Appunti 4 lezione Genetica e microbiologia c.i.

BEADLE E TATUM

Scoprirono che la neurospora è uno dei pochissimi organismi eucarioti che sono in grado di

sintetizzarsi tutto ciò che gli serve nel loro ciclo vegetativo a partire da un terreno minimo (sale

inorganici, fonte di carbonio, fonte di azoto), l'unico fattore che non sono in grado di auto

sintetizzarsi è la biotina; aggiungendo dei sali, dello zucchero e dell'ammoniaca e la biotina, sono

in grado di riprodurre in vitro la neurospora.

AA ESSENZIALI: aa che devono essere integrati mediante la dieta in quanto non siamo in grado di

produrceli.

AA NON ESSENZIALI: sono aa che siamo in grado di produrre grazie ali enzimi che possediamo

partendo da metaboliti più semplici e che non necessitano una introduzione obbligatoria da parte

della dieta.

Beadle e Tatum scoprirono che sebbene le neurospore potevano vivere in un terreno minimo,

ovviamente erano in grado di crescere in un terreno minimo con dei supplementi;

inoltre videro che se mutagenizzavano questa neurospora, la quale cresceva in un terreno

completo, ogni tanto qualche individuo della generazione filiale, non era in grado di crescere in un

terreno minimo. sì suppose dunque che avevano mutato un gene che era responsabile per la

biosintesi di qualcuno degli amminoacidi o nucleotidi o una delle vitamine che loro naturalmente

sintetizzavano.

Coniarono i termini di

PROTROTOFO: Organismo in grado di sintetizzare tutto ciò che gli serve per la proprio

sopravvivenza.

AUXOTROFI: mutanti nutrizionali, ovvero organismi che hanno mutazioni in geni che li rendono

incapaci di crescere in un terreno minimo perché in qualche modo è stata compromessa la loro

capacita di produrre enzimi che gli servono per crescere in un terreno minimo.

Esperimento:

La neurospora viene coltivata in delle provette, dove vi è il terreno minimo, quando crescono

formano un micelio, iniziano il loro ciclo vegetativo e producono una muffa; questo micelio cresce,

produce la muffa e la provetta è coperta con del cotone idrofilo.

Vengono poi prese le spore di questa neurospora e vengono irradiate con dei raggi X (radiazioni

ionizzanti ad alta frequenza che sono in grado di provocare dei danni al DNA).

Le spore irradiate e immunogenizzate vennero coltivate singolarmente in dei terreni completi,

nelle quali crebbero tutte.

Successivamente vennero preparate altre provette con un terreno minimo e le spore furono

spostate, sempre singolarmente, nella nuova provetta.

Ciò che si osserva è che nella maggior parte delle provette con terreno minimo vi è crescita di

neurospora, ipotizzarono dunque che la mutagenesi non aveva compromesso le funzioni vitali

della neurospora e non aveva compromesso o danneggiato nessuno dei geni che erano

responsabili della protroficità della neurospora.

In alcune di queste provette però, la neurospora non cresceva.

A questo punto si annotarono il numero di provetta nella quale non vi era crescita di neurospora e

per comprendere quale fosse la natura biochimica del auxotrofia del mutante, ripresero

nuovamente le spore della provetta originale dalla quale proveniva il mutante e la inocularono in:

un terreno minimo di controllo ( per verificare che effettivamente non crescesse), in un terreno

completo (per verificare la sua crescita) e poi in tanti terreno minimi con supplementi sempre

differenti ( es. uno minimo con vitamine, uno minimo con aa, uno minimo con nucleotidi ecc.. ) e

osservarono dove la neurospora presentava crescita.

Verificarono che la neurospora mutagenizzata cresceva soltanto nel terreno minimo supplemento

con amminoacidi.

Beadle e Tatum dedussero dunque che la neurospora isolata fosse un mutante per un gene

responsabile della la biosintesi di uno dei 20 aa che servono per costruire le proteine.

A questo punto vogliono capire se l'auxotrofia dei mutanti sia generale, ovvero incapacità di

sintetizzare qualsiasi aa, oppure riguardante solo uno dei 20 aa

Iniziano dunque a testare il mutante per la capacità o incapacità di crescere in un terreno minimo

supplemento con ogni volta uno dei venti aa.

Per cui prendono il mutante e lo inoculano in una fila con terreno minimo+ glicina ecc..

ciò che osservano è che si manifesta crescita SOLO nella fiala contenente l'aa TRIPTOFANO.

deducono dunque che la mutazione è presente in un gene responsabile per la sintesi di enzimi

coinvolti nella biosintesi del triptofano.

Beadle e Tatum riescono a sintetizzare mutanti auxotrofici per tutti e 20 gli aa, per moltissime

vitamine e nucleotidi.

Per ogni aa riescono a isola più di un mutante auxotrofico; esempio nel caso della metionina.

MET5, MET3, MET2, MET8 (hanno degli omologi chiamati Gruppi di Complementazione poiché è

possibile trovare più mutazioni di un gene.) e il numero indica il giorno di isolamento.

Beadle e Tatum erano dei biochimici e sapevano che la metionina veniva prodotta a partirà

dell'omoserina, intervenivano 4 enzimi per produrre la metionina; si ipotizzo che i 4 mutanti per

metionina isolati non sono mutanti per lo stesso gene responsabile per un enzima, ma ogni

mutante isolato portava un gene responsabile era per uno dei 4 enzimi che erano responsabili per

far andare avanti il processo per la sintesi della metionina.

