Lezione sul genome editing

Non bisogna preoccuparsi della durata di persistenza del virus, di trovare

 un promotore forte costitutivo magari di origine virale. Se correggo un

esone mutato, invece, la correzione rimarrà per tutta la vita, e il gene

viene trascritto normalmente da un promotore cellulare che si attiva in

determinati momenti;

La terapia genica ha un limite: è possibile veicolare un elemento, ma è

 difficile sfruttarla per spegnere un gene. Se una persona ha l’allele di un

gene che codifica per un oncosoppressore mutato, questa persona è più

predisposta a sviluppare un tumore. La terapia genica non può

selezionare un allele e disattivarlo. Ci si può provare, ma con enormi

limiti. L’editing genetico è in grado di operare in tal senso.

L’editing genetico si può fare attraverso la produzione di una cicatrice nel DNA,

risultata da una ricombinazione non-omologa. Si producono due lembi di DNA

tagliati, che, per ricongiungersi, inseriscono un determinato numero di

nucleotidi per riunire il filamento. In questo modo si ottiene l’annullamento

dell’espressione del gene. Si usano forbici molecolari (CRISPR-Cas9, TALEN,

Zinc finger) che tagliano la doppia elica di DNA in siti prestabiliti e voluti,

provocando una cicatrice che, una volta ricucita, determina lo slittamento

dell’ORF, la comparsa di un codone di stop, una perdita di 20-30 aa per la

delezione di basi avvenuta. Viene mandata a monte la trascrizione di uno o di

entrambi gli alleli.

Si può anche procedere con la ricombinazione omologa (più complessa), che

normalmente avviene in tutte le cellule, ai fini della riparazione del DNA. Se è

presente un frammento di DNA omologo ad un altro e uno dei due è

danneggiato, la cellula sostituisce il frammento rotto con quello integro e lo usa

come templato. E’ la strategia che viene adottata per la cura delle malattie

genetiche monogeniche. Se un paziente presenta una sequenza ATT invece che

ATG, si opera in modo che venga introdotto un frammento che porta la catena

w-t, si deve praticare un taglio (grazie a una nucleasi) accanto alla mutazione

che dà la malattia e la cellula stessa, senza aiuti, incamera il frammento

esogeno (anche da dentro un vettore) e lo integrerà al posto dell’allele mutato.

Si può fare editing genetico con la ricombinazione omologa di vettori AA (sono

vettori a doppia elica di DNA, stanno nel nucleo, con omologia di sequenza

nella loro capienza di 5 kb). Si possono anche usare nucleasi che provocano un

taglio a livello del DNA (al doppio filamento), al quale la cellula, percepitolo,

risponde attivando un meccanismo proteico (BRCA1, BRCA2, ATM, Rad49,

Rad50) di riparazione del genoma. Il danno viene così prontamente riparato.

Il genome editing è una tecnica che consente di introdurre, eliminare o alterare

sequenze di DNA all’interno del genoma in una posizione specifica. E’

importante la specificità. La tecnica dell’editing genetico che non si avvale

degli AAV, usa nucleasi ingegnerizzate, che scorrono lungo i cromosomi alla

ricerca del sito di taglio di interesse (al quale la nucleasi si appaia), come fa

Cas9, un’endonucleasi. Questa proteina possiede attività elicasica e, ogni volta

che trova una sequenza PAM (NGG, dove N sta per qualunque nucleotide),

prova ad attaccare un braccio di nucleotidi. Se questo non si attacca dopo la

sequenza PAM, la Cas) prosegue nella lettura; se il braccio è riconosciuto, la

nucleasi si stabilizza e produce un doppio taglio a DNA a valle della sequenza

PAM. La cellula percepisce il taglio e risponde in due modi: NHEJ

(ricombinazione non omologa) o HR (ricombinazione omologa). Nel primo caso,

si ha una cucitura rapida dei due monconi ma suscettibile di errori (nella fretta

di chiudere il gap nucleico, può inserire nucleotidi sbagliati), quindi avviene il

knockout del gene, che viene inattivato. Nel secondo caso, il processo è più

ordinato (avviene tramite ricombinazione tra il frammento esterno e quello

parentale) e si può ottenere il ripristino del gene, oppure l’inserzione di un

transgene all’interno di una cassetta di espressione. Si sta progettando una

Cas9 responsiva a un raggio di luce laser. Il taglio viene effettuato solo in

seguito a questo tipo di stimolo.

La tecnologia CRISPR/Cas9 permette di ricombinare il DNA correggendo la

mutazione genica, senza trasportare un nuovo gene: la correzione di grandi

geni (come quello della discinesia ciliare primaria, che ha un mRNA più lungo di

250 kb, ben oltre la capienza di un vettore erpetico) è quindi possibile. Avendo

corretto un gene esistente, la cellula non può “silenziare” la sua espressione e

la correzione perdurerà nel tempo. La correzione verrà trasmessa a tutta la

progenie.

Il genome editing si può praticare inserendo all’interno di un AAV due braccia di

omologia, identiche a un locus presente nel genoma del paziente. Nell’AAV tra

le braccia di omologia c’è un elemento diverso, mancante nel genoma. Anche

senza tagliare, seppure con frequenza minore, la cellula può riconoscere

l’omologia tra sequenze e, ricombinando in maniera omologa, incorporare il

transgene nel locus specifico che ha omologia con le estremità del vettore. Si

può anche progettare il vettore AAV con due braccia di omologia (per la HR)

insieme a una nucleasi (come Cas9). Se i due vettori si trovano all’interno della

stessa cellula, si ha un vettore recante la sequenza di omologia, l’altro reca la

Cas9. Si taglia il sito, l’altro vettore porta un frammento di DNA omologo e si

attiva la HR.

