli RNA ribosomici presentano ripiegamenti fondamentali per la funzione di

queste molecole.

La classica struttura con cui si ripiegano gli RNA è chiamata struttura “stem-loop”: si forma il loop perché un

tratto dell’rna è complementare all’altro; si formano quindi dei poti ad idrogeno che stabilizzano il

ripiegamento della molecola. Il loop può essere di grande o di piccole dimensioni.

 tRNA

il tRNA ha una struttura a “quadrifoglio”: se contassimo i loop sono quattro e non tre, uno è molto piccolo

però e spesso non viene contano, quindi invece che quadrifoglio si dice a “trifoglio”.

Le funzioni del tRNA sono due:

- Portare l’amminoacido che si attacca sempre all’estremità 3’ della molecola di tRNA.

- scegliere l’amminoacido da inserire in base all’anticodone.

Un gruppo di tre nucleotidi consecutivi sull’mRNA costituisce un codone: gruppo di tre amminoacidi che

porta l’informazione che mi dice a quale amminoacido corrisponde una determinata tripletta.

L’anticodone, quindi, è la struttura complementare sul tRNA che

riconosce il codone dell’mRNA.

Generalmente la maggior parte dei tRNA ha una sequenza in cui

tutta l’informazione che viene trascritta gli consente di poter

ripiegarsi e quindi dare una forma di tRNA matura.

Può accadere che alcuni tRNA contengano sequenze che non

devono essere presenti nel tRNA maturo. Queste sequenze sono

chiamate introni: tratto di DNA presente in un gene, che vene

trascrittom ma che poi deve essere eliminata.

Gli introni sono generalmente assenti nei procarioti.

Nel caso della slide l’introne deforma l’ansa 2; per risolvere il

problema il tRNA compie un’azione chiamata self-splicing, ovvero

quel processo attraverso il quale vengono eliminati gli introni.

Si definisce “self” perché eleminano da soli gli introni, senza l’aiuto

di altre molecole.

Per tutti i tipi di RNA si partirà sempre da una molecola primaria chiamata precursore, che in secondo

momento dovrà essere modificata per poi diventare una molecola di tRNA matura. Questo processo è

chiamato maturazione. Come si attaccano gli amminoacidi?

Il legame è mediato da enzimi, non è

spontaneo. Questi enzimi sono

chiamati amminoacil trna sintetasi il

loro compito è quello di catalizzare la

formazione di un legame tra un tRNA

e un amminoacido.

L’enzima quindi prende un

amminoacido libero e lo lega con un

legame covalente all’estremità 3’

libera del tRNA. Di questi enzimi ne esiste uno per ciascun amminoacido, quindi ci sono 20 enzimi.

Ogni aaRS riconosce il suo particolare amminoacido e il tRNA che codifica per quell'amminoacido. La

traduzione accurata del codice genetico dipende dall'attaccamento di ciascun amminoacido a un tRNA

appropriato.

È un processo che richiede ATP.

Cosa accade se si carica un amminoacido sbagliato

sul tRNA?

In questo caso entra in gioco la correzione di bozza

attuata dalle amminoacil trna sintetasi che hanno

anche un’attività di proofreading, ovvero proprio la correzione di bozza. Se l’enzima si accorge di aver

sbagliato, stacca l’amminoacido e ci inserisce quello giusto.

Alcune sintetasi dell'aminoacil-tRNA sono note per avere siti catalitici separati che rilasciano per idrolisi

aminoacidi inappropriati che vengono erroneamente attivati o trasferiti in modo errato al tRNA.

Ad esempio, l'amminoacil-tRNA sintetasi per isoleucina (IleRS) una piccola percentuale delle volte attiva

l’amminoacido valina strettamente correlato alla valina-AMP.

Dopo che la valina è stata trasferita a tRNAIle, producendo valina-tRNAIle, viene rimossa dall'idrolisi in un

sito attivo separato di IleRS che ospita la valina ma non le isoleucina più grandi.

Codice genetico: è la corrispondenza delle triplette sul DNA o sull’RNA con gli amminoacidi. Il codice

genetico non è il genoma, ovvero il messaggio, ma è una tabella che ci permette di passare dalle triplette

ad un amminoacido codificato.

N.B: Il codice genetico non è il contenuto, non fa riferimento all’informazione, ma è una tabella che mi

permette di passare da nucleotidi ad amminoacidi. !!!!

Il tRNA è il mezzo con cui noi realizziamo il codice genetico.

Gli amminoacidi vengono sintetizzati prima di essere caricati; questo con un’unica eccezione : i batteri, in

cui viene messa la formilmetionina invece che la metionina come inizio. tRNAfMet viene dapprima caricato

con metionina, in seguito la Methionyl-tRNA formiltransferasi catalizza quindi la formilazione della frazione

di metionina, utilizzando il tetraidrofolato come donatore di formile, per produrre la formilmetionina-

tRNAfMet.

 rRNA

Gli rRNA, assieme alle proteine ribosomiche, costituiscono i ribosomi.

I ribosomi sono la sede fisica in cui avviene la sintesi proteica o traduzione. Essi sono quegli organuli dentro

ai quali avviene la sintesi proteica.

Sono distinti in due subunità che intervengono in momenti diversi dall’inizio della traduzione.

Ogni subunità è data sia da RNA che da proteine.

L’unità di misura dei ribosomi è il coefficiente di sedimentazione (S).

I ribosomi citoplasmatici eucariotici sono più grandi e più complessi rispetto ai ribosomi procariotici; infatti

n ei procarioti il ribosoma completo è 70S, negli eucarioti è 80S .

Sia nei procarioti che negli eucarioti i ribosomi sono formati da una subunità maggiore e una minore. Nei

procarioti quella minore è 30S e quella maggiore 50S, mentre negli eucarioti la subunità minore è 40S e

quella maggiore è di 60S.

Il peso totale non è la somma dei pesi singoli delle due subunità, la costane di sedimentazione cambia

nell’unione delle subunità.

Conosciamo molte proteine ribosomiche,

ovvero quelle proteine che si assemblano

all’rRNA per ottenere il ribosoma.

PROCARIOTI:

Nei procarioti sono presenti tre tipologie di

RNA ribosomico che vengono divise rispetto

al loro coefficiente di sedimentazioni :

5S

- 16S

- 23S

-

Queste tre molecole sono prodotte a partire

da un unico gene, quindi in un’unica attività

trascrizionale. Attraverso un processo di

trascrizione viene prodotta una grossa

molecola di RNA che contiene tutte e tre le

molecole ribosomiche (questa grossa

molecola è chiamata precursore).

Nella slide le parti verdi non sono altro che le

tre tipologie di ribosomi, mentre le parti

arancioni sono gli spaziatori interni che

servono per capire dove finisce una molecola

e inizia l’altra. Il ruolo degli spaziatori è quello di

separare le tre molecole e di creare uno

spazio nel quale si possa poi andare a

tagliare per separarli. I tagli sono operati

da particolari enzimi chiamati da RNAsi

III.

Una volta che le tre molecole sono state

tagliate, ad ognuna di esse è rimasto

attaccato, alle estremità, un pezzo degli

spaziatori che però vengono eliminati.

Il filamento iniziale di RNA è chiamato

unità trascrizionale rRNA o rDNA, per dire che è quel gene che contiene tutte le informazioni per produrre

queste tre molecole.

Una volta che queste tre molecole sono formate devono ripiegarsi su se stesse: formano strutture stem-

loop per ottenere una forma complessiva finale globulare.

A questo punto, queste strutture ripiegate, possono essere integrate con le proteine ribosomiche e

formeranno quindi la subunità maggiore e quella minore che si assembleranno poi durante la trascrizione.

Una caratteristica importante del ribosoma 16S è che ha una sequenza specie specifica per i batteri: grazie

a questa sequenza si è riusciti a dare un nome ai batteri che appunto cambiava da specie a specie.

EUCARIOTI:

anche negli eucarioti le proteine ribosomiche si legano agli RNA ribosomici, che non sono più tre, ma sono

quattro:

- 5S

- 5,8S

- 18S

- 28S

Mentre nei procarioti i tre ribosomi venivano sintetizzati su un unico filamento di RNA, in questo caso i

ribosomi 5S vengono prodotti da un gene che produce solo il 5S.

Gli altri tre ribosomi sono contenuti in un’unica unità trascrizionale.

Il meccanismo è uguale a quello dei procarioti, l’unica variazione sta nel fatto che gli spaziatori non vengono

tagliati tutti simultaneamente, ma uno alla volta, in modo tale da liberare un ribosoma per volta.

In una parte degli eucarioti, come nei funghi, sono importanti due spaziatori (dopo il 5,8S e il 18S) perché

presentano una sequenza specie specifica: se identifico la sequenza essa sarà specifica per ciascun fungo.

Nelle altre piante e negli altri animali non funziona.

Anche in questo caso una volta che si ottengono le molecole lineari, vengono poi ripiegate per assumere

forma globulare e vengono poi assemblate con le proteine.

Tre dei quattro RNA ribosomici vanno nella subunità maggiore, tranne il 18S che va in quella minore.

In entrambi i casi abbiamo la sintesi di un precursore che deve essere tagliato e poi ripiegato.

 mRNA

l’mRNA è una molecola che viene prodotta, usata e poi degradata, ha quindi una vita breve.

Viene chiamato “messaggero” perchè porta l’informazione, è l’intermedio tra DNA e proteina.

Nel 1956 Watson e Crick definiscono il “dogma centrale della biologia molecolare” secondo il quale c’è un

ordine obbligatorio della lettura dell’informazione DNARNA proteina.

È vero che l’informazione dal DNA viene trascritta in RNA e poi tradotta in proteina, ma può avvenire anche

il contrario, ad esempio nella trascrittasi inversa, in cui da un RNA posso risalire al DNA.

Gli RNA messaggeri sono lineari, devono subire anche processi di maturazione: i nostri geni hanno

sequenze non codificanti che devono essere eliminate (introni) , l’RNA, nel 99% dei geni, contiene introni.

Quando un gene presenta degli introni, essi vengono tutti trascritti in un mRNA precursore che contiene,

quindi, una copia degli introni. Questi ultimi devono essere eliminati tramite un processo di splicing

canonico: tutti gli introni presenti in un gene sono rimossi (diverso da splicing alternativo).

Gli introni sono sequenze che non rimangono nella molecola matura.

Il tratto che rimane presente, ovvero la porzione codificante, si chiama esone: pezzo di RNA che deve essere

presente nella molecola matura. L’esone è la parte codificante di un RNA.

Un RNA messaggero è fatto da esoni alternati ad introni.

Gli esoni e gli introni vengono numerati. La lunghezza degli introni negli eucarioti è estremamente variabile,

mentre non sono presenti nei procarioti.

La lunghezza degli introni va da qualche decina di nucleotidi fino a decine di migliaia. Se un trasposone

arrivasse dentro un introne non arrecherebbe danno; infatti molti introni sono diventati grandi perché

contengono sequenze che non c’entrano nulla con l’introne, ma tanto poi viene eliminato quindi non è un

problema.

Gli RNA messaggeri devono subire altre due modificazioni:

- una riguarda estremità 5’ questa estremità troviamo legato il Cap che è una 7-metilguanosina.

a

Ovvero in 5’ tutti i messaggeri presentano questa molecole. Il processo è chiamato capping.

Questa molecola serve per

identificare dove comincia l’RNA

messaggero: se devo sintetizzare

una proteina devo sapere da dove

iniziare.

- una riguarda estremità 3’ viene

aggiunta una coda poly(A), coda

formata da tutte adenine. L’enzima

che si occupa dell’attacco delle

adenine all’estremità è chiamato

poly(A) polimerasi: aggiunge in 3’ una coda che può variare da 50 a 250 adenine.

Questa coda di adenine serve per stabilire la lunghezza della vita dell’mRNA: più è lunga la coda più è lunga

la vita della molecola dell’RNA messaggero, al contrario, più è corta minore sarà la vita dell’RNA.

Può capitare che non sia presente la cosa di adenine, in questo caso l’RNA viene eliminato subito.

Queste tre modifiche sono chiamate modifiche post-trascrizionali e sono:

- splicing

- capping

- poly(A).

Tutte e tre le modifiche avvengono nel nucleo, solo gli RNA che hanno subito correttamente queste

modifiche possono uscire, arrivare nel citoplasma e iniziare la traduzione.

Nei procarioti non ci sono gli introni e non c’è il nucleo, questo comporta che non è più necessario lo

splicing: se non ho il nucleo, l’RNA si trova già nel citoplasma. Nei procarioti si possono produrre RNA che

non devono essere maturati e possono essere direttamente utilizzati.

In questo caso si può avere contemporaneità tra traduzione e trascrizione: mentre l’RNA è ancora in fase di

sintesi, i ribosomi possono cominciare la traduzione nel pezzo già sintetizzato.

Questo vuol dire che si guadagna tempo e posso rispondere in modo più veloce ad uno stimolo.

Si dice anche che trascrizione e traduzione sono co-lineari: l’informazione trascritta è la stessa che viene

tradotta.

Mentre nei procarioti si preferisce avere la velocità di risposta, negli eucarioti si preferisce la “perfezione”

del messaggio.

Mentre nei batteri c’è un'unica RNA polimerasi che produce tutte e tre le tipologie di RNA, negli eucarioti

abbiamo tre RNA polimerasi:

- RNA polimerasi I che produce solo quelli maggiori: 5,8 S; 18 S e 28 S

- RNA polimerasi III che produce il 5S, i tRNA e i piccoli RNA nucleari.

