Epigenetica

METILAZIONE

L’aggiunta di CH3 pu avvenire sul gruppo amminico sia di lisina che arginina (le più studiate sono

comunque sulla lisina) e pu avvenire su tre livelli: l’amminoacido pu essere monometilato,

dimetilato o trimetilato e i diversi livelli portano con loro diversi significati. In questo caso non c’è

una repressione della carica positiva, non c’è un effetto elettrostatico. La funzionalità è data dai

readers che producono la risposta.

Un aspetto molto importante della trimetilazione è la sua capacità di comunicare con altre in un

cross-talk istonico, determinando un messaggio complessivo sulla cromatina.

Lisina (K) 4-9-27

Quando la lisina 4 dell’istone H3 è trimetilata in prossimità di un TSS di un gene, allora questo è

trascrizionalmente attivo. Il TSS sta nel DNA internucleosomiale. La K4 trimetilata sta nel

nucleosoma a monte e in quello a valle. I complessi di rimodellamento la leggono e svolgono il DNA

in quel punto.

Non sta solo in quei punti lì. Sta anche nell’eterocromatina con un significato funzionale noto (?)

questo per ribadire che non esistono assoluti, non è vero che in TUTTI i casi un gene con la K4

trimetilata è trascrizionalmente attivo. Nella maggior parte dei casi è così, ma non sempre.

Se la trimetilazione avviene sulla lisina 27 il significato è totalmente opposto e il gene è quasi

certamente spento.

Le due modifiche sono mutualmente esclusive: la chiave sta negli enzimi, in particolare qui sono

coinvolti EZH1 e EZH2, che spesso si ritrovano in complessi di natura repressoria denominati poly-

comb: essi riconoscono messaggi nella struttura e decretano il compattamento della cromatina. In

particolare questi Poly-Comb repressori si trovano in alcune zone di eucromatina in Drosophila (in

cui determinano lo sviluppo dorso-ventrale senza quale essa non si forma), oltre che in

eterocromatina e nel cromosoma X, e sono sempre associati alla trimetilazione della K27.

Un’eccezione avviene in una porzione di circa un centinaio di promotori bivalenti, che

corrispondono a geni “ready for transcription”: essi sono di base disattivati ma potrebbero tornare

utili alla cellula, per cui presentano entrambe le modificazioni in modo da poter essere velocemente

attivati perdendo H3K27met3. 18

Per vedere quali geni sono espressi: RNA sequencing.

K9 trimetilata —> si trova nell’eterocromatina estremamente compattata e dove la trascrizione è

inattiva. La k9 trimetilata è un Docking site per proteine che portano la metilazione. K9 metilata e

DNA metilato vanno di pari passo. Cluster di K9 trimetilata sono i centromeri. Sono regioni che

donano stabilità al genoma se sono correttamente strutturate.

È un marker di repressione traduzionale, una modificazione stabile che dura nel tempo. Di solito se

un gene presenta questa modificazione istonica, raramente tornerà ad essere espresso.

Nelle cellule trattate con la molecola in cui c’è una forte metilazione della K4 si pu osservare che i

livelli di K9 sono molto bassi, e viceversa dove K9 è più abbondante K4 deve necessariamente

diminuire. Questa comunicazione tra le due modificazioni è dovuta al fatto che i complessi che

metilano la lisina 4 allo stesso tempo bloccano altri complessi che andrebbero a metilare la lisina 9,

stimolando uno spegnimento del gene che è in contrasto con la loro attività.

Per quanto riguarda la mono e dimetilazione generalmente si tratta di step che progressivamente

portano alla trimetilazione, per cui possiamo osservare come “un’onda” in cui la monometilazione

è più estesa lungo il gene, la dimetilazione meno e infine la trimetilazione si concentra sul TSS.

Questo livello così alto di metilazione è necessario per il reclutamento della RNA polimerasi e quindi

l’attivazione della trascrizione; poi la RNA polimerasi stessa richiama alcuni enzimi in grado di

svolgere la trimetilazione, quindi di aggiungere l’ultimo livello a lisine istoniche già dimetilate. Con

la loro azione pu partire la trascrizione e l’espressione genica, ed hanno anche un ruolo nel metilare

lisine a valle del TSS per permettere il procedere della trascrizione stessa, come sulla K36 ad

esempio.

Alcune volte succede che i trasposoni (retrotraspose element), che risultano silenti, sono

eterocromatinizzati (?penso eu?) e quando vengono riaccesi la cellula percepisce gli mRNA prodotti

come estranei e quindi produce una risposta immunitaria virale, come se fosse infettata da un virus

(molti trasposoni sono di origine virale).

I marker di modificazione sono estremamente conservati durante l’evoluzione degli organismi che

hanno il DNA organizzato con istoni. In particolare questo vale per le lisina che in organismi molto

diversi si trovano nelle stesse posizioni e le loro modificazioni presentano lo stesso significato.

Le modificazioni si leggono e regolano a vicenda, creando un messaggio complessivo, non solo

tra loro ma anche con altri tipi di variazioni epigenetiche, come per esempio la metilazione del DNA.

Una modifica viene letta da una molecola, che a sua volte recluta nuove proteine che svolgono altre

modificazioni, l’effetto risulta dalla sommatoria delle singole attività.

Esistono tre tipi di attività enzimatiche coinvolte nella regolazione e definizione del codice istonico:

★ Writers

Eseguono le modificazioni, come potrebbe essere l’istone acetil-transferasi; si tratta in realtà di

famiglie di enzimi, con alcune differenze tra loro a livello di vari domini, che prendono il nome

generale di HAT’s.

