Dissezione della funzione genica

GENETICA INVERSA.

Nella genetica inversa si parte dalla conoscenza della sequenza del genere, ma non si conosce la

funzione.

Quindi, decidiamo di determinare la funzione di un gene con un approccio di genetica classico

(genetica diretta) o con un approccio di genetica inversa, a seconda se conosciamo oppure no la

sequenza di quel genere ma non conosciamo la funzione del gene. Se abbiamo la sequenza del gene

allora partite con la genetica inversa; se invece è incognita la sequenza del gene dobbiamo adottare

l'approccio di genetica diretta.

Consideriamo i geni umani, i quali sono già tutti noti cioè ne conosciamo la sequenza di tutti i geni

umani, ma per molti di questi geni non conosciamo ancora la funzione.

Oggi, per definire la funzione di questi geni di cui già conosciamo la sequenza ma non conosciamo

la funzione, in genetica utilizziamo l'approccio di genetica inversa. L'approccio di genetica inversa

parte dal concetto che è nota la sequenza di questa molecola, del gene, ma non è nota la funzione. A

questo punto per capire qual è la funzione di questo gene si isola il gene e si inducono delle mutazioni

nell’organismo

che sono cosiddette sito-specifiche, le quali vengo introdotte modello e si osserva

quell’individuo.

come varia il fenotipo di Quindi nella genetica inversa:

1. si parte dal conoscere il gene;

2. si induce la mutazione;

nell’organismo

3. lo si introduce modello;

nell’organismo

4. e si vede come altera il fenotipo modello

.

È possibile indurre mutazioni attraverso:

▪ la MUTAGENESI SITO-SPECIFICA (o GENE-SPECIFICA) che si avvale di una serie

di tecniche ingegneria genetica tra cui, per esempio, la tecnica della TRANSGENESI che

sfrutta la ricombinazione e il processo di crossing-over che avviene tra due sequenze appaiate

all’interno

per elevato grado di omologia e la possibilità di introdurre di un genoma wild type,

un gene specifico in cui è stata indotta una mutazione in modo da ottenere degli organismi che

“knockout l’abolizione

hanno subito genico” (inattivazione genica), ovvero completa della

funzione di quel gene. La mutagenesi specifica è il principale approccio che viene utilizzano

nella genetica inversa.

d’interesse

Una volta ottenuto il gene isolato in un oganismo wild type, la prima cosa che un

all’interno

genetista fa per determinare la sua funzione è quello di clonarlo di un vettore a singolo filamento

in modo da poterlo mutagenizzare attraverso degli approcci di mutagenesi sito-specifica che sfrutta diverse tecniche

di ingegneria genetica.

▪ la MUTAGENESI SITO-DIRETTA (metodo oligonucleotide-diretto): è una tecnica che si

basa nel rendere a single strand il plasmide e nel fornire un oligonucleotide dove è presente

L’oligonucleotide,

una base modificata. il portatore della mutazione che abbiamo deciso di

indurre in questo gene, presenta una mutazione per transizione; Vi è una TA convertita in CG.

Quindi il plasmide viene reso single strand e poi successivamente gli viene fornito un

oligonucleotide che si appaia per complementarità perfetta per tutti i nucleotidi tranne per una

coppia, dove vi è una C al posto di una T.

A questo punto, all'interno di

questo nucleotide si crea un

mismatch, ma

l'oligonuclotide, nonostante il

mismatch, si associa in

maniera specifica su questa

regione del gene su cui si

vuole indurre la mutazione. A

questo punto basta fornire una

DNA polimerasi e i quattro

dideossinucleotidi e la DNA

polimerasi inizierà a

utilizzare questo

oligonucleotide come innesco

di polimerizzazione e

utilizzando come lega-stampo quello single strand DNA. In questo modo si ottiene un

plasmide in cui si è creato il mismatch e poi, veicolando questo plasmide, si possono

trasformare dei batteri. Infine, è possibile isolare tutti quei batteri in cui è presente la molecola

plasmidica in cui il mismatch si è tradotto in una transizione, ovvero in cui si è formata

fondamentalmente una transizione. A questo punto prendete questo plasmide in cui avete

introdotto una mutazione sito-specifica, in modo particolare una transizione, e inseritela

nell'organismo modello e osserviamo cosa determina questa mutazione a livello della funzione

di questo gene che si riflette con un fenotipo mutante.

Con il medesimo approccio si possono indurre anche inserzioni o delezioni, utilizzando un

nucleotide che è più lungo o più corto rispetto alla regione che si vuole mutagenizzare.

È possibile utilizzare un approccio alternativo, è possibile indurre delle delezioni:

- è necessario uno studio della mappa di restrizione di questo plasmide e individuare due siti

di restrizione che permettono di tagliare in maniera specifica il gene in due porzioni diverse,

in maniera tale da eliminare un tratto di DNA e facendo chiudere il plasmide in assenza di

questo tratto si è chiaramente introdotta una mutazione (delezione);

un’inserzione

- oppure si può addirittura indurre eliminato un pezzo wild type dal gene in esame

un’inserzione

e introdurre un altro pezzo in cui a precedentemente è stata introdotta

(sostituzione a cassetta);

- infine, è possibile linearizzare il plasmide e poi con attività esonucleasica erodere la parte del

plasmide che contiene il nostro gene in maniera tale da eliminare dal gene di interesse una certa

d’interesse

regione per poi richiudere e ottenere un plasmide dove il gene ha in subito la

delezione in un certo tratto di DNA (gruppo di delezioni).

l’approccio

Possiamo utilizzare della PCR per indurre altre mutazioni sito-specifiche dove si disegna

degli oligonucleotidi che vengono utilizzati per amplificare il gene di nostro interesse, in cui è

all’interno

presente uno dei due già la mutazione che abbiamo deciso di introdurre del gene stesso.