- RNA polimerasi II che trascrive gli RNA messaggeri.

Il problema è che il DNA ha due filamenti, si trascrivono entrambi?

Mi serve qualcosa che dica alla polimerasi quale filamento usare come stampo.

Quando una RNA polimerasi deve iniziare a lavorare come fa?

L’RNA polimerasi ha in comune con la DNA polimerasi il fatto che entrambe sintetizzano solo in direzione

5’3’. L’informazione su dove iniziare la trascrizione è scritta nel DNA a livello dei promotori che non è altro

che un tratto di DNA che si trova a monte di un gene e dice ad una polimerasi dove inizia il gene e gli dice

anche in che direzione deve trascrivere (il promotore non viene trascritto).

Nel momento in cui il promotore mi dice da che parte va il gene, mi dice quale filamento usare come

stampo.

Un promotore quindi dà parecchie

informazioni:

- dove comincia un gene

- in che direzione deve andare la

trascrizione

- il momento in cui deve essere

trascritto

- il luogo in cui questo gene deve essere usato (cervello, fegato ecc.).

Mi dice come, dove e quando.

Il promotore è anche chiamato regione di controllo prossimale.

“prossimale” perché è vicino all’inizio del gene, si trova subito prima del nucleotide che deve essere

trascritto.

Possono esserci anche delle regioni di controllo distali o enhancer: regioni più lontane, generalmente in 5’

e servono per modulare l’intensità della trascrizione, non la attivano o la spengono.

Il promotore inizia o finisce la trascrizione, mentre l’enhancer ne regola l’intensità.

Come fa l’enhancer a trascrivere un gene lontano?

Il DNA può essere piegato al livello dell’enhancer in modo tale che quel gene possa essere trascritto. Si

forma l’intermedio di attivazione ad ansa: ripiegamento che si forma solo quando serve.

Il nostro viso è controllato più da 1000 enhancer. Ad esempio la patologia del labbro leporino è causata dal

non funzionamento del promotore, quindi non viene

trascritta una parte di “labbro”, mentre la carnosità delle

labbra è dettata dall’enhancer che mi regola la trascrizione

di quel particolare gene.

Nel caso dei procarioti le RNA polimerasi riconoscono

direttamente i promotori, mentre negli eucarioti le RNA

polimerasi non sono in grado di riconoscere da sole i promotori, hanno bisogno di proteine che indichino ai

promotori dove attaccarsi.

Queste proteine sono i fattori di trascrizione: proteine che riconoscono il promotore.

I fattori di trascrizione reclutano il promotore indicando loro come devono lavorare.

Il promotore essenziale o core promoter determina il sito di inizio della trascrizione e dirige il legame

dell’RNA polimerasi II. I promotori essenziali più frequenti per l’RNA polimerasi II sono:

- TATA box: la sua sequenza è altamente conservata (TATAAA); si trova prevalentemente in geni che

vengono trascritti rapidamente, ed è localizzata ~25- 30 bp a monte del sito di inizio della

trascrizione. La TATA box dirige l’inizio della trascrizione a siti ben definiti.

- Isole CpG: proprio di molti geni “house-keeping”. La trascrizione comincia a siti multipli disseminati

in una regione di circa 20-200-bp.

La polimerasi sa come lavorare in funzione ai fattori di trascrizione che si sono legati, quindi, ad esempio,

tutti i geni che devono essere espressi nei linfociti avranno un promotore simile, così come nei neuroni ecc.

Agli enhancer si legano fattori di trascrizione che riconoscono l’enhancer.

Questo significa che l’espressione genica degli eucarioti è sotto stretto controllo, ci sono più interruttori in

modo che un gene venga attivato in modo regolato.

L’inizio della trascrizione da parte dell’RNA polimerasi II richiede molteplici fattori di trascrizione che

possiamo distinguerli in:

1. Fattori di trascrizione generali (GTF) insieme con l’RNA Pol II formano l’apparato trascrizionale

basale, che lega il promotore essenziale ed è sufficiente alla trascrizione in vitro

– TBP (che con i fattori associati a TBP (TAF) forma -> TFIID)

– TFIIA, TFIIB, TFIIF, TFIIE, TFIIH

2. Fattori di trascrizione specifici, anche richiesti per la trascrizione attivata: servono per reclutare e

assemblare l’apparato trascrizionale

– Si legano a elementi di riconoscimento sul promotore e sull’enhancer

– Multipli fattori di trascrizione sono normalmente coinvolti nell’attivazione di un gene

Sulla base della struttura del promotore possiamo distinguere i modi in cui i geni verranno trascritti:

possiamo prendere un gene che non abbiamo mai studiato e capire quando verrà espresso guardando il

promotore.

In tutti gli organismi viventi le informazioni contenute nel genoma non si esprimono contemporaneamente,

e sono finemente regolate.

Ci sono:

- Geni ad espressione costitutiva ci sono in tutti i tipi cellulari (vengono chiamati anche

housekeepig), esempio il gene che codifica l’RNA polimerasi, gli istoni, le DNA polimerasi. Avranno

tutte un promotore dello steso tipo che dice alla cellula di esprimere i geni in tutte le cellule.

- Geni ad espressione condizionale (inducibili, reprimibili) indotti in specifiche condizioni, esistono

proteine da shock termico che si accendono solo a seguito di uno stimolo. Geni che attivo solo in

specifiche condizioni; è sempre il promotore che mi dice quando attivarli.

- Geni specializzati (tessuto specifici, che a loro volta possono essere costitutivi o condizionali)

sono geni che si devono esprimere solo o in una particolare fase dello sviluppo o in uno specifico

tipo cellulare. L’emoglobina fetale ad esempio, prodotta solo nel feto.

- Gene a tessuto specifico ad esempio sono i neurotrasmettitori.

Il processo di differenziamento cellulare (da uno zigote arrivo a cellule diverse) è un processo per cui le

cellule iniziano a esprimere geni diversi.

L’insieme dei geni espressi insieme viene chiamato batteria genetica.

Una cellula viene specializzata perché le si dice quali geni esprimere; in funzione dei geni che utilizzo

differenzio le cellule.

I promotori e il controllo del differenziamento sono molto studiati.

TRASCRIZIONE

Si distingue in tre fasi: inizio, allungamento e termine.

Inizio la regione che contiene il gene e che deve essere

trascritta viene rimodellata attraverso una

decondensazione della cromatina che prevede l’utilizzo di

gruppi metilici. In questo modo è possibile accedere e

modificare gli istoni. In seguito ulteriori proteine si

legheranno alla regione regolatrice del gene e si avrà

l’assemblaggio del complesso di preinizio al promotore.

L’RNA polimerasi interagisce con il promotore. Il modo in cui

avviene questa interazione fra l’RNA polimerasi e il promotore

definisce la direzione della trascrizione e, quindi, indica all’enzima

quale filamento del DNA è lo stampo e dove deve iniziare la

trascrizione. La sequenza del promotore serve cioè ad orientare

l’RNA polimerasi in modo che la trascrizione cominci all’inizio del

gene, e assicura che l’inizio della sintesi di ogni RNA abbia luogo

nello stesso punto.

Un gene con il proprio promotore è un’unità indipendente. Ciò

vuol dire che il filamento della doppia elica utilizzato come stampo è gene-specifico. In altre parole, alcuni

geni usano un filamento del DNA come stampo, mentre altri geni usano l’altro filamento.

Le Rna polimerasi per iniziare a sintetizzare Rna non hanno bisogno di un primer come la Dna

polimerasi. Il filamento di Dna che agisce da stampo viene chiamato anti-senso mentre l’altro è

detto senso (porta la stessa sequenza di Dna rispetto all’Rna che voglio produrre e per questo

motivo non possono essere complementari).

La direzione di lettura dello stampo è 3’-5’ mentre la sequenza di sintesi è 5’-3’.

Termine

procede fino a quando non si incontra una sequenza di

terminazione Rho-dipendente (proteina). Per altri geni

è il nucleo enzimatico dell’RNA polimerasi che termina

da solo la trascrizione formando una struttura a stem-

loop; in questo caso i terminatori sono chiamati Rho-

indipendenti.

Processo di maturazione del pre-mRNA

La produzione di RNA messaggeri dai geni con introni prevede la trascrizione del gene da parte dell’RNA

polimerasi II, l’aggiunta del cappuccio in 5’ e della coda di poli(A) per produrre la molecola di pre mRNa, e il

processo di maturazione del pre-mRNA nel nucleo per rimuovere gli introni e unire gli esoni fra di loro per

formare l’mRNA maturo.

Un tipico introne inizia con la sequenza 5’-GU, e finisce con AG-3’. Nel nucleo gli introni del pre-mRNA

vengono rimossi, e gli esoni uniti mediante il processo di splicing (taglio) dell’mRNA.

Gli eventi dello splicing hanno luogo in un complesso chiamato spliceosoma, formato dal pre-mRNA legato a

piccole particelle nucleari ribonucleoproteiche (snRNP). Le snRNP sono costituite da piccoli RNA nucleari

(snRNA) associati a proteine. I cinque snRNA principali sono U1, U2, U4, U5 e U6; ciascuno di essi è

associato ad un certo numero di proteine per formare le snRNP.

Gli snRNA U4 e U6 si trovano insieme nella stessa snRNP,

mentre gli altri si trovano ciascuno in una snRNP propria.

Processo di separazione:

1. La snRNP U1 se lega al sito di splicing al 5’

dell’introne.

2. La snRNP U2 si lega ad una sequenza chiamata

sequenza del punto di ramificazione, situata a

monte del sito di splicing 3’.

3. Una snRNPU4/U6 e una snRNP U5 interagiscono, e

così associate si legano alle snRNP U1 e U2.

Determinando il ripiegamento dell’introne e

posizionando i suoi due siti di splicing vicini l’uno

all’altro.

4. La snRNP U4 si dissocia, e si ha la formazione dello

spliceosoma attivo.

5. Le snRNP nello splicesoma tagliano l’introne dall’esone a livello del sito di splicing in 5’, e l’estremità

5’ dell’introne, ora libera, si lega ad uno specifico nucleotide A nella sequenza del punto di

ramificazione. A causa della sua somiglianza con il lazo dei cowboy, la struttura risultante è chiamata

struttura di RNA a lazo.

Questi introni esistono anche se in qualche caso vengono buttati perché la maggior parte dei geni effettua

splicing alternativo e mi permettono di produrre varianti (la stessa sequenza di Dna può essere tagliata in

vari modi e miscelare esoni diversi che produrranno Rna variabili) di una proteina che possono attuare o

bloccare la trascrizione. In questo modo potranno essere prodotte una gran quantità di proteine diverse. A

questo punto l’idea è che più introni inserisco in una proteina più forme di splicing posso fare a patto che

non vadano ad intaccare i domini funzionali.

PROCARIOTI

l’mRNA sintetizzato dall’RNA polimerasi non deve subire alcun controllo, fatta eccezione per il controllo

trascrizionale, prima di essere tradotto dai ribosomi. Inoltre non essendoci alcuna membrana nucleare, la

traduzione dell’mRNA può iniziare mentre la trascrizione sta ancora procedendo. Questo porta

all’accoppiamento dei processi di trascrizione e di traduzione entrambi nel citoplasma.

EUCARIOTI

in questo caso vi sono vari step come i controlli trascrizionali, post-trascrizionali e anche effettuati dalla

membrana nucleare mentre è attraversata. In seguito una volta che l’mRNA si trova nel citoplasma può

essere degradato o continuare il processo di sintesi proteica. Se continua vi saranno altri punti di controllo

che porteranno la proteina a ripiegarsi e a continuare il processo oppure potranno intervenire le ubiquitine

e fermare all’ultimo la sintesi.

TRADUZIONE

La produzione degli amminoacidi può

essere ricondotta a quattro gruppi diversi:

acidi, basici, neutro polari e neutro

apolari in base al gruppo R che legano.

Distinguendo questi gruppi posso

determinare l’effetto derivante da una

modificazione in seguito all’aggiunta di un

amminoacido dello stesso gruppo o

diverso.

Il primo esperimento effettuato intorno al 1960 da Crick aveva come obbiettivo quello di capire quanti

nucleotidi vengono letti per codificare un amminoacido.

La prova che il codice genetico è un codice a triplette, ovvero che un gruppo di tre nucleotidi (codone) di un

mRNA codifica per un amminoacido di una catena polipeptidica, venne da esperimenti genetici effettuati sul

batteriofago T4 da Francis Crick. T4 è un fago virulento, il che significa che quando infetta E.coli va incontro

al ciclo litico, generando una progenie di 100-200 fagi che vengono rilasciati al momento della lisi cellulare.

Alcuni mutanti T4 presentano alterazioni del ciclo litico; in particolare, i mutanti rII producono placche

+

chiare nel ceppo di E.coli B, mentre il ceppo selvatico r forma placche torbide.

Crick e i suoi colleghi partirono da un ceppo mutante rII prodotto mediante il trattamento del ceppo r+ con

il mutageno proflavina, un composto chimico che induce mutazioni.

La proflavina determina l’inserzione o la delezione di una coppia di basi nel DNA. Quando tali mutazioni si

verificano a carico della porzione di un gene che codifica per un amminoacido, costituiscono mutazioni

frameshift (mutazioni per scivolamento della fase di lettura).