Per verificare questa loro ipotesi eseguono una prova:

prendono acetil omoserina e la supplementano con un terreno minimo e testano quale di questi

mutanti è in grado di crescere con un terreno minimo supplemetato dalla omoserina; risulta che

l'unico mutante in grado di crescere sia MET5. Deducono che dato che l'acetil omoserina permette

di far crescere questi mutanti, analogamente a come la metionina permette di far crescere questi

mutanti, questi mutanti MET5 siano dei mutanti nel gene che è in grado di codificare per l'enzima

omoserina transacetilasi che è in grado di trasformale omoserina in O acetil omoserina. A questo

punto addizionano il terreno minimo di cistationina e verificano che il mutante MET5 cresce in

presenza di cistationina, in quanto si trova a valle della reazioni e adesso non ho più bisogno del

substrato.

MET3 è l'unico mutante che è in grado di crescere solo in presenta della cisteina.

Attraverso questi enzimi formulano la relazione un GENE-ENZIMA.

Oggi sappiamo che non tutte le proteine sono enzimi, ma un polipeptide può avere funzioni

differenti.

Dagli studi di Beadle e Tatum si scoprirono molte malattie derivanti da deficienze enzimatiche a

causa di mutanti in geni con corrispondente numero OMI.

OMI è un acronimo che sta per online mendelian inheritance in Man.

All'interno di u gene che codifica per una proteina, l'informazione come è scritta e conservata?

Scoperta della co-linearità esistente tra gene e proteina eseguita da Yanosky con contributo di

Sanger che nel frattempo aveva trovato un modo per scoprire quale fosse la sequenza aa di una

proteina.

IL METODO SANGER: permette di identificare la sequenza di una proteina.

consiste nel isolare una serie di enzimi proteolitici che sono in grado di tagliare solo in

corrispondenza di alcuni aa. per esempio isolo un enzima che è in grado ti tagliare dove ci sono

alanine, e uno che taglia dove vi siano solo i triptofani ecc.

immaginiamo dunque di avere tanti enzimi tanti quanti sono gli aa e di avere una proteina e di

digerirla con questa attività enzimatica singolarmente ( prima con l'enzima A poi con l'enzima B

ecc..) così da avere vari frammenti in modo tale da successivamente essere in grado di andare a

ricostruire la sequenza amminoacidica.

Successivamente a 70 anni riesce a trovare un metodo in grado di sequenziare il DNA.

Grazie a questo metodo fu possibile per yanosky appurare l'esistenza della relazione colineare tra

geni-proteine.

Yanosky nel 1966 sequenzia tutta la proteina che era codificata per il gene TRIPa che è

responsabile della sintesi di un enzima il quale è implicato nella biosintesi del triptofano. Ciò che

yanosky scopre è che se mutagenizza questo gene e va a sequenziare questa nuova proteina TRP,

vede che là dove cera un acido glutammico, adesso cera una valina.

esegue un altro ciclo di mutagenesi e isola un altro mutante TRp che non è in grado di funzionare

perché non riesce più a crescere nel terreno minimo (ha bisogno di triptofano). isola la proteina e

scopre che l'acido glutammico è al suo posto, ma vi è una tirosina sostituita con una cisteina; isola

più mutanti in totale 4 mutanti.

A questo punto, sequenzia il DNA del gene trpA nella sua versione wild type e in tutte le sue 4

versioni mutanti. ciò che scopre è che esistono dei nucleotidi che si trovavano all'inizio di questo

gene per esempio dove vi era un CCT che associava all'acido glutammico, m che adesso diventa

una CTT e all'inizio del gene l'acido glutammico cambia con la valina.

e scopre che appunto esiste una corrispondenza biunivoca tra le posizioni mutate nelle proteine e

posizioni mutate nei nucleotidi; scopre quindi che l'informazione del gene è LINEARE e CONTINUA.

oggi sappiamo che la colinearità esiste perché vi è un codice genetico che legge triplette in modo

continuo. Lì dove l'info è alterata corrisponderà in un’alterata posizione di un amminoacido nella

proteina risultante.

Non era chiaro come, all'interno dell'acido nucleico, il gene mantenesse l'info che servivano per

produrre una proteina. quello che si scopri è che segue una logica lineare, ovvero dove ce una

sequenza all'inizio dei nucleotidi, questa corrisponde all'inizio di una proteina e così via.

Beadle e Tatum e yanofsky lavoravano rispettivamente con Neurospora e E. Coli. la prima

sindrome metabolica in cui si riscontro una corrispondenza biunivoca tra gene- difetto enzimatico,

fu la sindrome di Tay-Sachs.

Malattia molto rara, autosomica recessiva, il gene responsabile è HEXA che codifica per l'enzima

N-Acetilesosanimidasi A, il quale si trova nei lisosomi. La condizione della malattia può migliorare

grazie all'introduzione dell'enzima tramite dieta.

Esistono tantissime di malattie genetiche nelle quali un difetto di un gene porta al

malfunzionamento di un enzima. Esempio malattie dovute ai GENI CHE CODIFICANO PER

L'EMOGLOBINA: I globuli rossi sono cellule anucleate, specializzate per produrre emoglobina,

proteina quaternaria con legati gruppi eme, che è implicata nel trasporto di O2 e CO2. Esito delle

varianti delle emoglobine per esempio le Beta s che in un analisi elettroforetica ( tecnica che

permette di analizzare la dimensione delle proteine e le loro proprietà biochimiche) ciò che si vede

è che un emoglobina normale nel caso di elettroforesi migra ad una certa altezza, quando invece

abbiamo una emoglobina con catene beta anormali, questa migra in una posizione differente