Appunti 5 lezione Genetica e microbiologia c.i.

TRASCRIZIONE NEI PROCARIOTI

Per iniziare la trascrizione è necessario che venga riconosciuta la regione del promotore dai fattori

sigma che recluteranno l’RNA-polimerasi. L’RNA-polimerasi non necessita di un primer innesco; il

primo nucleotide inserito è quello +1. Dopo il riconoscimento del promotore, l’RNA-pol procede

all’elongazione fino a quando non incontra una sequenza di terminazione.

L’RNA-polimerasi batterica è costituita da 2 subunità α e 2 subunità β che vengono reclutate dal

fattore σ. La subunità σ riconosce una regione del Promotore, a cui si attacca e le elicasi

denaturano la doppia elica di DNA. La subunità σ può dissociarsi dal core o nucleo dell’enzima e

può iniziare la trascrizione.

Ci sono molte famiglie di subunità σ, ognuno delle quali sono specifiche per specifiche sequenze di

specifici promotori.

Dopo l’inizio avviene l’elongazione del trascritto, il core di RNA P comincia a

scorrere lungo l’elica “stampo” del DNA; i ribonucleotidi trifosfato vengono

legati all’estremità 3’ libera della catena grazie all’energia di legame proveniente

dalla rottura dei legami fosforici.

La terminazione della trascrizione avviene grazie a delle sequenze che hanno una simmetria

bipartita. Infatti essendo presenti due sequenze ripetute e invertite, quando queste saranno

trascritte in RNA si appaieranno formando una struttura a forcina che determina un cambiamento

conformazionale dell’RNA polimerasi che gli farà perdere affinità con lo stampo.

Un altro tipo di terminazione è quella Rho-dipendente che è mediata dal fattore Rho che lega la

struttura a forcina e fa perdere affinità alla polimerasi.

TRASCRIZIONE NEGLI EUCARIOTI

L’inizio della trascrizione negli eucarioti è altamente regolata, infatti sono presenti:

1. Enhancers: regioni del DNA in 5’ che attivano la trascrizione

2. Silencers: regioni del DNA in 5’ che reprimono la trascrizione

Che esplicano la loro funzione in una certa quantità grazie a delle proteine regolatrici. La

regolazione non è mai un’attivazione o un’inibizione totale ma una stimolazione o

un’attenuazione. I fattori che legano gli enhancers e i silencers sono a loro volta legati da

complessi proteici mediatore che legano questi al complesso che lega invece il promotore che a

sua volta va a legare l’RNA polimerasi.

A contrario dei procarioti che presentano una sola RNA polimerasi per trascrivere i vari RNA, gli

eucarioti ne presentano 3:

RNA pol II, che trascrive l’m-RNA

RNA pol I, che trascrive r-RNA

RNA pol III, che trascrive t-RNA e sn-RNA

Affinchè possa iniziare la trascrizione si deve assemblare un complesso di pre-inizio in cui TFIID

(formata dai fattori TAFs e TBP) lega il promotore TATAbox e recluta TFIIA e TFIIB. L’RNA-pol può

essere reclutata dal complesso di pre-inizio della trascrizione grazie alla presenza del fattore TFIIF

sulla polimerasi. Le elicasi TFIIE e TFIIH si legano anche esse al complesso di pre inizio nel

promotore e determinano l’apertura del doppio filamento di DNA e inizia la trascrizione.

L’m-RNA che viene trascritto sia negli eucarioti che nei procarioti possiede due regioni non

codificanti al 5’ (5’-UTR) e al 3’(3’-UTR), esse sono regioni fondamentali per la regolazione

dell’inizio e terminazione della traduzione.

Nei procarioti la trascrizione è contemporanea alla traduzione, infatti il trascritto man mano che

viene prodotto è attaccato da ribosomi che lo traducono. Negli eucarioti, poiché la trascrizione

avviene nel nucleo e la traduzione nel citoplasma, i due eventi sono disaccoppiati, inoltre, prima

che possa essere tradotto, l’m-RNA deve subire delle modifiche post-trascrizionali.

Le modifiche post-trascrizionali comprendono: la metilazione dell’estremità 5’ che funge da

cappuccio di protezione, l’aggiunta di una coda di poli A al 3’ di lunghezza proporzionale alla vita

media dell’RNA nella cellula, la rimozione degli introni e splicing.

Il cap al 5’ : All’estremità 5’del messaggero eucariote viene aggiunto un cap

(cappuccio) formato da una G e due gruppi CH3.