L’aggiunta o la perdita di una singola coppia di basi in questa regione determina un’alterazione della lettura

delle parole che seguono il punto in cui è avvenuta l’inserzione o la delezione; di conseguenza, la sequenza

alterata codificherà per un gruppo di amminoacidi diversi.

Crick e i suoi colleghi dedussero che, se il fenotipo mutante rII era dovuto ad una inserzione o ad una

delezione, il trattamento con proflavina del mutante rII vrebbe potuta far revertire la mutazione allo stato

selvatico r+. il processo per cui il mutante ritorna allo stato selvatico viene definito reversione e il ceppo

selvatico ottenuto in questo modo è detto revertante.

Se la mutazione originale era un’inserzione, avrebbe potuto essere corretta con una delezione, così come se

era una delezione, avrebbe potuto essere corretta con una inserzione.

I ricercatori isolarono un certo numero di ceppi r+ revertanti piastrando una popolazione di fagi mutanti rII

trattati con proflavina su E.coli, su cui solo gli r+ possono andare incontro a ciclo litico dando origine a

placche. Questo approccio rese agevole la selezione e l’isolamento dei revertanti r+ prodotti dal trattamento

con proflavina.

Alcuni revertanti derivano da una correzione esatta della mutazione originale, cioè una delezione per

un’inserzione o un’inserzione per una delezione. Un secondo gruppo di revertanti risultò molto più utile

per stabilire la natura del codice genetico; esso si originava da una seconda mutazione all’interno del genere

rII, molto vicina, ma distinta, rispetto al sito di mutazione originario.

Per esempio, se la prima mutazione era rappresentata dalla delezione di una singola coppia di basi, la

reversione comportava l’inserzione di una coppia di basi nelle immediate vicinanze (in questo caso si

verificherebbe una mutazione frameshift perché i codoni che seguono il punto in cui è avvenuta la

delezione sono cambiati).

Questa mutazione può revertire aggiungendo una coppia di basi nelle vicinanze. La seconda mutazione ha

pertanto ricostituito la fase di lettura corretta producendo un polipeptide quasi di tipo selvatico. Fino a

quando gli amminoacidi non corretti incorporati nella piccola regione compresa tra le due mutazioni non

hanno effetto significativo sulla funzionalità del polipeptide, il doppio mutante avrà un fenotipo normale o

vicino alla normalità.

Il passo seguente di Crick e i colleghi consistette nel combinare in vario numero mutazioni rII geneticamente

distinte, ma o tutte inserzioni o tutte delezioni per verificare se vi fossero combinazioni in grado di far

revertire i fenotipi rII.

Crick e i colleghi scoprirono che la combinazione di tre inserzioni o di tre delezioni vicine dava revertanti r+.

nessun’altra combinazione, all’infuori di quelle che erano basate su multipli di tre, diede lo stesso risultato.

La conclusione più semplice a cui giunsero per spiegare questo fenomeno fu che il codice genetico è un

codice a triplette.

Per capire come funzionava questo sistema utilizzarono dei sistemi cell-free e filamenti nucleotidici sintetici

di tipo omopolimerico (polimero composto da una sola base, per esempio solo uracile). Osservarono che un

omopolimero composto da UUU un numero n di volte si ottenevano numerose catene di un singolo

amminoacido (UUU ripetuto n volte mi genera la proteina fenilalanina n volte). Ciò può essere fatto anche

con gli altri tre tipi di triplette (CCC, AAA). Per la tripletta GGG non viene codificata nessuna proteina in

quanto la tripletta si ripiega. Siccome il sistema appena descritto

funzionò decisero di utilizzare sistemi cell-

free e filamenti eteropolimerici. Ad

esempio crearono triplette composte da A

e C secondo varie combinazioni.

Dalla figura si può notare come sei triplette

diverse diano solamente quattro

amminoacidi, quindi alcune triplette sono sinonime: triplette diverse ma che codificano per lo stesso

amminoacido.

A questo punto decisero di creare degli eteropolimeri a sequenza nota, osservando che da sequenze di RNA

si ottengono varie combinazioni di amminoacidi. Il problema era che non erano in grado di distinguere

quale di queste triplette codificava per un

determinato amminoacido.

Si arriva all’esperimento di Niremberg e Leder

(pag 97) nel 1964: a loro interessava vedere quale tRNA era specifico per ciascuna tripletta. Osservarono

che si poteva lavorare con singole triplette senza utilizzare lunghe sequenze di RNA: inserendo un polimero

dato da triplette identiche solo uno specifico amminoacido si poteva legare. Se si marca un amminoacido e

lo si prova a legare con tante triplette diverse, troverò quale tripletta si legherà con ogni amminoacido.

Ripeterono l’esperimento per tutti gli amminoacidi e definirono il codice genetico: 64 triplette di cui solo 61

codificanti e tre (UAA, UGA, UAG) con funzione di stop. Uno dei 61 codoni, la tripletta AUG viene usato per

l’inizio della sintesi proteica e sintetizza la metionina (tutti i geni iniziano con la stessa tripletta).

Nel caso in cui una mutazione inserisca un segnale di stop troppo presto, porterà la sintesi a bloccarsi con la

formazione di una proteina tronca e una mutazione non-senso.

Il 5’-UTR è qualcosa che rimane nel trascritto maturo ma non porta informazione nella sintesi della

proteina. È diverso da un introne. Vi sarà anche il corrispondente 3’-UTR e tra questi due vi sarà la porzione

codificante tra il segnale AUG e una tripletta di stop.

CODICE GENETICO

può essere descritto da alcune caratteristiche peculiari:

è organizzato in triplette

- è universale: quasi tutti gli organismi condividono lo stesso linguaggio genetico

- è letto in modo continuo

- non vi sono interruzioni o sovrapposizioni: l’mRna viene letto in gruppi successivi di tre nucleotidi

- è degenerato o meglio ridondante (più triplette codificano per uno stesso amminoacido)

- ha segnali di inizio e di fine

- il codice è degenerato: tranne due eccezioni (AUG, unico codone specifico per la metionina e UGG,

- unico codone specifico per il triptofano), per ogni amminoacido è presente più di un codone.

Questa capacità di codifica multipla è chiamata degenerazione o ridondanza del codice.

Il codice ha dei segnali di inizio e di fine. Nel codice sono contenuti segnali specifici per l’inizio e la

- fine della sintesi proteica. Sia negli eucarioti sia nei procarioti AUG (metionina) è quasi sempre il

codone di inizio della sintesi proteica. Soltanto 61 dei 64 codoni codificano per amminoacidi: tali

codoni vengono definiti codoni senso. Gli altri tre codoni (UAG, UAA, UGA) non codificano per

nessun amminoacido e in cellule normali non esiste alcun tRNA che rechi l’anticodone appropriato.

Questi tre codoni sono i codoni di stop, chiamati codoni non senso o codoni di temrinaizone.

Vengono utilizzati per segnalare la fine del polipeptide.

Nell’anticodone avviene il fenomeno del vacillamento. Dal momento che 61 codoni senso codificano

- per amminoacidi nell’mRNA, esiste un totale di 61 molecole di tRNA che potrebbero portare gli

anticodoni appropriati. Secondo “l’ipotesi del vacillamento”, proposta di Crick, l’insieme dei 61

codoni senso può essere letto d ameno di 61 tRNA diversi, a causa delle proprietà di appaiamento

delle basi nell’anticodone. Nello specifico, la base all’estremità 5’ dell’anticodone (complementare

alla base 3’, ovvero alla terza lettera) non è sottoposta a restrizioni dal punto di vista

tridimensionale come le altre due basi. Questa caratteristica permette un appaiamento delle basi

meno preciso, cosicché la base all’estremità 5’ dell’anticodone può appaiarsi con più di una base

all’estremità 3’ del codone: in altre parole, può vacillare.

La terza base di ogni tripletta viene detta vacillante in quanto non è strettamente necessaria per la sintesi

di un amminoacido: nel caso una mutazione cambi le prime due basi si può avere la produzione di un

amminoacido diverso ma non è sicuro, mentre nel caso cambi l’ultima base si avrà con certezza questa

mutazione.

Nel caso di una mutazione per sostituzione un nucleotide in una tripletta viene cambiato e si genererà un

amminoacido diverso. Mentre se si ha una delezione di un nucleotide le triplette da quel punto in avanti

verranno lette in modo diverso.

Il caricamento del tRNA con l’amminoacido (Pag 101)

L’amminoacido corretto viene legato al tRNA da un enzima detto amminoacil-tRNA sintetasi. Questo

processo viene definito amminoacilazione, o caricamento, e produce un amminoacil-tRNA (o tRNA carico).

Esistono 20 differenti amminoacil-tRNA sintetasi, una per ciascuno dei 20 amminoacidi. Ogni enzima

riconosce particolari caratteristiche strutturali del tRNA che amminoacila.

In primo luogo, l’amminoacido e l’ATP si legano all’amminoacil-tRNA sintetasi specifica. L’enzima quindi

catalizza una reazione in cui l’ATP viene idrolizzato ad AMP, che si lega all’amminoacido dando origine a un

amminoacil-AMP. In seguito, la molecola di tRNA si lega all’enzima, che trasferisce l’amminoacido

dall’amminoacil-AMP al tRNA rilasciando l’AMP. Successivamente, l’enzima rilascia la molecola di

amminoacil-tRNA. 1- L’INIZIO DELLA TRADUZIONE

le tre fasi della sintesi proteica-inizio, allungamento e terminazione- sono simili nei batteri e negli eucarioti.

L’inizio comprende tutte le fasi che precedono la formazione del legame peptidico tra i primi due

amminoacidi della catena polipeptidica e coinvolge una molecola di mRNA, un ribosoma, uno specifico

tRNA iniziatore, i fattori di inizio proteici (IF) e il GTP.

L’inizio nei batteri

Il primo stadio di inizio della traduzione è l’interazione della subunità ribosomiale 30S (minore), a cui sono

legati IF-1 e IF-3, con la regione dell’mRNA che contiene il codone d’inizio AUG. IF-3 facilita il legame della

subunità all’mRNA e impedisce il legame tra le subunità 30S e 50S.

Il codone di inizio AUG da solo non è sufficiente per indicare il punto in cui la subunità 30S dovrebbe legarsi

all’mRNA, ma è richiesta anche la presenza di una sequenza a monte (sul versante 5’ dell’mRNA) del codone

AUG, definita sito di legame al ribosoma (RBS). La regione RBS dell’mRNA oggi è comunemente nota ocme

la sequenza di Shine-Dalgarno. La maggior parte delle sequenze RBS si trova tra gli 8 e i 12 nucleotidi a

monte del codone di inizio. Il modello prevede che la formazione di coppie di basi complementari tra

l’mRNA e l’rRNA 16S consenta alla subunità ribosomiale minore di localizzare sull’mRNA la sequenza

corretta per l’inizio della sintesi proteica.

lo staio seguente nell’inizio della traduzione è il legame di un tRNA iniziatore particolare al codone di inizio

AUG a cui è legata la subunità 30S. Sia nei procarioti che negli eucarioti, AUG codifica per la metionina: in

entrambe le classi di organismi le proteine di nuova sintesi iniziano con la metionina, che in molti casi verrà

poi successivamente rimossa.

Nei batteri, il tRNA iniziatore è il tRNA.fMet che si lega al codone di inizio AUG. Questo tRNA trasporta una

forma di metionina modificata, la formilmetionina (fMet), nella quale al gruppo amminico della metionina è

stato aggiunto un gruppo formilico.

Il tRNA iniziatore, fMet-tRNA.fMet, viene portato al complesso subunità 30S-mRNA da IF-2, che trasporta

anche una molecola di GTP. Il tRNA iniziatore si lega alla subunità a livello del sito P. in seguito, tutti gli

amminoacil-tRNA che giungeranno si legheranno al sito A. tuttavia. Il legame di IF-1 alla subinità 30S blocca

il sito A in modo che solo il sito P risulti disponibile per il tRNA iniziatore. A questo punto si è formato il

complesso di inizio 30S, costituito dall’mRNA, dalla subunità 30S, dal tRNA iniziatore e dai fattori di inizio.

In una fase successiva si verifica il legame della subunità ribosomiale 50S, evento che determina l’idrolisi del

GTP e il rilascio dei 3 fattori di inizio. Il complesso finale viene definito complesso di inizio 70S.

L’inizio negli eucarioti

Negli eucarioti l’inizio della traduzione è simile a quanto avviene nei batteri, anche se è più complesso e

coinvolge molti più fattori di inizio, noti come fattori di inizio degli eucarioti (eIF). Le differenze principali

sono le seguenti:

La metionina iniziatrice non è modificata, nonostante esista anche in questo caso una tRNA

- iniziatore specifico che porta al ribosoma

Le sequenze Shine-Dalgarno non sono presenti sugli mRNA eucarioti, in quanto il ribosoma

- eucariote utilizza un altro meccanismo per riconoscere il codone di inizio AUG. Inizialmente, un

fattore di inizio eucariote eIF-4F si lega al cap all’estremità 5’ dell’mRNA. Successivamente si crea un

complesso formato dalla subunità ribosomiale 40S, dal Met-tRNA iniziatore, da diverse proteine eIF

e dal GTP che, insieme ad altri eIF, si sposta lungo l’mRNA alla ricerca del codone di inizio AUG;

quest’ultimo si trova inserito all’interno di una sequenza, nota come sequenza di Kozak, che lo

identifica come codone di inizio.