L’altra modificazione molto studiata è la metilazione, per cui sono rilevanti anche le istone metil-

transferasi o HKMT’s.

★ Erasers

Cancellano le modificazioni, come la famiglia delle istone deacetilasi HDAC’s e quella delle

istone demetilasi KDM’s. 19

★ Readers

Leggono le modificazioni (tra cui anche la loro assenza) e le traducono in pratico, come il

richiamo di altre proteine o dell’apparato trascrizionale aumentando l’espressione genica.

Di per sé un’acetilazione o una metilazione sono poco rilevanti, non causano grosse alterazioni

funzionali e nemmeno un particolare ingombro sterico; certo per l’acetilazione abbiamo la

differenza di carica, ma essa non agisce ovviamente da sola.

Le modificazioni istoniche sono delle indicazioni e dei siti di riconoscimento che i readers sono

in grado di distinguerle: il risultato finale è dato sì dal codice, ma anche da chi lo interpreta.

Per esempio a questa classe appartengono i complessi di rimodellamento della cromatina ATP-

dipendenti, che aumentano ed esaltano l’effetto della singola piccola modificazione con una risposta

più intensa di spostamento dei nucleosomi.

Nel caso dell’acetilazione le informazioni sono lette, interpretate e quindi esaltate da reader che

possiedono un bromodominio, una struttura proteica molto conservata che è formata da 4 eliche

unite tra loro con elementi a forcina; essi sono soprattutto presenti in alcuni fattori di trascrizione,

come Brd2 che è in grado di iniziare la trascrizione legandosi alla lisina 12 acetilata dell’istone H4.

Poi abbiamo altri elementi che legano la lisina 14 dell’istone 3, e a loro volta portano dei coattivatori

che rendono la zona maggiormente disponibile; tra tutti sicuramente i più rilevanti sono i

rimodellatori della cromatina che abbiamo citato prima. Nel caso specifico dell’acetilazione

interviene SWI/SNF (Swisniff) che è in grado di riconoscere la modificazione quando reclutato su di

essa grazie ai suoi bromodomini e di svolgere e rilassare la cromatina. In condizioni di

ipoacetilazione questi elelmenti non saranno reclutati, ma vi saranno altri readers in grado di leggere

la mancanza di modificazione o altri tipi di cambiamenti istonici.

Nella metilazione abbiamo readers che formano dei cromodomini in grado di riconoscere le lisine

metilate.

Importante!!! —>L’inattivazione della trascrizione di un gene è sempre legata ad una questione di

ingombro sterico: come l’acetilazione allenta l’interazione tra nucleosomi e DNA e libera

quest’ultimo, un maggiore compattamento e condensazione ha l’effetto esattamente opposto.

I primi studi sui nucleosomi supponevano che il loro ruolo e quello della cromatina fosse interamente

di inibizione trascrizionale, mentre oggi sappiamo che dipende dal loro rilassamento o

compattamento; se il DNA fosse interamente libero e trascrivibile non solo non avremmo

regolazione, ma sarebbe anche molto più instabile e vulnerabile a modificazioni. In generale allora

tutte le modificazioni epigenetiche entrano in qualche modo nel discorso condensazione-

decondensazione, direttamente o indirettamente, causando ingombro sterico e nascondendo

sequenze, ossia responsive elements, che potrebbero essere lette dai fattori di trascrizione, o al

contrario liberando zone.

Alle modificazioni sono associate altre attività coattivatorie o corepressorie, con proteine che

reclutano altri enzimi oppure determinano altre modificazioni; di per sé per la base del processo è

sempre questione di possibilità o meno di riconoscere le sequenze determinate dall’ingombro e

tutto si riduce ad un fatto strutturale.

Per fare un esempio di come altre attività entrino in gioco in questo ambito, sappiamo già che nel

DNA abbiamo una distinzione tra eucromatina aperta e trascrivibile ed eterocromatina

compattata, che per la gran parte ha un ruolo di stabilità e non viene attivamente trascritta (o

quasi); essa è formata da numerose sequenze ripetute, che sono uguali in tutti i cromosomi e

prendono il nome di DNA alfoide, DNA satellite 1, 2, 3, ecc. Oltre alle zone telomeriche e

centromeriche/pericentromeriche dei cromosomi l’eterocromatina si pu osservare anche nell’intero

cromosoma X secondario delle cellule femminili, che viene completamente inattivato e forma un

corpo di Barr. 20

Sono state sintetizzate molecole che inibiscono le azioni degli enzimi writers o readers. Questi

inibitori agiscono in maniera a-specifica, inibiscono l’attività di quell’enzima su tutto il genoma (non

si inibisce la regolazione di un gene mirato, ma tutti).

Esistono dei meccanismi di editing epigenetico, come il sistema di editing CRISPR-Cas9. Sfruttano

meccanismi mirati che permettono di modificare l’espressione genica di un gene target.

Senescenza la cellula può invecchiare e non replicare più, può anche invecchiare prima del dovuto

in seguito a danni al genoma e altre cose che le fanno decidere di bloccare il ciclo cellulare forever.

Senescenza precoce.

Fosforilazioni di serine e treonine

La serina 10 in H3, se fosforilata, condiziona le modificazioni epigenetiche di altri amminoacidi e

facilita la trascrizione (se non c&rsq