La ricombinazione non è un evento così raro.

In una struttura di sterilizzazione di plastica per laboratorio con radiazioni

ionizzanti, è stato scoperto che, nonostante le ripetute radiazioni a cui questi

substrati erano stati sottoposti, cresceva un batterio (Deinococcus radiodurans)

sulla plastica, che possedeva 6/8 coppie di genoma, grazie a un processo di

ricombinazione omologa continua tra i cromosomi batterici, che avveniva

durante gli irraggiamenti, e che funziona molto efficacemente. Deinococcus

sopravvive a una dose 1000 volte maggiore di quella sufficiente ad uccidere un

uomo.

Le piattaforme nucleasiche per ottenere rotture a doppio filamento specifiche

nel DNA e avere HR sono:

Homing endonucleasi (HE);

 Zinc finger nucleasi (ZFN);

 Tal Effector Nucleasi (TALEN);

 Endonucleasi guidate dall’RNA (RGE, CRISPR/Cas9).



Lo sviluppo delle nucleasi sulle cellule umane partì nel ’94 con le HE, mentre

dal ’96 al ’03 si usarono le Zinc-finger nuclease. Queste non riuscivano a

bersagliare qualunque sito del DNA, ma si basavano sulle interazioni tra

proteina e acido nucleico. Si era limitati dal numero di “dita di zinco” nel

processo di assemblaggio del sistema. Solo alcuni siti erano accessibili a

queste proteine. Non si potevano nemmeno produrre in laboratorio, per avere

un saggio di genome editing, ma bisognava richiederle all’azienda (Sangamo)

che aveva depositato il brevetto. Nel 2011 venne brevettata una tecnica,

sempre basata sull’interazione proteina-DNA, che riconosce i nucleotidi, la

TALEN. Permetteva in un mese di assemblare plasmidi con diversi elementi che

fornivano una struttura proteica che riconosceva determinate sequenze

nucleotidiche (triplette) del genoma da curare. Sulla base dei nucleotidi da

riconoscere si assemblavano i componenti in un determinato ordine. Un altro

mese di tempo era necessario per clonare questi plasmidi. Per le TALEN

bisognava clonare 20 miniframmenti, tutti in frame, in un unico plasmide. Non

era un procedimento affatto semplice. Anche le TALEN, con l’avvento di CRISPR

nel 2012, sono state abbandonate. Le CRISPR, in un paio di giorni, permettono

l’assemblaggio del sistema e, con un altro paio di giorni, la trasduzione di

cellule. Si tratta di un procedimento anche relativamente economico, oltre che

molto intuitivo e facile da seguire.

A prescindere dalla tecnica utilizzata, tutte le strategie nucleasiche sono in

grado di tagliare il DNA in un sito specifico. La prima modificazione che l’editing

genico può fare è la ricombinazione non omologa, cioè la delezione o

l’inserzione di nucleotidi all’interno del gene. Il gene bersagliato viene alterato:

si induce lo slittamento del frame di lettura. Solitamente viene colpito il primo o

il secondo esone, che provochi la comparsa un codone di stop dopo pochi aa

codificati della proteina. Statisticamente è dimostrato che, alterando la lettura

in triplette del genoma, a un certo punto si avrà un codone di stop. La proteina

può non essere tradotta o, comunque, essere tronca e, dunque, non funzionale.

E’ possibile bersagliare due siti nel genoma: si fanno due tagli. L’elemento

posto tra i due tagli viene rimosso: i frammenti a monte e a valle si

ricongiungeranno. Questa tecnica permette la rimozione di frammenti esogeni

di DNA nel genoma (come quello di HIV nel nostro organismo). HIV ha il grosso

vantaggio di avere LTR, identiche all’estremità. Con un solo sistema di editing,

progettato per una sola LTR, il taglio avviene obbligatoriamente nella LTR in 5’

e nella LTR in 3’, escludendo il genoma virale nel mezzo. HIV non persiste nella

cellula.

Si può attivare anche la traslocazione cromosomica. Si effettua un taglio a

livello del cromosoma A, si fa un taglio al cromosoma B. Si ha l’unione di un

pezzo di cromosoma B con un frammento di cromosoma A, all’interno dell’uno

o dell’altro cromosoma.

Si possono cancellare sequenze ripetute. Alcune malattie genetiche sono

legate a mutazioni negli introni. Si può quindi rimuovere un introne, quando lo

splicing è erroneo. Si possono rimuovere ripetizioni per ridurre la possibilità di

errore nella trascrizione. Si taglia in mezzo a due sequenze ripetute. La cellula,

sentendo il taglio, riparerà il sito, non lasciando semplicemente che si

dispongano uno di fila all’altro, ma, grazie alla ricombinazione omologa fra i

frammenti adiacenti, portando alla rimozione di una delle sequenze ripetute, in

seguito alla sovrapposizione dei due frammenti.

La ricombinazione omologa

Immaginiamo di tagliare un frammento di DNA: si avrà un’estremità 3’-5’ e una

5’-3’. Ci sono proteine sensibili al taglio, che effettuano un taglietto alle due

estremità, che si arricchiscono di complessi proteici (Atm, Rad50, Rad51,

Rad52), che guidano il moncone a ricombinare con il frammento di DNA

esogeno. Si ha un’ibrido tra il frammento parentale e il frammento esogeno. Si

complementarizzano i filamenti: il frammento parentale (entrambi i filamenti,

in realtà) si arricchisce, ricombinan