Questo processo viene definito modello a scansione per l’inizio della traduzione. Il codone AUG

corretto è quasi sempre il primo codone AUG a partire dall’estremità 5’ dell’mRNA ma, per agire da

codone di inizio, deve trovarsi all’interno di una particolare sequenza.

Una volta trovato questo AUG, la subunità 40S si lega ad esso, seguita dalla subunità 60S che spiazza

gli eIF, formando il complesso di inizio 80S, con il Met-tRNA iniziatore legato all’mRNA nel sito P del

ribosoma.

Anche la coda poli(A) dei messaggeri eucarioti svolge un ruolo nella traduzione. La proteina di

legame al poli(A) II, legata alla coda di poli(A), si lega anche a eIF-4G, una delle proteine del cap,

portando così l’estremità 3’ dell’mRNA in prossimità dell’estremità 5’. In questo modo la coda di

poli(A) stimola l’inizio della traduzione.

2- L’ALLUNGAMENTO DELLA CATENA POLIPEPTIDICA

La fase successiva all’inizio della traduzione è l’allungamento: l’aggiunta di un amminoacido alla volta alla

catena polipeptidica in crescita. Nei batteri, cosi come negli eucarioti, questa fase è costituita da tre

passaggi:

1- Legame dell’amminoacil-tRNA (tRNA carico) al ribosoma a livello del sito A.

2- Formazione di un legame peptidico

3- Migrazione (traslocazione) del ribosoma lungo l’mRNA, un codone alla volta.

Come l’inizio della traduzione, anche l’allungamento necessita di fattori proteici accessori, denominati

fattori di allungamento (EF), e del GTP. Negli eucarioti il processo è molto simile.

Il legame dell’amminoacil-tRNA

All’inizio della fase di allungamento, l’anticodone dell’fMet-tRNA è unito mediante legame idrogeno al

codone di inizio AUG in corrispondenza del sito P del ribosoma. Il codone successivo dell’mRNA si trova sul

sito A. successivamente, l’amminoacil-tRNA apporpiato si lega al codone esposto nel sito A. questo

amminoacil-tRNA viene trasportato al ribosoma legato a EF-Tu-GTP, complesso formato dal fattore proteico

di allungamento Eu-Tu e d auna molecola di GTP.

Quando l’amminoacil-tRNA si lega al codone nel sito A, l’idrolisi del GTP determina il rilascio di EF-Tu-GDP.

EF-Tu viene riciclato.

La formazione del legame peptidico

Il ribosoma mantiene i due amminoacil-tRNA dei siti P e A nella posizione corretta affinchèsi possa formare

il legame peptidico tra i due amminoacidi. I passaggi per la formazione di un legame peptidico sono due: in

primo luogo viene rotto il legame tra l’amminoacido e il tRNA nel sito P. La seconda fase consiste nella

formazione del legame peptidico tra i due amminoacidi; tale reazione è catalizzata dalla peptidil-transferasi.

L’RNA ribosomiale interagisce anche con i tRNA quando essi si legano e vengono rilasciati dal ribosoma.

Pertanto, al contrario di quanto ipotizzato nel passato, le proteine ribosomiali costituiscono le unità

strutturali che facilitano l’organizzazione dell’rRNA negli elementi funzionali chiave dei ribosomi.

Una volta formato il legame peptidico, nel sito P rimane un tRNA privo di amminoacido (un tRNA scarico),

mentre nel sito A, ora detto peptidil-tRNA, è attaccato ai primi due amminoacidi della catena polipeptidica.

La traslocazione

Nell’ultima fase del ciclo di allungamento, la traslocazione, il ribosoma si sposta di un codone lungo l’mRNA

verso l’estremità 3’. Nei batteri, la traslocazione richiede l’attività di un altro fattore proteico di

allungamento, EF-G. Un complesso EF-G-GTP si associa al ribosoma, il GTP viene idrolizzato e il ribosoma si

sposta, mentre il tRNA scarico viene rimosso dal sito P. E’ possibile che l’idrolisi del GTP modifichi la

struttura di EF-G, facilitando l’evento di traslocazione. La traslocazione negli eucarioti è simile; il fattore di

allungamento è in questo caso eEF-2, che agisce in modo analogo a EF-G.

Il tRNA scarico si sposta dal sito P e si lega in modo transiente al sito E della subunità ribosomiale 50S,

bloccando il legame del successivo amminoacil-tRNA al sito A finchè la traslocazione non è completa e il

peptidil-tRNA non è legato in modo corretto al sito P. Successivamente alla realizzazione di tali eventi, il

tRNA scarico viene rilasciato dal ribosoma. Dopo la traslocazione, EF-G viene rilasciato e poi riciclato.

Durante la fase di traslocazione il peptidil-tRNA resta associato al suo codone sull’mRNA e, poiché il

ribosoma si è spostato, viene ora a trovarsi nel sito P (da qui il nome di sito peptidico).

Dopo il termine della traslocazione, il sito A è libero. Un amminoacil-tRNA recante l’anticodone corretto si

lega al nuovo codone esposto a livello del sito A ricompiendo il processo.

L’interno processo si ripete finché la traduzione termina a livello di un codone di stop. Sia nei batteri che

negli eucarioti, una volta che il ribosoma si è mosso dal sito di inizio sull’mRNA, si verifica una altro evento

di inizio. L’intero processo si ripete finchè non si arriva alla traduzione simultanea dello stesso mRNA da

parte di diversi ribosomi. Il complesso che si forma tra una molecola di mRNA e tutti i ribosomi che la

stanno traducendo contemporaneamente viene definito poliribosoma o polisoma. Ogni ribosoma di un

polisoma traduce l’interno mRNA e produce un polipeptide completo. I poliribosomi consentono la

produzione rapida ed efficiente di un gran numero di polipeptidi da un singolo mRNA.

3- LA FINE DELLA TRADUZIONE

La fine della traduzione viene segnalata da uno dei tre codoni di stop (UAG, UAA e UGA), uguali nei

procarioti e negli eucarioti. I codoni di stop non codificano per alcun amminoacido e, pertanto, nella cellula

non esistono tRNA con i relativi anticodoni. Il ribosoma riconosce il codone di stop grazie all’aiuto di

proteine denominate fattori di rilascio (RF), che possiedono una forma che simula quella del tRNA,

comprese le regioni che riconoscono i codoni, e che avviano una serie di eventi specifici della terminazione.

E.coli possiede tre RF, due dei quali riconoscono i codoni di stop: RF1 riconosce UAA e UAG, mentre RF2

riconosce UAA e UGA. Il legame di RF1 e RF2 a un codone di stop induce la peptidil-transferasi a tagliare il

polipeptide dell’mRNA a livello del sito P. il polipeptide lascia quindi il ribosoma.

Successivamente, RF3-GDP si lega al ribosoma, stimolando il rilascio dell’RF dal codone di stop e dal

ribosoma. Il GTP sostituisce quindi il GDP su RF3 e quest’ultimo idrolizza il GTP, evento che permette il

rilascio di RF3 dal ribosoma.

Una fase aggiuntiva importante è rappresentata dallo smantellamento del complesso rimanente formato

dalle subunità ribosomiali, dall’mRNA e dal tRNA scarico, affincheè il ribosoma e il tRNA possano essere

riciclati. In E.coli il fattore di riciclaggio del ribosoma (RRF) si lega al sito A. In seguito, si verifica il legame di

EF-G, che causa la traslocazione del ribosoma e, di conseguenza, lo sposamento di RRF nel sito P e del tRNA

scarico nel sito E. L’RRF rilascia il suo tRNA scarico ed EF-G rilascia l’RRF, provocando la dissociazione delle

due subunità ribosomiali dell’mRNA.

Negli eucarioti, il termine della traduzione è simile a quanto avviene nei batteri. In questo caso, un solo

fattore di rilascio (eRF1) riconosce tutti e tre i codoni di stop ed RF3 induce gli eventi di terminazione. Negli

eucarioti si verifica il riciclaggio del ribosoma, ma non esiste un equivalente dell’RRF.

Terminata la sintesi le proteine (è stata determinata solo la struttura primaria: sequenza di amminoacidi)

neosintetizzate possono subire modificazioni:

fosforilazione: utile per attivare una proteina

- ubiquitinazione: segnala utile per mandare una proteina alla degradazione nel lisosoma

- metilazione: aggiunta di gruppi metili (esempio istoni)

- acetilazione: aggiunta di gruppi acetili (esempio istoni)

- glicosilazione: aggiunta di zuccheri nell’apparato di Golgi

-

Ogni proteina è dotata di un peptide segnale che permette alla proteina di essere trasportata nel luogo

giusto. Questo sarà letto dalla “particella di riconoscimento del peptide segnale”.

MUTAZIONI

Possono essere di tre tipi:

puntiformi: riguardano solo una o poche coppie di basi

- cromosomiche: coinvolgono interi cromosomi o loro porzioni

- genomiche: coinvolgono l’intero genoma e implicano variazioni nell’intero assetto cromosomico

-

Una mutazione puntiforme può cambiare il fenotipo dell’organismo colpito se si verifica nella regione

codificante di un gene, per cui quelle che hanno rivestito una particolare importanza per i genetisti solo le

mutazioni geniche.

i raggi cosmici sono una fonte di mutazione genetica perché sono onde ad alta energia.

Le mutazioni spontanee avvengono nel genoma a causa di complicazioni nel suo funzionamento.

Le mutazioni indotte avvengono quando un organismo è esposto deliberatamente o casualmente ad agenti

fisici o chimici noti come mutageni.

 MUTAZIONI GENETICHE

Riguardano tutti i sistemi biologici. Queste sono alla base dell’evoluzione, perché grazie a loro gli individui

di una specie più deboli vengono eliminati.

È un processo che altera la sequenza di basi del DNA e può essere il cambiamento di una coppia di basi del

DNA (mutazioni geniche) o il cambiamento di un cromosoma (mutazioni cromosomiche).

Possono essere:

somatiche: tutte le caratteristiche mutate si manifestano solo nell’individuo in cui è avvenuta la

 mutazione e non vengono trasmesse alle generazioni successive

germinali: possono essere trasmesse alle generazioni successive attraverso i gameti dando origine ad un

 individuo mutato sia nelle cellule somatiche sia nei gameti.

MUTAGENO: tutto ciò che può mutare il Dna e da cui derivano le mutazioni. Possono essere fisici o chimico.

Alcuni sono anche cancerogeni, ma non vale il contrario.

CANCEROGENO: tutto ciò che fa replicare molto di più le nostre cellule.

Tutti i viventi hanno mutazioni e il tasso di mutazioni spontanee è di 1 nucleotide ogni 10^9.

MUTAZIONE DI UN GENE: sono tutti quei geni che hanno una sequenza diversa rispetto al gene normale

(variante più comune di quel gene in una popolazione sana). La parola “normale” in genetica viene indicato

come “allele selvatico”.

RICORDA: un allele è una forma alternativa di uno stesso gene che differiscono per la sequenza

nucleotidica. Quando avviene una mutazione si crea un allele mutante.

ADATTAMENTO O MUTAZIONE CASUALE?

Per molto tempo ci si è chiesti che relazione c’era tra mutazione ed effetto della mutazione.

Esempio: le mutazioni vengono create indipendentemente dall’antibiotico o è l’antibiotico che le induce?

Le mutazioni sono casuali o indotte dalla selezione?

Nella prima fase del XX secolo esistevano due scuole di pensiero:

alcuni genetisti credevano che la variabilità tra gli organismi fosse dovuta a mutazioni spontanee e

- casuali che alcune volte avevano carattere adattivo.

Altri credevano che la variabilità fosse conseguente all’adattamento, cioè che l’ambiente inducesse

- un cambiamento ereditabile.

Alcune osservazioni ottenute in esperimenti con i batteri diedero vigore al dibattito. Per esempio, se una

coltura derivata da una singola cellula di E.coli viene piastrata in presenza di una grande quantità di

batteriofago T1 virulento, la maggior parte delle cellule verrà lisata. Tuttavia, poche cellule sopravvivranno e

daranno origine a colonie resistenti al fago T1. Il carattere della resistenza è ereditabile. I sostenitori della

teoria dell’adattamento ritenevano che il carattere della resistenza fosse comparso come conseguenza della

presenza del fago T1 nell’ambiente.

Quella della teoria della mutazione spontanea sostenevano che le mutazioni avvengono casualmente,

cosicché, in una popolazione de cellule sufficientemente ampia, in ogni momento alcune cellule andrebbero

incontro a mutazione diventando, per esempio resistenti al T1, pur non essendo mai state in contatto.

Quindi, se in un momento successivo venisse aggiunto il fago, verrebbe operata una selezione delle cellule

resistenti al T1.

Nel 1943 si determinò definitivamente quale fosse il meccanismo utilizzato dai batteri, se le mutazioni

fossero spontanee o indotte dall’ambiente.

Il test ideato dagli studiosi fu il test di fluttuazione (ovvero ripeterono n volte lo stesso esperimento e

guardarono se i risultati si ripresentavano o erano casuali).

Si consideri una popolazione di E.coli originatasi per divisione di un’unica cellula. Assumiamo che il fago T1

venga aggiunto dopo 4 generazioni, quando vi sono 16 cellule.

Se la teoria dell’adattamento fosse corretta, una certa frazione delle cellule della quarta generazione

sarebbe indotta in quel momento a diventare resistente al T1. Di particolare importanza è il fatto che quella

frazione sarebbe identica per tutte le colture dello stesso tipo, perché l’adattamento non ha inizio prima

dell’aggiunta del fago T1.

