Domande di Genetica

ORGANIZZAZIONE DELL’OPERONE LAC SELVATICO DI E. COLI

L’operone presenta geni codificanti e lo si può vedere perché hanno tutti lunghezze che sono multiple di 3.

[ORF: open reading frame. ATG … 3n … TAA. Meccanismo di base per identificare regioni potenzialmente trascritte e

tradotte]

Il promotore è unico per tutti e tre i geni. A monte dell’operone c’è un altro gene, lac I, che ha un suo promotore e

terminatore. Il gene lac I non fa parte però dell’operone lac. Lac I è un gene costitutivo, non è regolato, quindi viene

trascritto e tradotto durante tutto il ciclo cellulare. Il gene lac I codifica per una proteina che si chiama proteina

repressore, perché reprime la trascrizione dell’operone lac. La proteina repressore ha una affinità con la sequenza del

sito operatore, mediante legami deboli. La proteina repressone ha funzione di ingombro sterico per la RNA-polimerasi,

che quindi non può trascrivere i tre geni strutturali dell’operone lac. 71

Questo spiega come mai una

minima attività β-galattosidasica

sia presente comunque nella

cellula: essendo la proteina

promotore legata sul DNA da

legami deboli si è sempre in un

equilibrio dinamico, in cui la

proteina tende a rimanere legata,

ma potrebbe anche staccarsi. Nel

breve momento in cui la proteine

si stacca, in presenza di una RNA-

polimerasi pronta, essa riesce a

passare e a trascrivere l’operone

(producendo qualche molecola di β-galattosidasi) anche senza la presenza di lattosio, ma solo in presenza di glucosio.

In presenza di lattosio, quindi in assenza di glucosio…

La proteina repressore presenta un sito di riconoscimento/affinità con il lattosio. Il repressore si lega al lattosio, anziché

all’operatore, subendo una modifica conformazionale (essendo una proteina allosterica) che lo rende incapace di legarsi

all’operatore. La RNA-polimerasi quindi riesce a trascrivere i geni strutturali dell’operone.

[struttura quaternaria del repressore dell’operone lac. L’ansa è per il riconoscimento

del DNA, mentre la regione delle 4 α-eliche è per il riconoscimento del lattosio] 72

Se la cellula ha a disposizione glucosio e lattosio contemporaneamente, l’operone lac è indotto? Dal punto di vista logico

ci sarebbe da attendersi di si, ma non succede così, perché sarebbe uno spreco sintetizzare la β-galattosidasi quando è

più comodo l’utilizzo di glucosio.

→ REPRESSIONE DA CATABOLITI

L’operone non è indotto, in presenza del

glucosio, per causa di un altro fenomeno di

regolazione sovrimposto a quello

dell’operone, la repressione da cataboliti, o

catabolite repression.

L’RNA-polimerasi non riesce a legarsi al

promotore dell’operone a meno che non ci sia

il complesso CAP-cAMP.

La CAP, o Catabolite Activator Protein, è una

proteina omodimerica (due polipeptidi

identici). Le due molecole formano un

complesso che si lega ad una regione

immediatamente a monte del promotore

dell’operone. Solo in presenza del complesso

CAP-cAMP, la RNA-polimerasi riconosce il

promotore.

La presenza del complesso CAP-cAMP è in base

all’AMP ciclico (cAMP), che è indice dello stato

metabolico della cellula. Il cAMP svolge

molteplici funzioni nella cellula, grazie al suo

ruolo di “secondo messaggero” (perché

trasmette segnali tra la membrana citoplasmatica, il citoplasma fino al nucleo). Essendo un sensore dello stato

energetico della cellula, il numero di molecole di cAMP è inversamente proporzionale al livello energetico (più presenta

cAMP, meno la cellula ha energia). La presenza di glucosio è sintomo di abbondanza di risorsa, in particolare, inibisce

l’attività dell’adenilato ciclasi, l’enzima che sintetizza il cAMP a partire dall’ATP. Quindi, in presenza di glucosio, non c’è

abbastanza cAMP per formare il complesso con la CAP e far partire la trascrizione dell’operone.

La repressione da cataboliti funziona anche per numerosi altri operoni catabolici.

La regolazione dell’operone lattosio è definita negativa: normalmente i geni sono spenti e viene attivato in presenza

dell’induttore. È negativa quindi perché si riferisce al fatto che l’operone non è attivo in condizioni normali.

Una mutazione, che altera la funzionalità della proteina, nel lac I a che cosa potrebbe portare? In seguito alla mutazione

la proteina non è più in grado di riconosceri il sito operatore, a meno della regolazione da cataboliti, si avrà che l’operone

c

diventa espresso costitutivamente (lacI ), quindi sarà sempre attivo.

La proteina repressore però ha anche il sito di riconoscimento per l’allolattosio, che nel caso subisca una mutazione, e

non più il sito per l’operatore, smette di funzionare e quindi non subisce più delle modificazioni conformazionali: la

s

proteina repressore si legherà sempre all’operatore e renderà l’operone costitutivamente represso (lacI ).