Sono diversi gli approcci metodologici che permettono di indurre mutazione sito-specifica nel gene

di interesse.

 Bisogna inattivare il gene attraverso le varie tecniche precedentemente

mostrateintroduciamo all’interno di un organismo modello. Da questa mutazione si otterrà



un fenotipo mutante da cui deduciamo la funzione del gene stesso.

La genetica inversa in realtà utilizza anche le fenocopie per indurre la formazione di fenotipi mutanti.

Metodo alternativo rispetto alla mutagenesi sito specifica. all’interno

Mentre la mutagenesi sito specifica induce mutazione realmente del gene per annullare la

funzione di quel gene, con le fenocopie non si va a indurre mutazione nel gene, per indurre la perdita

l’espressione dell’mRNA

delle sue funzioni, ma si va ad alterare del gene a livello a livello del

l’RNA

prodotto proteico in maniera tale da inattivare trascritto dal gene di interesse, o la proteina

l’espressione

tradotta e codificata da questo gene, in maniera tale da annullare questo gene che in

qualche modo ha fenotipicamente lo stesso effetto di una mutagenesi sito-specifica.

quindi

Si va a mimare un fenotipo mutante si va a fare una copia del fenotipo mutante (fenocopia)

l’espressione

da qui si ottiene (non riducendosi in mutazione sito specifica) bloccando del gene stesso.

 Il vantaggio è che si otterrà un fenotipo mutante senza fare mutagenesi sito specifica.

 Lo svantaggio è dato che non sta riducendo mutazioni allora la progenie dell’individuo non

erediterà il fenotipo mutato.

Si possono fare fenocopie di due livelli:

l’espressione l’mRNA

1. alterando del gene e quindi andando a degradare del gene che si vuole

l’espressione

studiare, in maniera tale di annullare del gene e quindi mimare la perdita di

funzione del gene. dell’mRNA

2. si può agire non a livello ma livello della proteina, fornendo alla proteina,

codificata da questo gene, un inibitore che si sviluppa ed è in grado di bloccare il sito

catalitico della proteina, qualora questo gene codifica per un enzima.

“Si dell’mRNA dell’mRNA

può bloccare o l’espressione genica a livello inducendo degradazione

l’espressione inibitori.”

oppure bloccare sempre genica ma a livello della proteina fornendo dei

 L’approccio che permette di bloccare, di fare fenocopie, prende il nome di RNAi dove c’è

‘’i’’ ‘’interference’’.

l’interferenza del RNA, infatti sta per

 L’approccio sperimentale che va a bloccare l’espressione genica a livello della proteina

utilizzando degli inibitori prende il nome di chemiogenomica.

RNA INTERFERENCE È un meccanismo di diffuso in natura che

serve a come strumento per difendersi da

infezioni virali. In modo particolare da quei

virus che hanno dei genomi sotto forma di

all’interno

double strend. Infatti delle

diverse cellule esiste un meccanismo di

RNA interference, che viene utilizzato dalla

cellula per difendersi da attacchi virali di

virus che hanno come genoma un doppia

elica di RNAQuando la doppia elica di

RNA viene riconosciuta e si ritrova

all’interno di una cellula, scatta

immediatamente il segnale che attiva il

complesso dicer. Questo complesso è multi-

proteico, caratterizzato dalla presenza di

alcune proteine che sono delle

endonucleasi.

Il complesso riconosce il double Strand

come materiale genetico che non appartiene

Come materiale che non appartiene cellula e che molto probabilmente potrebbe essere virale. Lo inizia a

degradare in tanti frammenti, che sono circa lunghi 21-22 nucleotidi.

A questo punto i frammenti vengono riconosciuti da un complesso chiamato RISC, che rende questi

l’elica l’RNA all’interno

frammenti a singola elica e utilizza per andare a identificare virale della

cellula. l’ha

Una volta che identificato per complementarietà, grazie ad un RNA guida fornito da dicer, si

l’RNA

riconosce virale esogeno e lo inizia a degradare, in questo modo la cellula si difende

dall’attacco di virus ad RNA l’espressione

I ricercatori hanno pensato di sfruttare questo meccanismo per targhettare, bloccare, di

geni endogeni di cui uno non conosce la funzione.

ESPERIMENTO Immaginiamo di non avere un RNA virale ma una sequenza del gene che si vuole

studiare. Di questo gene conosco la sequenza ma non conosco la funzione. Conoscendo la sequenza

posso determinare la copia in RNA. Convertendolo in RNA posso chiedere ad una biotechnical di

l’RNA

sintetizzare i double strand di RNA che sono in grado di attivare il RISC e di targhettare

sull’RNA del gene endogeno, di cui non conosco la funzione.

l’espressione

A questo punto RISC va a targhettare d