Al contrario se fosse corretta la teoria della mutazione spontanea, il numero di cellule della quarta

generazione resistenti al fago T1 dipenderebbe da quando è comparsa nella coltura una mutazione casuale

che conferisce resistenza al T1.

Il concetto di base è che, se la teoria della mutazione casuale fosse corretta, dovrebbe esserci una

fluttuazione (variabilità) nel numero di cellule resistenti a T1 in quarta generazione, perché la mutazione

verso la resistenza al T1è avvenuta casualmente nella popolazione e non necessita del contatto con il fago.

I ricercatori dimostrarono una larga variabilità nel numero di colonie resistenti al fago ottenute in identiche

colture. Questi risultati sostenevano l’ipotesi della mutazione casuale e non adattiva.

[I mutanti compaiono tutte le volte che si replica il DNA].

Le mutazioni sono eventi casuali; “casuali” nel senso che non sapremo né in quale gene avverranno né

quando avverranno.

Sappiamo che tutte le volte che replichiamo il DNA ci saranno delle mutazioni, ma non sappiamo quale sarà

il gene mutato.

L’effetto sarà casuale? No. Per una certa mutazione avrò sempre un certo fenotipo.

DEFINIZIONE DELLE MUTAZIONI

Una mutazione è un’alterazione della sequenza di basi nel DNA. Una cellula con una mutazione è una cellula

mutante. Se una mutazione avviene in una cellula somatica, si tratta di una mutazione somatica (le

caratteristiche mutanti si manifestano solo nell’individuo in cui è avvenuta la mutazione, ma non vengono

trasmesse alle generazioni successive). Al contrario, una mutazione può essere anche in linea germinale, se

colpisce le cellule germinali dell’individuo (la mutazione può essere trasmessa attraverso i gameti alla

generazione successiva, dando origine ad un individuo mutato sia nelle cellule germinali che in quelle

somatiche).

Il tasso di mutazione è la probabilità che si verifichi un particolare tipo di mutazione in funzione del tempo,

come il numero di mutazioni per coppia di nucleotidi per generazione, o il numero per gene per

generazione.

La frequenza di mutazione, invece, è il numero di casi di un particolare tipo di mutazione, espresso come

proporzione di cellule o di individui nella popolazione.

Se ad un certo punto vediamo che in una popolazione c’è una frequenza maggiore con cui compare una

patologia, vuol dire che quella popolazione è stata esposta a dei mutageni.

TIPI DI MUTAZIONI PUNTIFORMI



Le mutazioni puntiformi possono essere divise in due grandi categorie:

Le sostituzioni di coppie di basi

- Le inserzioni o delezioni di coppie di basi

-

Una mutazione per sostituzione di una coppia di basi è un cambiamento del DNA tale che una coppia di basi

viene rimpiazzata da un’altra. Vi sono due tipi di tali sostituzioni:

Transizione mutazione che sostituisce una coppia di basi purina-pirimidina con un’altra coppia di



- basi purina-pirimidina, per esempio A-T con G-C.

Transversione è una mutazione che sostituisce una coppia purina-pirimidina con una coppia

- pirimidina-purina, come G-C con C-G.

Le mutazioni per sostituzione di una coppia di basi in geni codificanti per una proteina possono essere

definite a seconda dell’effetto che hanno sulla sequenza di amminoacidi. A seconda di come la base

sostituita viene tradotta secondo il codice genetico, la mutazione potrà avere effetti che vanno da nessun

cambiamento nella proteina, a un cambiamento poco rilevante, a uno con conseguenze gravi.

Mutazioni missenso

-

Una tripletta che codificava per un amminoacido, ora codifica per un diverso amminoacido.

La cosa importante è che l’amminoacido nuovo appartiene ad una categoria chimica differente.

Esempio: l’anemia falciforme. Nelle persone affette da questa patologia c’è stata una mutazione tra acido

glutammico e valina, si forma un’emoglobina che ha un gruppo chimico diverso. Questo fa si che

l’emoglobina da solubile tenda a precipitare.

Per valutare l’effetto andiamo a vedere qual è l’amminoacido cambiato, qual è la proteina interessata e poi

quali effetti avrà.

A noi non interessa avare proteine identiche, ma dobbiamo avere tutte proteine funzionai.

Le mutazione missenso sono importanti quando alterano il modo in cui funziona la proteina.

Mutazione non senso

-

Il termine “non senso” fa riferimento al fatto che una tripletta codificante viene ad essere mutata e si

trasforma in un codone di stop.

Una mutazione non senso determina la produzione di una proteina tronca, ovvero la sintesi della proteina è

finita in modo precoce rispetto alla normalità. In questo caso la proteina sarà corta. Le mutazioni non senso

sono tanto più gravi quanto più avvengono all’estremità 5’ del gene.

Molte forme di albinismo derivano da mutazioni non senso per il gene melanina. Questi organismi

producono la proteina per la melanina, ma non tutta completa, solo un pezzo.

Le mutazioni nonsenso sono più gravi di quelle missenso. Entrambe le mutazioni avranno effetti sul

fenotipo, le altre due no, non necessariamente vedremo l’effetto fenotipico.

Mutazione neutra

-

Una mutazione neutra è un particolare tipo di mutazione missenso in cui avviene la sostituzione di un

codone, quindi l’amminoacido inserito è diverso, ma chimicamente affine al primo. L’amminoacido ha la

stessa carica chimica, quindi anche il gruppo R sarà uguale, per questo motivo la proteina può essere

ripiegata nello stesso modo.

La funzionalità della proteina rimane la stessa. Vengono chiamate neutre perché dal punto di vista della

mutazione si equivalgono: se due individui hanno mutazioni neutre sull’emoglobina ad esempio, entrambe

le emoglobine saranno funzionali.

Le mutazioni neutre ci sono, ma non interessano per studiare la variabilità genetica

Mutazione silente

-

Sono mutazioni in cui cambia la tripletta, ma l’amminoacido codificato rimane lo stesso. Questa operazione

avviene grazie alle triplette sinonime.

Le mutazioni silenti avvengono spesso attraverso cambiamenti a carico della terza posizione-oscillante- di

un codone. Ciò è comprensibile alla luce del fenomeno noto come degenerazione del codice genetico.

Se una o più coppie di basi vengono aggiunte o delete da un gene che codifica per una proteina, la fase di

lettura dell’mRNA risulterà cambiata dal punto della mutazione in poi.

Questo tipo di mutazione è chiamato mutazione frameshift.

Una mutazione frameshift di solito rende non funzionante la proteina, generando nuovi codoni di stop, che

quindi daranno origine ad una proteina troncata; in alternativa possono far continuare la sintesi oltre al

normale codone di stop , dando origine ad un polipeptide più lungo del normale; oppure possono

determinare un’alterazione significativa della sequenza di amminoacidi di un polipeptide.

Le mutazioni frameshift sono state uno degli elementi che hanno permesso di determinare che il codice

genetico è basato su triplette.

In conclusione le mutazioni sono classificate sulla base dell’effetto sul DNA (puntiformi, cromosomiche,

sostituzione, delezione/inserzione, transizione o tranversione) o sulla proteina codificata (nonsenso,

missenso, neutra, silente e frameshift). Le mutazioni possono essere classificate anche sulla base della causa

di insorgenza (spontanee o indotte).

REVERSIONI E MUTAZIONI DI TIPO SOPPRESSORE

REVERSIONI



Le mutazioni puntiformi possono essere divise in due classi in base ai loro effetti sul fenotipo:

Le mutazioni in avanti causano un cambiamento del gene selvatico mutante.

- Mutazioni per reversione (note anche come reversioni o mutazioni indietro) determinano una

- modifica di un gene già mutato agendo nello stesso sito della prima mutazione cosicché la sua

funzione ritorna quella del gene selvatico.

Per reversione si intendono due mutazioni che avvengono sullo stesso nucleotide. La reversione è la

mutazione di una mutazione, o una retro mutazione.

Questo è importante perché come un soggetto è tornato mutante, con una seconda mutazione ritorna

selvatico.

Possiamo parlare di:

Reversione vera se la reversione porta alla codifica dell’amminoacido originale presente nel

- selvatico.

Reversione parziale la reversione porta alla codifica di un amminoacido diverso da quello

- selvatico.

Il revertente è colui che ha avuto due mutazioni nello stesso nucleotide che si sono annullate l’una con

l’altra. SOPPRESSORE



Gli effetti di una mutazione possono essere ridotti o aboliti da una mutazione di tipo soppressore, che è una

mutazione in un sito diverso da quello della mutazione originaria.

La mutazione di tipo soppressore maschera o compensa gli effetti della prima mutazione, ma non la fa

revertire.

Le mutazioni di tipo soppressore possono avvenire all’interno dello stesso gene nel quale si trova la prima

mutazione ma in un sito diverso (soppressori intragenici), oppure in un gene diverso (soppressori

intergenici).

In entrambi i casi i soppressori agiscono riducendo o eliminando l’effetto deleterio della mutazione

originale.

Agiscono però in maniera diversa:

I soppressori intragenici alterano un diverso nucleotide all’interno dello stesso codone nel quale è

- avvenuta la mutazione originale, oppure alterano un nucleotide in un differente codone.

La soppressione intergenica avviene come risultato di una seconda mutazione in un gene diverso. I

- geni che causano la soppressione di mutazioni di altri geni vengono chiamati geni soppressori.

Esempio:

nel caso dei soppressori di mutazioni non senso, specifici geni codificanti per tRNA mutano in modo che i

loro anticodoni riconoscano come codificante per un amminoacido anche un codone di stop nell’mRNA. Di

conseguenza invece che terminare precocemente la sintesi proteica in corrispondenza del codone

nonsenso, il tRNA alterato (soppressore) inserisce un amminoacido in quella posizione e questo

amminoacido può riportare alla funzionalità totale o parziale del polipeptide.

MUTAZIONI SPONTANEE O INDOTTE

La mutagenesi, il processo responsabile della creazione di mutazioni, può avvenire spontaneamente o

essere indotta:

Le mutazioni spontanee avvengono naturalmente per processi intrinseci al DNA.

- Le mutazioni indotte avvengono quando un organismo è esposto ad agenti fisici o chimici, noti

- come mutageni, che interagiscono con il DNA causando mutazioni.

Le mutazioni indotte avvengono di solito con frequenza maggiore delle mutazioni spontanee.

Le nostre cellule prendono in considerazioni tutte le mutazioni che hanno, non distinguono tra spontanee e

indotte, quindi abbiamo un tasso di mutazioni spontanee e un tasso di indotte.

Perciò in base a dove un organismo vive posso stabilire il tasso di mutazione.

Mutazioni spontanee:



tutti i tipi di mutazioni puntiformi possono avvenire spontaneamente. Le mutazioni spontanee possono

avvenire durante la replicazione del DNA o nelle altre fasi della crescita e della divisione cellulare. Possono

essere causate anche da movimenti di elementi genetici trasponibili.

La maggior parte degli errori che avvengono spontaneamente è corretta dai sistemi di correzione del DNA;

solo pochi rimangono non corretti.

Errori della replicazione del DNA

Le mutazioni per sostituzione di coppie di basi- cioè le mutazioni puntiformi che implicano cambiamenti di

una coppia di basi a un’altra- possono avvenire se si verifica un appaiamento errato durante la replicazione

del DNA. Chimicamente, ogni base può esistere in stati alternativi, detti tautomeri. Quando una base

cambia stato si dice che ha cambiato forma tautomerica.

Nel DNA, la forma usuale di ogni base è quella chetonica, che è responsabile del normale appaiamento tra

le basi, secondo Watson e Crick, di T con A e C con G. Tuttavia un appaiamento errato può avvenire se la

base si trova in una forma tautomerica rara, detta enolica.

Se questi errori avvengono nella regione codificante per di un gene strutturale, queste inserzioni o delezioni

nel DNA daranno luogo a mutazioni frameshift, a meno che le basi inserite o delete siano un multiplo di 3.

Cambiamenti chimici spontanei

La depurinazione e la deamminazione di particolare basi sono due dei più comuni eventi chimici che

producono mutazioni spontanee.

La deamminazione è la rimozione di un gruppo amminico da una base. Per esempio la deamminazione della

citosina produce uracile, che non è una normale base del DNA.

Un sistema di riparazione rimuove la maggior parte dell’uracile dal DNA, minimizzando quindi le

conseguenze mutazionali della deamminazione della citosina.

Tuttavia, se l’uracile non viene rimosso, un’adenina verrà inserita al posto di una guanina, durante la sintesi

del nuovo filamento complementare, determinando una mutazione di C-G in T-A per transizione.

Il DNA degli eucarioti e dei procarioti contiene una piccola quantità della base modificata 5-metilciotosina

m m

(5 C), in sostituzione della citosina standard. La deamminazione della 5 C produce timina, determinando il

m

cambiamento della coppia G-5 C in G-T. se tale appaiamento scorretto non è riparato, al successivo ciclo di

replicazione G sarà uno stampo per C, mentre T determinerà l’incorporazione di A nel filamento nuovo. La

conseguenza è che una delle molecole sintetizzate avrà il normale appaiamento G-C, mentre l’altra,

m

mutante, porterà A-T. Di conseguenza, la deamminazione della 5 C determina mutazioni per transizione da

G-C ad A-T.