Che conseguenze si possono immaginare se la mutazione avviene sul sito operatore? Il sito operatore non ha un

prodotto genico, perché non viene trascritto e tradotto, ma anche lui può andare incontro a mutazione. La sua funzione

è quella di riconoscere la proteina repressore. Se subisce un cambiamento di sequenza può succedere che non riconosca

più la proteina, quindi si otterrà un mutante costitutivamente espresso (perché l’operone può essere sempre trascritto

e tradotto). Potrebbe esserci, al contrario, una mutazione che faciliti il riconoscimento del repressore, che non facilita

il distaccamento della proteina repressore dall’operatore e quindi si avrà un mutante costitutuvamente represso. 73

Considerando una cellula di E. coli, in cui è presente il cromosoma

c

batterico caratterizzato da lacI (o comunque una mutazione che non fa

funzionare il gene I), si inserisce al suo interno un plasmide con la

+

presenza di lacI .

Quale sarà il fenotipo della cellula? Il gene I sul genoma produce una

proteina repressore che non riconosce il sito dell’operatore, ma il gene

I sul plasmide produce una proteina repressore selvatica. Siccome le

proteine si diffondono nel citoplasma, la proteina selvatica andrà legarsi

con l’operatore, dando un fenotipo selvatico alla cellula. Si è creato un

+

batterio parzialmente diploide (merodiploide), poiché presenta due copie del gene I. Si può anche dire che lacI è

c

dominante su lacI .

OPERONE TRIPTOFANO – repressore anabolico

Se gli amminoacidi sono presenti nel terreno di crescita, E. coli li importa prima di produrli e quindi i geni per la sintesi

degli amminoacidi tendono ad essere repressi. Ma se la cellula si trova in un terreno privo di un determinato

amminoacido, i geni vengono attivati (o espressi) e avviene la sintesi degli amminoacidi.

L’operone trp di E. coli è uno dei più studiati. La sintesi del triptofano viene bloccata quando si ha un eccesso di

prodotto.

L’operone trp è stato caratterizzato da Charles Yanofsky.

- È lungo circa 7kb e produce 5 geni codificanti, richiesti per la sintesi dell’amminoacido triptofano: trp E-D-C-B-

A

- Il promotore e l’operatore sono a monte di trpE

- La regione leader (trpL) si trova tra i geni codificanti e l’operatore

- Entro trpL c’è una regione attenuatrice (att)

- trpR (gene per la proteina repressore) si trova a monte del promotore 74

Regolazione dell’operone trp (1° meccanismo):

Quando il triptofano è presente, questo si lega al

prodotto del gene trpR (proteina repressore). La

proteina trpR, unita al triptofano, si lega

all’operatore trp e impedisce la trascrizione. La

repressione riduce la trascrizione dell’operone

trp di 70 volte. Il gene regolatore R produce una proteina repressore che si lega all’operatore solo se è legata al trp

(corepressore).

Regolazione dell’operone trp (2° meccanismo): un secondo livello di regolazione dell’espressione genica può intervenire

dopo che la trascrizione ha avuto inizio. Si tratta di un “ripensamento” da parte del batterio, che non ha la reale necessità

di sintetizzare gli enzimi dell’operone. Questo sistema di regolazione si chiama attenuazione, processo di traduzione di

un corto polipeptide incompleto, con l’interruzione prematura della trascrizione, prima che i geni strutturali

dell’operone siano trascritti. L’attenuazione è possibile grazie alla sequenza leader.

Quando le cellule sono in carenza di triptofano, sono espressi massimamente i geni trp. Se si riduce la carenza di

triptofano, sono espressi sotto il livello massimo i geni trp. L’attenuazione può regolare i livelli di trascrizione di un

fattore tra 8 e 10, e combinato con il meccanismo di repressione, 560-700 volte.

Modello molecolare per l’attenuazione:

- Una regione leader (trpL) si trova tra l’operatore e la sequenza trpE

- Entro il leader c’è la sequenza

dell’attenuatore (att)

- La sequenza att contiene una ORF (anche

chiamata leader peptide coding region),

quindi un codone di inizio e un codone di

stop in fase + 2 codoni trp (consecutivi) e 4

regioni formate da sequenze palindromiche

che possono formare 3 alternative strutture

secondarie, con un appaiamento

mutuamente esclusivo:

1. regione accoppiata 1-2, pausa

2. regione accoppiata 2-3, anti-

terminazione

3. regione accoppiata 3-4, terminazione

Queste sequenze possono creare strutture a stem&loop che, quando si formano sul mRNA trascritto, sono segnali per

la continuazione o blocco della trascrizione, basandosi sulla concentrazione di tRNA carichi di triptofano.

1) Carenza di triptofano: in assenza di triptofano, l’operone deve essere attivo/espresso per poter produrre il

triptofano, quindi la RNA-polimerasi si posiziona sul promotore e inizia a trascrivere mRNA, partendo dalla

sequenza leader e avvicinandosi al primo gene strutturale (primo segnale di start si trova sull’ORF). Quando,

però, il ribosoma inizia a tradurre la sequenza leader, raggiunge la sequenza attenuatore e arriva ad avere il sito

A sopra la tripletta codificante il triptofano: per tradurre i due codoni triptofano presenti nell’ORF è necessario

che la cellula sia provvista di tRNA carichi di triptofano, che in questa condizione non sono presenti in quanto il

poco triptofano presente è utilizzato nella sintesi proteica. La traduzione, quindi, si blocca. L’RNA-polimerasi nel

mentre ha allungato l’mRNA e ha trascritto tutta la sequenza attenuatore. L’mRNA former&agr