Il poliA in 3’ : All’estremità 3’ del messaggero eucariote viene aggiunta una serie

di A, o poli(A) da parte della PAP ( poly A Polymerasi).

Esperimento Chambon: ibridazione m-RNA-DNA

Sequenziando il DNA di alcun geni studiati a quel tempo, come quello dell’ovalbumina, e

confrontandolo con il sequenziamento dell’m-RNA maturo nel citoplasma ci si accorse che

mancavano alcuni tratti.

L’esperimento chiave fu quello di utilizzare m-RNA maturo di ovalbumina e farlo ibridare con il

DNA del gene dell’ovalbumina. Osservando la foto ci si accorse che c’erano alcuni tratti molto

elettrodensi e altri molto meno. Dedusse che la parte densa rappresentasse l’appaiamento DNA-

RNA invece quella meno elettrodensa corrispondesse a loop di DNA; questi loop sono quindi

regioni che vengono trascritti in RNA ma che prima che il messaggero passa nel citoplasma

vengono eliminati poiché non codificanti.

SPLICING

Il pre m-RNA prima di passare dal nucleo al citoplasma, durante il processamento, perde le

sequenze non codificanti chiamate introni mentre gli esoni codificanti vengono mantenuti e

costituiranno l’m-RNA maturo.

Esiste un macchinario, chiamato splicesoma, in cui fanno parte proteine e sn-RNA; Lo snRNA, unito

a proteine, costituisce complessi chiamati snRNP (small nuclear ribonucleoproteins), che

riconoscono specificamente le sequenze di consenso dei siti di splicing al 5' e al 3' di ogni introne e

il residuo di adenosina che andrà a costituire il sito di ramificazione dell'intermedio di maturazione

"a cappio".

Attraverso lo splicing e grazie alla presenza degli introni da un unico trascritto è possibile ottenere

m-RNA maturi diversi che codificano per proteine diverse.

ESEMPIO: SPLICING ALTERNATIVI α-TROPOMIOSINA

In rosso sono mostrati degli esoni che non sempre presenti nell’m-RNA dell’α-tropomiosina invece

in giallo, bianco e verde abbiamo degli esoni che possono essere eliminati durante il processo di

splicing alternativo a seconda della variante di tropomiosina necessaria a quel tessuto.

EVOLUZIONE DEGLI INTRONI

Sull’evoluzione degli introni sono state proposte due ipotesi:

Precoce

Gli introni erano una caratteristica essenziale dei primi organismi. La loro assenza nei batteri

sarebbe dovuta ai tempi più brevi di divisione cellulare, e dunque al maggior numero di

generazioni durante le quali il genoma batterico si è evoluto, perdendo

(quasi) tutti gli introni ancestrali.

Tardiva

Gli introni non erano presenti nei primi organismi. Sarebbero arrivati di recente negli Eucarioti, nel

corso dell’aumento di complessità che ha creato la necessità di sviluppare meccanismi

di controllo coordinato dell’espressione genica. Quest’ipotesi è la più accreditata.

Gli introni, oltre a essere necessari a produrre varianti geniche, dopo lo splicing, vanno incontro a

un ulteriore processamento di particolari sequenze al loro interno così da formare i micro-RNA;

questi sono in grado di attaccare il 3’ degli m-RNA per regolare la traduzione delle proteine nei

ribosomi. Ogni RNA messaggero è regolato da cascate di micro-RNA.

In sintesi:

Tuttavia vi sono delle eccezioni a questo processo, infatti i ricercatori osservando l’m-RNA per il

gene mitocondriale citocromo ossidasi III di tripanosoma Brucei notarono che non vi era

corrispondenza con il DNA e la situazione era reciproca a quella degli introni. Nella norma si hanno

tratti di DNA in eccesso rispetto a quelli di RNA invece in questo caso si potevano notare tratti

nucleotidici in eccesso nell’RNA rispetto al DNA. Si scoprì che in alcuni organismi come

tripanosoma brucei, parameci, leishmania ecc… dopo che il DNA viene trascritto fedelmente

intervengono degli enzimi che, utilizzando degli RNA-guida, inseriscono delle U.

Un processo di editing simile è anche presente nella trascrizione dei geni mitocondriali.

TRASCRIZIONE DEGLI r-RNA NEGLI EUCARIOTI

L’r-RNA viene trascritto dall’RNA-polimerasi I a partire da un gene unico che è costituito da una

serie di regioni intergeniche spaziatrici e da unità funzionali chiamate 18S, 5.8S, 28S. I vari tratti

vengono trascritti in un unico RNA continuo che deve poi subire un processamento grazie a vari