Questo tipo di mutazione non è corretta molto spesso dai meccanismi di riparazione cellulare, per questo

m

motivo si dice che i punti del genoma in cui si trovano 5 C sono chiamati punti caldi mutazionali (hot spots),

cioè i nucleotidi a livello dei quali le mutazioni avvengono più frequentemente rispetto alla media.

Nel caso in cui la mutazione non venga riparata, si dice che la mutazione è stata fissata (mutazione

stabilmente presente nel mio patrimonio genetico).

Mutazioni spontanee sono anche:

errori del crossing over durante la meiosi

destabilizzazione indotta dagli elementi trasponibili

Mutazioni indotte:



Si possono indurre mutazioni esponendo gli organismi a mutageni fisici, come le radiazioni, o a mutageni

chimici.

Radiazioni

Tutti gli esseri viventi sono esposti in modo continuo a radiazioni. Le sorgenti di radiazioni alle quali siamo

esposti sono di diversa natura. Tra le sorgenti naturali vanno menzionati i raggi cosmici che provengono

dallo spazio, il radon e i prodotti di decadimento radioattivo dei radioisotopi presenti nelle rocce e nel suolo.

Tra le sorgenti di origine artificiale troviamo i raggi X.

Le radiazioni possono essere:

Ionizzanti

- Non ionizzanti

-

Fatta eccezione per gli UV, le radiazioni non ionizzanti non sono in grado di indurre mutazioni; al contrario,

tutti i tipi di radiazioni ionizzanti, sono mutageni.

Uno degli effetti delle radiazioni UV sul DNA è la formazione di legami chimici covalenti anormali tra

molecole di pirimidina adiacenti, formando quelli che vengono chiamati dimeri di timina (sono due timine

adiacenti), normalmente indicati come T^T. Questo appaiamento inusuale causa una protrusione sul

filamento di DNA e impedisce il normale appaiamento delle T con le corrispettive A sul filamento opposto. A

causa dei ripiegamenti che si formano sul filamento si produrranno delle mutazione frameshift.

Se il numero dei dimeri non riparati è notevole, la cellula morirà.

In questo caso il meccanismo di riparo deve rompere il legame; questa operazione è compiuta da enzimi

chiamati fotoliasi che rompono i legami covalenti timina-timina.

Questo meccanismo è anche chiamato anche “meccanismo di riparazione alla luce” o “fotoreattivazione”

perché è proprio grazie all’esposizione alle lunghezze d’onda tra 320 nm e 370 nm che si ripara il DNA. Il

meccanismo di riparo è interessante perché la luce è la causa del danno ma è anche il meccanismo con cui

si ripara.

Se non ho meccanismo di fotoreattivazione non posso stare esposto alla luce: tutte le volte che l’organismo

si espone alla luce si producono mutazioni frameshift.

Mutageni chimici

I mutageni chimici includono sia sostanze naturali che sintetiche. Questi mutageni possono essere

raggruppati in due classi in base al loro meccanismo d’azione:

Gli analoghi delle basi

- inducono mutazioni durante la replicazione

Agenti intercalanti

-

Gli analoghi delle basi sono basi molto simili a quelle normali del DNA. Come queste ultime, essi esistono in

stati tautomerici normali e rari. In ciascuno di questi stati l’analogo delle basi si appaia con una diversa base

normale del DNA. Dato che gli analoghi delle basi sono simili alle basi azotate normali, possono essere

incorporati nel DNA al loro posto durante la replicazione.

Un mutageno analogo delle basi è il 5-bromouracile (5BU), che ha un residuo di bromo al posto del gruppo

metilico della timina. Nello stato normale il 5BU assomiglia alla timina e si appaia con l’adenina nel DNA. Nel

suo stato raro si appaia con la guanina. Il 5BU induce mutazioni perché può cambiare forma tautomerica

una volta che è stato incorporato nel DNA. Se il 5BU è incorporato nel suo stato normale, si appaia con

l’adenina. Se quindi passa allo stato raro durante la replicazione, si appaia con la guanina. Nel successivo

ciclo di replicazione la coppia 5BU-G darà origine alla coppia C-G invece che T-A. Il 5BU può anche indurre

una mutazione per transizione da C-G a T-A se viene prima incorporato nel DNA nel suo stato raro e poi

passa allo stato normale durante la replicazione.

Gli agenti che modificano le basi sono molecole che agiscono come mutageni modificando direttamente la

struttura chimica e le proprietà delle basi.

L’acido nitroso, HNO2, è un agente deamminante che rimuove i gruppi amminici dalle basi della guanina,

citosina e adenina. Il trattamento della guanina con acido nitroso produce xantina, ma, dato che questa

base purinica ha le stesse proprietà di appaiamento della guanina, non viene indotta mutazione. Quando la

citosina viene trattata con acido nitroso, viene prodotto uracile, che si appaia con l’adenina, producendo

una transizione da C-G ad A-T durante la replicazione.

Gli agenti intercalanti (proflavina, acridina e bromuro d’etidio), si inseriscono tra basi adiacenti di uno o

entrambi i filamenti del DNA, causando un rilassamento dell’elica.

Se l’agente intercalante si inserisce tra due coppie di basi adiacenti di un filamento di DNA che serve sa

stampo, nel nuovo filamento di DNA verrà inserita una base in più in corrispondenza dall’agente- in seguito

ad un ulteriore ciclo di replicazione, dopo che l’agente è stato perso, il risultato sarà un’inserzione di una

coppia di basi.

Se l’agente intercalante si inserisce nel nuovo filamento di DNA si avrà una delezione della coppia di basi. In

ogni caso se l’inserzione o la delezione avvengono in un gene che codifica per una proteina, ne risulterà una

mutazione frameshift.

Nel DNA esistono due tipi di meccanismi di riparazione:

Specifico quando agiscono in modo specifico su una mutazione avvenuta nel DNA.



- Generale si stacca il filamento singolo che porta la mutazione, si parla di escissione.

-

In questo tipo di correzione si taglia prima e dopo la mutazione, si stacca il singolo filamento della

mutazione, e poi si usa l’altro filamento per ricostruire quello che tagliato. Si parla di riparazione per

escissione.

Nicchia: tratto in cui il DNA è a singolo filamento, si chiama così perché è un tratto a singolo filamento che

deve essere riparato.

Molto spesso, in questo tipo di riparazione, la DNA polimerasi non si limita a chiudere solamente la nicchia,

ma continua a corregge il filamento per alcuni nucleotidi successivi; in questo caso si dice che estende la

nicchia per essere certi che il filamento di DNA sia integro e del tutto corretto.

Le DNA polimerasi che fanno riparo hanno un’attività esonucleasica 5’3’, ovvero staccano i nucleotidi in

avanti e inseriscono quelli nuovi.

Quando la polimerasi ha finito il lavoro, ci sono due nucleotidi adiacenti in fondo che non sono ancora

collegati, quindi interviene la ligasi per legarli e si è riformato il filamento danneggiato di DNA.

Nei batteri è presente un vantaggio rispetto agli eucarioti: si riescono a riconoscere i filamenti, ovvero

quello mutato e quello non mutato.

Le mutazioni stanno sempre sul filamento di neo sintesi, quello stampo viene sempre e solo letto.

Nei batteri possiamo riconoscere i due diversi filamenti perché, sul filamento stampo, ci sono dei gruppi

metilici sull’adenina, mentre quello di neo sintesi presenta delle adenine ma non metilate, perché la

metilazione del DNA è post-replicativa.

In questa fase si può intuire qual è il filamento di neo sintesi e quello parentale.

Fase finestra: momento dopo la replicazione in cui la cellula può distinguere i due filamenti, così si possono

correggere le mutazioni. ESEMPI DI PATOLOGIE CAUSATE DA MUTAZIONI

Alcune malattie umane sono state attribuite a difetti nella replicazione o nella riparazione del DNA.

Xeorederma pigmentosum

patologia la cui causa è l’incapacità di riparare i dimeri di timina causate dai raggi UV.

lo XP è causato da una mutazione recessiva in omozigosi a carico di un gene della riparazione. Persone

affette da questa malattia letale sono fotosensibili e le parti della loro epidermide che vengono esposte alla

luce presentano pigmentazione intensa, lentiggini e crescita di escrescenze maligne.

Le cellule dell’epidermide di questi soggetti sono ricche di mutazioni frameshift.

Queste persone non hanno fotoliasi attive, o sono mutate, quindi o non sono funzionali, o non le producono

proprio.

ci sono molte patologie legate ai meccanismi di riparo del DNA che non funzionano correttamente.

IDENTIFICAZIONE DELLE MUTAZIONI

Le mutazioni possono avere molti effetti; quest’ultimo non dipende dal tipo di mutazione, ma dal gene che

ne è colpito.

Le mutazioni sono state studiate nel tempo dai genetisti e sono state classificate in diverse categorie:

Mutazioni visibili

-

Queste mutazioni alterano la morfologia o l’aspetto fisico dell’organismo. Esempi di mutazioni visibili sono il

colore degli occhi e la dimensione delle ali in Drosophila o il colore del pelo negli animali. Poiché le

mutazioni visibili sono facilmente identificabili, la selezione viene fatta semplicemente per osservazione.

Mutazioni condizionali

-

Mutazioni che osserviamo in specifiche condizioni, ovvero colpiscono geni che non sono sempre attivi, ma

che si attivano in particolari condizioni.

Un comune tipo di mutazione condizionale è una mutazione termosensibile. Nel lievito, per esempio,

possono essere isolati molti mutanti sensibili alla temperatura che possono crescere normalmente a 23°C,

ma crescono molto lentamente o non crescono affatto a 36°C. La sensibilità al calore dipende da una

mutazione missenso che causa il cambiamento di un amminoacido nella sequenza di una proteina, cosicché

la proteina assume una conformazione non funzionale alla temperatura più elevata.

Mutazione di resistenza

-

Nei microrganismi, come E.coli, lieviti o in cellule in coltura di tessuti, possono essere indotte mutazioni per

resistenza a particolare virus, sostanze chimiche o antibiotici. Per esempio, per E.coli sono stati realizzati

mutanti resistenti al fago T1 e alcuni resistenti agli antibiotici come la streptomicina.

Mutazioni nutrizionali

-

Ogni organismo potrebbe sintetizzare tutte le molecole che gli servono partendo da carbonio, vitamine e

sali minerali.

Una mutazione nutrizionale altera la capacità di un organismo di sintetizzare una particolare molecola

essenziale per la sua crescita.

L’uomo, ad esempio, deve introdurre gli amminoacidi essenziali con la dieta perché non ha i geni per

sintetizzarli.

Quindi l’uomo è un mutante nutrizionale: ha perso la capacità di produrre gli amminoacidi essenziali.

Auxotrofi, sono tutti quegli organismi che non riescono a sintetizzare tutto quello che serve a loro stessi per

la crescita (noi siamo auxotrofi per gli amminoacidi).

I prototrofi sono organismi in grado di sintetizzare tutto quello che serve a loro stessi partendo da carbonio,

Sali minerali e vitamine.

In funzione delle capacità nutrizionali, si può colonizzare una certa nicchia ecologica. Essere auxotrofi pone

dei limiti alla colonizzazione.

Le mutazioni nutrizionali si possono usare anche come marcatore fenotipico: noi possiamo avere batteri

auxotrofi mutati che diventano prototrofi.

Ci sono batteri auxotrofi che possono ritornare prototrofi facendo una reversione.

TEST DI AMES

Il test di Ames mi serve per verificare la mutagenicità di un composto. -

Ames utilizza un ceppo di Salmonella non patogena, auxotrofa per l’istidina (his ), quindi cresce solo se nel

mezzo di coltura aggiungiamo l’istidina.

Sono importanti da sottolineare due fattori per i quali Ames ha scelto la Salmonella:

Non ha pareti esterne particolarmente isolanti per la cellula, questo è importante perché la

- sostanza mutagena deve entrare nella molecola batterica per indurre mutazioni.

La Salmonella possiede un sistema chiamato SOS che coordina i meccanismi di riparo. La

- salmonella ha un meccanismo di riparo del DNA molto efficiente. Dato che Ames voleva

studiare quante erano le mutazioni indotte doveva ridurre al minimo quelle spontanee.

A questo punto Ames prende le cellule,

aggiunge la sostanza sospetta mutagena e un

estratto di enzimi epatici di ratto (aggiunge

enzimi epatici perché cerca di mimare nella

provetta quello che avverrebbe nel corpo

umano: molte sostanze non sono mutagene

di per sé, ma vengono convertite in

mutageni nel fegato e i altri tessuti).

Semina il composto ottenuto in un terreno

senza istidina e i risultati possono essere

due: la salmonella non crescere

- se la sostanza non provoca

mutazioni.

Se invece vediamo tante

- colonie allora i batteri sono

revertiti, ci sono state tante mutazioni e quindi la sostanza è mutagena.

Questo test è esclusivo per la mutagenicità, non per la cancerogenicità.

Il solvente in cui è stata sciolta la salmonella potrebbe essere anche questo mutageno, quindi prima

bisognerebbe fare il test di Ames anche per il solvente per essere sicuri che non sia quello il mutageno.

Un’altra cosa di cui bisogna essere sicuri prima di effettuare il testi di Ames è che le concentrazioni che si

vanno a studiare possano essere raggiungibili da un essere vivente.

Alcaptonuria

L’effetto delle mutazioni dipende quindi dalla via metabolica che essa colpisce, una molecola, può avere

diverse vie con cui è metabolizzata.

Ad esempio, generalmente, la fenilalanina viene trasformata in tirosina e poi essa viene degradata.

I soggetti alcaptonurici introducono fenilalanina, la trasformano in tirosina, ma l’individuo non riesce a

degradarlo perché c’è una mutazione che impedisce la scissione di alcune molecole.

Si presenta quindi un accumulo di acido omogentisico, intermedio di reazione, che può portare patologie

gravi.

Questa malattia fu una tra le prime malattie genetiche diagnosticate.

La fenilchetonuria invece è la stessa cosa, ma il blocco avviene ancora prima, si accumula l’acido

fenilpiruvico, anche in questo caso abbiamo l’accumulo di un intermedio.

In questi casi abbiamo patologie per cui io non produco qualcosa che mi serve, ma on riesco più a eliminare

qualcosa che ho in eccesso.

In un individuo possiamo avere tante patologie quante sono le tappe della via metabolica presa in esame.

Possiamo avere ad esempio, patologie mitocondriali, cioè patologie legate ai mitocondri che non

funzionano, o patologie lisosomiali, legate al mal funzionamento dei lisosomi.

Esempio di accumulo per patologia lisosomiale:

I gangliosidi erano stati proposti per curare la sindrome di Tay-Sachs. Si pensava che una volta introdotti e

dopo aver svolto il loro compito questi gangliosidi venivano degradati dai lisosomi.

In realtà si è scoperto che non tutti gli organismi riuscivano a smaltirli. Avveniva un accumulo di gangliosidi

che portava ad una patologia peggiore rispetto a quella che dovevano curare.

Una malattia genetica non può essere curata, vorrebbe dire dare al paziente una copia corretta del gene

mutato (terapia genica). La terapia genica è in fase sperimentale.

La cura per una malattia genetica al giorno d’oggi è solo sintomatica, esempio, al diabetico si dà insulina,

diamo ai pazienti solo quello che gli manca.

DUPLICAZIONE DI TRIPLETTE

Le patologie da triplette rappresentano un insieme estremamente eterogeneo di malattie accomunate dal

fatto che i geni implicati contengono ripetizioni instabili di triplette. La presenza di queste triplette in copie

multiple porta i geni che le contengono a produrre una proteina mutata il cui effetto è portare a morte

alcuni tipi cellulari. Un esempio era già stato osservato considerando la Sindrome dell’X fragile in cui la

tripletta CGG viene amplificata numerose volte portando ad un’abolizione della trascrizione.

Lo stesso accade nell’atassia di Friedrich (in cui si ha amplificazione della tripletta GAA). Un altro elemento

comune a tutte queste malattie è l’anticipazione ovvero l’abbassamento dell’età di insorgenza della

patologia all’aumentare del numero di triplette presenti.

Le patologie dovute all’amplificazione di triplette sono numerose ed in particolare sono note parecchie

malattie degenerative del Sistema Nervoso Centrale (SNC) definite come patologie da "poliglutammine"

perché dovute ad una mutazione genetica caratterizzata da espansione della tripletta CAG che codifica

per l’aminoacido glutammina. I geni di questo gruppo di malattie permettono dunque alle cellule del nostro

organismo di produrre specifiche proteine che in ciascun caso contengono un tratto di poliglutammina

eccessivamente lungo e capace di causare pertanto la degenerazione di specifiche popolazioni neuronali. In

tutti questi casi la mutazione genetica che causa la malattia consiste nell’incremento (espansione) del

numero delle triplette CAG e nella loro trasmissione meiotica definita "instabile" perché capace di

modificare la propria lunghezza da una generazione all’altra (perciò "mutazione dinamica").

Rispetto al numero di triplette in più, la proteina può essere:

Funzionale se non si supera un certo valore soglia

- Non funzionale se ce ne sono troppe

-

Corea di Huntington

A questo gruppo di malattie ereditarie appartengono le seguenti patologie: Corea di Huntington (CH),

atrofia muscolare bulbo spinale (SBMA) atassia spino cerebellare tipo 1 (SCA1), tipo 2 (SCA2), tipo 3 o

Machado-Joseph (SCA3/MJD), tipo 6 (SCA6, tipo 7 (SCA7), atrofia dentato-rubro-pallido-luysiana (DRPLA). Si

ritiene che almeno altre 20 sindromi atassiche causate da differenti mutazioni possano non essere ancora

state individuate, alcune sicuramente legate ad un meccanismo mutazionale simile a quelle sopra riportate.

I sintomi prodotti da queste malattie sono complessi poiché in ciascuna patologia coesistono svariate

componenti di tipo neurologico, motorio e cognitivo, ed anche spesso psichiatrico, diversamente combinate

tra di loro. Una caratteristica clinica comune a tutte queste patologie, dall’esordio spesso subdolo, è

costituita da una difficoltà di coordinazione dei movimenti, associata a movimenti involontari degli arti ed

del tronco che assumono, in qualche caso, come nella CH, una progressione ingravescente negli anni. Nella

maggior parte dei casi l’esordio si manifesta in età adulta, dopo la maturità riproduttiva, sebbene talvolta

possa verificarsi in età senile o giovanile se non addirittura infantile. In genere, esiste una correlazione

inversa tra età di esordio e gravità della malattia.

Un notevole aiuto nell'identificazione delle persone affette da patologie da triplette viene oggi dall'analisi

genetica, con cui si può quantificare il numero di triplette presenti nel gene responsabile, permettendo così

di diagnosticare con sicurezza la malattia. MENDELISMO

Le leggi dell’ereditarietà di Mendel sono alla base del lavoro di un genetista. Mendel pubblica i suoi saggi a

metà dell’800, sebbene egli non conosceva la natura dei geni, né sapeva che i geni erano localizzati sui

cromosomi, dei quali ignorava persino l’esistenza.

Le caratteristiche di un individuo sono definite tratti (denominati anche caratteri). Alcuni caratteri sono

ereditabili –trasmissibili di generazione in generazione- mentre altri non lo sono. I caratteri ereditabili sono

determinati dai geni (Mendel li chiamò fattori). La costituzione genetica di un organismo è definita genotipo

(combinazione di alleli) e le caratteristiche visibili di un organismo sono chiamate fenotipo. Un fenotipo può

essere visibile, oppure non immediatamente visibile, ma misurabile. Negli individui diploidi, quindi con due

set di cromosomi, il genotipo sarà diploide.

Mendel chiama carattere il fenotipo e fattore il genotipo.

Il piano sperimentale di Mendel

1. le piante di pisello (Pisum sativum) sono facilmente reperibili,

coltivabili e si riproducono velocemente e più volte nell'anno.

2. Mendel focalizzò la sua attenzione su sette caratteri alternativi e facilmente distinguibili.

3. selezionò linee pure, cioè piante che per autofecondazione

davano sempre piante con lo stesso carattere dei genitori

4. effettuò un'analisi numerica dei risultati ottenuti dei suoi

incroci.

Sapeva che doveva esserci qualcosa che trasmetteva le informazioni all’interno delle cellule.

Nel 1854 cominciò una serie di incroci sperimentali con i piselli per comprendere le base dell’ereditarietà.

Grazie a questi esperimenti Mendel scoprì alcuni principi base della genetica e sviluppò una teoria semplice

per spiegare la trasmissione dei caratteri ereditari da una generazione all’altra.

Nei suoi primi esperimenti di incrocio seguì l’approccio più semplice, vale a dire l’analisi dell’ereditarietà di

un carattere alla volta.

Eseguì incroci rigorosamente controllati tra linee di piselli che manifestavano differenze visibili nei caratteri

ereditari.

I piselli furono una buona scelta poiché soddisfano i criteri che rendono un organismo adatto per essere

usato in esperimenti di genetica: sono facili da coltivare, danno fiori e frutti nello stesso anno di semina e

producono un numero elevato di semi.

Inizialmente Mendel fa un elenco di tutti i caratteri che può osservare, sono più di 20. Ne scegli però solo 7,

stabili, sempre distinguibili e sempre riconoscibili:

colore del fiore e del rivestimento del seme

- colore del seme

- forma del seme

- colore del baccello

- forma del baccello

- lunghezza dello stelo

- posizione del fiore

-

lasciò autofecondare ogni varietà per molte generazioni, per essere sicuro che i caratteri che voleva studiare

fosse ereditari. Questo lavoro preliminare gli diede la sicurezza di lavorare solo con varietà nelle quali il

carattere studiato rimaneva immutato dai genitori ai figli per molte generazioni. Tali varietà erano chiamate

linee pure.

Per ognuno dei sette caratteri quindi aveva solo delle linee pure.

Una linea pura oggi la chiamiamo omoxigote.

Esempio: A liscio

- a rugoso

-

se un individuo è AA e lo faccio incrociare con individui AA, si otterranno solo figli AA.

A e a sono varianti di uno stesso gene, non sono geni diversi, sono alleli diversi. In genetica si usa la stessa

lettera per lo stesso gene. Se ho A e B ho geni diversi.

Gene (fattore mendeliano), Determinante di una caratteristica di un organismo. L’informazione genetica è

codificata nel DNA, responsabile delle differenze tra specie individui. La sequenza nucleotidica di un gene

codifica per un polipeptide o un RNA ed è soggetta a cambiamenti per mutazioni;

Allele, una di due o più forme alternative di un singolo locus genico. Alleli diversi di un gene hanno ciascuno

una sequenza nucleotidica specifica e le loro attività riguardano tutte lo stesso processo biochimico e di

sviluppo, benché’ i loro fenotipi individuali possano differire; un allele può essere:

Selvatico, allele designato come standard (o “normale”) per un ceppo od organismo

- Mutante, ogni alternativa dell’allele selvatico di un gene

-

Locus, posizione di un gene su una mappa genetica; il sito cromosomico specifico in cui il gene e’ localizzato;

Le leggi di Mendel valgono solo per quei caratteri che sono solo ed esclusivamente dati da geni; in più si

applicano a quei caratteri monogenici, cioè dati da uno o pochi geni.

Non tutti i nostri caratteri osservabili sono monogenici:

- multifattoriale: influenzato da più geni e da fattori ambientali

-quantitativo: variazione fenotipica di tipo continuo

-poligenico: determinato da molti geni INCROCI DI MONOIBRIDI

A questo punto Mendel taglia i pistilli e fa l’impollinazione manualmente; applica questo approccio a tutti i

caratteri della pianta.

La generazione parentale è chiamata P o F0, la progenie dell’incrocio P è chiamata prima generazione

filiale o F1. La generazione successiva, prodotta incrociando individui di F1, è chiamata F2 (seconda

generazione filiale) e così via.

Considera prima di tutto un carattere alla volta.

Per esempio incrocia un omozigote per seme liscio (dominante) e uno per seme rugoso (recessivo); il

risultato fu che nella generazione F1 si vede sempre e solo un carattere dei due, chiamato carattere

dominante. Mentre chiama recessivo il carattere che non si vede più.

Quando i genitori venivano scambiati il risultato ottenuto era sempre lo stesso: fu ottenuta una progenie

costituita interamente dal carattere dominante (seme liscio). Gli incroci eseguiti in entrambi i modi

-femmina a semi lisci (AA) x maschio a semi rugosi (aa) e femmina a semi rugosi (aa) x maschio a semi lisci

(AA)- vengono definiti incroci reciproci o reincroci. Se i risultati degli incroci reciproci sono gli stessi, questo

significa che l’ereditarietà del carattere non dipende dal sesso.

AA x aa (incrocio tra linea parentale P)

A A

a Aa Aa

a Aa Aa

In seguito prende le piante della F1 e le fa incrociare tra di loro: ottiene una F2. Facendo una seconda

generazione filiale vide che ricompaiono entrambi i caratteri, quindi comincia a contare quante piante

hanno il carattere 1 e quante hanno il 2.

Compone quindi una tabella e arriva a dei rapporti; dai suoi calcoli osserva che c’è sempre un rapporto 3:1

con cui si manifestano i vari fenotipi.

Aa x Aa (incrocio tra prima generazione filiale F1, incrocio tra due monoibridi)

A a

A AA Aa

a Aa aa

Per Mendel Aa era un monoibrido (incroci tra linee pure che avevano forme alternative di un singolo

allele), quello che oggi noi chiamiamo eterozigote.

Queste tabelle sono chiamate quadrati di Punnett. Se andiamo ad abbinare genotipo con fenotipico, nella

tabella sopra, otteniamo che, essendo AA liscio e aa rugoso, otteniamo 3 individui lisci e 1 rugoso. Questo è

il rapporto 3:1 che Mendel conta nei suoi esperimenti.

Quindi ne deduce che ci sono dei caratteri tipici della F0, dominanti, che nella prima generazione sono

presenti in 4/4 degli individui, mentre nella seconda in ¾ degli individui.

Ma come può un carattere presente nella generazione parentale scomparire e nella F1 e poi ricomparire

nella F2?

Mendel concluse che le forme alternative di uno stesso carattere analizzato nell’incrocio- la forma liscia o

rugosa del seme- erano determinate da fattori particellari. Egli pensò che questi fattori (geni), trasmessi dai

genitori alla progenie attraverso i gameti, portassero l’informazione ereditaria.

Mendel dice che in F1 il carattere recessivo non è sparito, ma semplicemente non si manifesta.

I casi studiati da Mendel in F1 sono sempre di dominanza completa ovvero il seme è o solo rugoso o solo

liscio, mai una via di mezzo. Oppure il seme è o solo giallo o solo verde.

1° LEGGE DI MENDEL

In base ai dati ottenuti da Mendel, egli propose quella che è conosciuta come la sua prima legge, il principio

della segregazione; fa riferimento a come segregano gli alleli in un monoibrido e dice:

“I due membri di una coppia di alleli segregano durante la formazione dei gameti, in modo che metà di

questi porti un membro della coppia e l’altra metà porti l’altro”.

In termini moderni significa che i due membri di una coppia genica (alleli) segregano l’uno dall’altro durante

la formazione dei gameti nella meiosi. Come risultato, metà dei gameti porta un allele e l’altra metà porta

l’altro allele. Ciascun gamete porta un singolo allele di ogni gene.

La progenie è il risultato della combinazione casuale dei gameti prodotti dai due genitori.

Inoltre, la prima legge di Mendel stabilisce che i membri di una coppia di alleli si separano durante la meiosi

e che ogni figlio riceve da ciascun genitore solo un allele. Quindi, la segregazione dei geni va di pari passo

con la separazione delle paia di cromosomi omologhi all’anafase I della meiosi.

Un carattere Mendeliano ha tante caratteristiche:

monogenico

- completamente a base genetica

- segue la prima legge di Mendel con dominanza completa.

-

Le malattie mendeliane, esempio anemia falciforme, sono malattie a singolo gene perché a essere mutati

sono gli alleli di un singolo locus genico. Quello che accade è che un allele mutante sostituisca un allele wild-

type e tale allele mutante risulti responsabile di una malattia genetica. Esistono moltissime malattie che

rientrano in questa categoria ed è stato istituito un registro online, in continuo aggiornamento, che prende

il nome di OMIM. Generalmente, le malattie mendeliane sono malattie che riguardano l’età pediatrica,

perché iniziano a manifestarsi durante i primi anni di vita. Soltanto il 10% si manifesta dopo la pubertà e

solo l’1% dopo la fine del periodo riproduttivo.

INCROCI DI DIIBRIDI

Mendel a questo punto riparte con gli esperimenti considerando però, due caratteri alla volta. Partendo

sempre da una generazione parentale di due linee pure, omozigoti per entrambi i caratteri (AABB o aabb), li

incrocia tra di loro per ottenere la prima generazione filiale.

AABB x aabb (incrocio generazione parentale P)

AB AB

ab AaBb AaBb

ab AaBb AaBb

Nella prima generazione filiale F1 ottenne sempre che solo la forma dominante dei due alleli per i due geni

diversi rimaneva presente nel fenotipo, mentre la forma recessiva scompariva.

La generazione F1 è eterozigote per due coppie di alleli in due loci diversi. Tali individui Mendel li chiama

diibridi. Un diibrido è un eterozigote per due geni.

AB NON è un diibrido, è un gamete o un individuo aploide. Anche AABB non è diibrido, è una linea pura. Per

esse diibrido devi essere eterozigote per entrambi i geni.

A questo punto Mendel incrociò gli individui della F1 per produrre la F2; vi erano due possibili risultati. Uno

era che gli alleli che determinavano la forma e il colore del seme nei genitori venissero trasmessi insieme

alla progenie, risultando quindi con un rapporto 3:1. L’altra possibilità era che gli alleli che determinavano la

forma e il colore del seme venissero ereditati indipendentemente l’uno dall’altro. In tal caso la F1 avrebbe

prodotto quattro tipi di gameti.

Mendel trovò un rapporto fenotipico di 9:3:3:1. Ovvero, 9 piante risultavano dominanti per i due caratteri

(AABB); 3 dominanti per A e recessivi b; 3 dominanti per B e recessivi per a; 1 recessivo per tutti i caratteri

(aabb).

AaBb x AaBb (incrocio generazione F1, incrocio tra due diibridi).

AB Ab aB ab

AB AABB AABb AaBB AaBb

Ab AABb AAbb AaBb Aabb

aB AaBB AaBb aaBB aaBb

ab AaBb Aabb aaBb aabb

Mendel osserva che i caratteri possono assortirsi in tutte le possibili combinazioni.

2° LEGGE DI MENDEL

Da queste osservazioni Mendel ricavò la sua seconda legge, che riguardava quindi l’assortimento

indipendente degli alleli:

“Durante la formazione dei gameti la segregazione di una coppia di alleli di un locus è indipendente dalla

segregazione degli alleli di un altro locus”.

In termini moderni, questo significa che coppie di alleli di geni situati su cromosomi diversi segregano

indipendentemente durante la formazione dei gameti.

Se ho un cromosoma AB e un altro con ab, come si forma Ab?

Con il crossing over. Quest’ultimo può avvenire perché i loci

sono sufficientemente lontani per essere assortiti con il

crossing over.

La seconda legge quindi vale per quei caratteri che si trovano

o su cromosomi diversi, oppure sullo stesso cromosoma, ma

lontani per poter essere separati con crossing over.

Nel 1911 Alfred Sturtevant si rese conto che il fatto che vi fosse una relazione tra la distanza tra geni e la

frequenza con cui ricombinavano poteva essere di enorme aiuto per capire l’ordine con cui i geni sono posti

sui cromosomi. Avendo a disposizione le frequenze di ricombinazione di numerose coppie di geni,

Sturtevant costruì mappe genetiche che indicavano l’ordine e la distanza tra i vari geni sui cromosomi. L’idea

di Sturtevant si rivelò di enorme efficacia tanto che ancora oggi vengono costruite mappe genetiche

basandosi sulle frequenze di ricombinazione. Per valutare la distanza dei vari geni sulla mappa è necessaria

una unità di mappa, che è stata definita centimorgan (cM) in onore di Thomas Hunt Morgan, che equivale

ad una frequenza di ricombinazione dello 0.01.

In realtà esistono due tipologie di unità di mappe, una fisica (più moderna) e il cM:

Se uso un’unità di mappa fisica prenderò in considerazone la sequenza di nucleotidi che mi

- separa i due geni sul cromosoma. Ad esempio gene 1 e 2 distano 1500 nucleotidi.

Per poter usare la mappa fisica devo sapere tutto il mio genoma.

Per molto tempo, dato che non si conosceva il genoma unìmano, si è usato il centiMorgan

- (cM), mi dice quante volte degli alleli in loci diversi segregano assieme.

Esempio: se la distanza tra l’allele A e B è 1cM, vuol dire che nel 99% dei casi questi loci

segregano assieme, mentre nell1% segregano in modo indipendente.

L’idea di base è che più due loci sono vicini più è improbabile che il crossing over avvenga nel mezzo dei

due loci.

Se distassero 0.1 cM, vorrebbe dire che solo una volta su mille segregherebbero in modo indipendente.

Per calcolare il cM vado a fare tanti incroci e vedo ogni quanto gli alleli segregano in modo separato.

Quando due loci sono così vicini che segregano quasi sempre assieme si dice che questi loci sono linkage

,

ovvero segregano in modo non indipendente.

I caratteri Mendeliano non solo sono codificati da geni diversi, ma sono abbastanza lontani o su cromosomi

diversi, da segregare separatamente.

È molto probabile che gli alleli che si trovano in una stessa banda vengano segregati assieme.

SISTEMA RAMIFICATO

L’uso del quadrato di Punnett per rappresentare le combinazioni di tutti i possibili tipi di gameti prodotti da

due genitori in un incrocio è un modo semplice per prevedere la sequenza del fenotipo e del genotipo nella

generazione successiva. Esiste però un metodo alternativo, più semplice, chiamato schema ramificato.

Per utilizzare lo schema ramificato è necessario conoscere la

relazione di dominanza-recessività degli alleli, in modo da poter

determinare le classi fenotipiche della progenie.

Esempio con monoibrido: Aa x Aa

I semi F1 hanno tutti genotipo Aa. Alla meiosi è atteso un egual

numero di gameti A e di gameti a. Quindi, ½ è la frequenza attesa

per ognuno di questi due tipi.

In base alle leggi delle probabilità, possiamo prevedere le

frequenze attese dei tre possibili genotipi alla generazione F2

usando lo schema ramificato. Da ogni genitore, la frequenza di un gamete A è ½ e la frequenza di un gamete

a è sempre 1/2 . Il gamete A di questo genitore si unisce con il gamete A dell’altro genitore. La frequenza del

gamete A di quest’altro genitore è 1/2, come anche la sua frequenza per il gamete a.

Per produrre una pianta con AA in F2, deve avvenire l’unione del gamete A di un genitore con un gamete A

dell’altro genitore. La frequenza attesa per questo evento è quindi ½ x 1/2 = 1/4 . per la progenie Aa vale lo

stesso ragionamento: la frequenza di A in un genitore è sempre ½ e la frequenza del gamete a dell’altro

genitore è ancora 1/2 . D’altra parte la progenie Aa può essere ottenuta in due modi: unendo una femmina

A con un maschio a oppure unendo una femmina a con un maschio A. utilizzando la regola del prodotto, la

probabilità del verificarsi di ciascuno di questi eventi è 1/4 . Usando la regola della somma invece la

probabilità del verificarsi di uno o dell’altro evento è ¼ + 1/4 = 1/2.

La previsione è che quindi un quarto della progenie F2 sia AA, metà Aa e un quarto aa.

Per convenzione i ¾ in cui il fenotipo si dimostrerà dominante, quindi l’A, si indica con A-. Mentre l’ ¼ che

dimostrerà il fenotipo recessivo è chiamato semplicemente aa.

Esempio con diibrido: AaBb x AaBb

Come per l’incroci tra monoibridi, uno schema ramificato può essere usato anche per l’incrocio tra diibridi

per calcolare i rapporti fenotipici o genotipici attesi.

Con questo approccio noi applichiamo le leggi della probabilità alle coppie di alleli una alla volta. Usando lo

stesso esempio, nel quale le due coppie di alleli si distribuiscono indipendentemente nei gameti,

consideriamo una coppia di alleli per volta.

Il sistema ramificato è veloce perché non devo fare le

combinazione, ma si basa solo sul fenotipo. Con questo

meccanismo posso prevedere che fenotipo otterrò ad

esempio incrociando due cani di razze diverse.

Mendel eseguì inoltre esperimenti di test cross ovvero un

incrocio di controllo che permetteva di capire se un

individuo fosse omozigote o eterozigote per un dato

carattere. In questo caso l’individuo di cui si voleva

determinare il genotipo veniva incrociato con un individuo

omozigote recessivo facilmente identificabile sulla base del

fenotipo dato che il fenotipo recessivo è presente

solamente negli individui omozigoti recessivi. Per capire il

genotipo incognito possiamo quindi fare alcune previsioni

avvalendoci del quadrato di Punnett e verificare quale

modello coincida con i risultati ottenuti.

ECCEZIONI ALLE LEGGI DI MENDEL

Mendel utilizzò caratteri semplici e molto definiti nelle loro manifestazioni. Ben presto allargando lo studio

ad altri caratteri e aumentando le osservazioni su altri organismi comparvero fenomeni che sembravano

contraddire la linearità dell’ipotesi mendeliana.

In realtà le leggi di Mendel non venivano contraddette: si cominciano a intravedere le complesse relazioni

che esistono fra un singolo locus e gli altri, che costituiscono il background genetico degli individui.

Il fenotipo è il risultato finale di una serie di interazioni fra geni e di questi ultimi con l’ambiente. L’analisi

genetica deve sempre considerare l’individuo come un insieme di fattori e come facente parte di un insieme

costituito dalla popolazione a cui l’individuo appartiene.

Spesso la relazione diretta, ovvero che la presenza di un certo allele si manifesti con un determinato

fenotipo può non venire rispettata. L’analisi molecolare dei geni e la conoscenza del loro funzionamento

hanno chiarito che quelle che sembravano eccezioni, eccezioni non sono.

Modificazioni delle relazioni di dominanza

La dominanza completa è il fenomeno per cui un allele è dominate sull’altro, e quindi il fenotipo

dell’eterozigote è indistinguibile da quello dell’omozigote dominante. con la recessività completa, l’allele

recessivo si esprime fenotipicamente solo in omozigosi. La dominanza completa e la recessività completa

sono i due estremi della gamma delle relazioni di dominanza per due alleli. Mentre tutte le coppie alleliche

studiate da Mendel mostravano relazioni di dominanza completa o recessività completa, molte coppie

alleliche non manifestano questa relazione.

Possiamo quindi distinguere tre tipi di dominanza:

Dominanza completa quella studiata da Mendel

- Dominanza incompleta quando un allele di un gene non è completamente dominante su



- un altro allele dello stesso gene, si dice che dimostra una dominanza incompleta (semi

dominanza o dominanza parziale).

Esempio; Ho due fenotipi (rosso e bianco), l’ibrido ha un fenotipo intermedio tra i fenotipi parentali. L’ibrido

è rosa. Questo vuol dire che entrambi i fenotipi si sono manifestati e ottengo l’intermedio.

Coodominanza nella codominanza l’eterozigote manifesta i fenotipi di entrambi gli

- omozigoti (a differenza della dominanza incompleta, in cui l’eterozigote manifesta un

fenotipo intermedio tra i due omozigoti).

Esempio: vedo entrambi i fenotipi, cioè sia bianco che rosso, ma mescolati sullo stesso fiore. Vedo il fiore a

macchie.

Anche i gruppi sanguigni sono un esempio di codominanza.

I gruppi sanguigni AB0