Appunti della lezione di Virologia generale e molecolare sui vettori erpetici

La capacità di latenza può essere sfruttata per produrre un transgene nei

 neuroni;

Andando a togliere alcuni trascritti e proteine dal vettore herpetico, si

 può renderlo incapace di portare a termine la replicazione, lasciandolo in

uno stato di latenza permanente forzata (artificiale).

I geni da bloccare per evitare la lisi cellulare sono i geni immediate early (ICP4,

ICP27, ICP0, ICP22, ICP47). Togliendo ICP4 e ICP27, momento cruciale per

l’espressione successiva di geni precoci e tardivi, si riesce a bloccare la cascata

di espressione genica che porta, in ultima istanza, alla lisi della cellula

infettata.

Come si fanno i vettori erpetici?

Si può procedere tagliando via i geni non essenziali (replicazione condizionata).

In questo modo, si cerca di diminuire la patogenicità del virus, che diventa

incapace di replicare o comunque a basso titolo e nelle condizioni favorevoli,

come nel caso di cura di un tumore cerebrale: non si vuole far produrre un

transgene al tumore, si vuole che esso scompaia. Esso può scomparire grazie a

un virus che infetti le cellule in divisione, ma l’infezione deve rimanere sotto a

una certa soglia per evitare danni collaterali. Un altro modo per produrre un

vettore erpetico è asportando i geni essenziali (replicazione difettiva). Si

possono rimuovere CP4 e CP27, immobilizzando il virus con la cassetta di

espressione nella cellula infettata (il virus non è in grado di replicare). Il rischio

è che questi trascritti occupino comunque lo spazio all’interno del

nucleocapside. Esiste quindi un’altra strategia. Un terzo sistema (quello degli

ampliconi), quando si vuole veicolare più di una cassetta all’interno della cellula

bersaglio mediante il vettore erpetico, prevede la somministrazione dei geni

del virus in trans (all’interno di altri plasmidi), in modo tale che questi non

finiscano all’interno del nucleocapside. Fornendo due plasmidi molto grandi (di

solito, uno è un BAC), si fa impacchettare una particella che non possiede

nessuno di quei geni. Il BAC contiene il genoma di Herpes simplex, ma manca

del segnale di packaging, mentre il secondo plasmide trasporta il transgene e il

segnale di packaging di HSV. Non vengono espressi né i geni essenziali né

quelli non essenziali. L’espressione di questi geni non è contenuta all’interno

del vettore erpetico, ma in vettori di espressioni separati forniti alle cellule di

packaging per produrre particelle virali (cfr. lentivirus con gag e pol). Quindi

non si ha replicazione virale ed effetti citotossici dovuti all’espressione di

proteine virali.

Sono rappresentate due delle strategie di produzione di virus erpetici.

Nella prima, si trasfettano le cellule (cellule VERO, epiteliali renali di scimmia,

che si infettano molto bene con Herpes). Si allestisce una linea di cellule VERO,

che esprimano ICP4 (proteina essenziale) costitutivamente. Si possono

infettare le stesse cellule con un virus helper erpetico. trasfettandole

contemporaneamente con il vettore di espressione. Si produrranno due

particelle virali nelle cellule: quelle che contengono l’amplicone e quelle del

virus helper. Si vanno a infettare altre cellule in laboratorio e alla fine il vettore

recuperato dal surnatante (al 99%) sarà sicuramente quello contenente

l’amplicone, anche se una minuscola porzione (che dà contaminazione) di

particella helper rimane.

Mentre, invece, nel secondo caso, dove non si ricorre a un virus helper, si co-

trasfetta un vettore erpetico con un vettore di espressione BAC abbastanza

grande da portare al suo interno tutte le cassette di espressione necessarie per

l’assemblamento delle particelle virali. Nel surnatante, si ritroveranno soltanto

particelle virali vettoriali pronte all’uso nella terapia genica.

Tra i due sistemi, naturalmente, è più vantaggioso il secondo, dal momento che

non ci si avvale della presenza di un altro virus nel preparato, mentre i plasmidi

di espressione sono più facili da controllare.

Le varie proteine erpetiche svolgono differenti funzioni. Perché è così

importante rimuovere ICP4?

ICP4 blocca l’espressione dei geni immediate early (ICP) e attiva la trascrizione

dei geni precoci e tardivi. Se, ad esempio, si trasducesse con un vettore che

esprime ICP4 una cellula che presenta HSV in latenza, si rischia la riattivazione

dell’infezione nell’ospite. I primi geni, nella storia della progettazione vettoriale,

a essere stati rimossi sono stati ICP4, ICP0 e CP27, per impedire il procedere

della cascata di espressione genica di HSV. Tra tutti questi geni, ci sono

proteine legate alla neurovirulenza di herpes, come ICP34. A seconda del

contesto di applicazione, si decide cosa rimuovere. Per un approccio di terapia

genica che produca un transgene, tutte le suddette proteine non solo non sono

necessarie, ma provocano danni. ICP34 blocca l’autofagia. L’autofagia non è

una semplice degradazione degli organelli vecchi per ricostruirne di nuovi, è un

meccanismo che si attiva in seguito a uno stress subito dalla cellula, che

risponde allo stress, modulando l’autofagia. La cellula riesce a chiudere il

materiale all’interno di questo in membrane, gli autofagosomi, che vengono

bombardati da enzimi litici dei lisosomi. Il contento dell’autofagosoma viene

sciolto dall’azione degli enzimi lisosomiali. CP34 impedisce che questo accada

al virus, per farlo sopravvivere. Viene bloccata la virusfagia, attuata contro i

capsidi nel citoplasma dalla cellula che si accorge di essere stata infettata.

ICP34 è una proteasi che taglia Beclin-1, una delle proteine coinvolte all’inizio

del processo autofagico. L’autofagia serve a mantenere costante e a rinnovare

gli organelli a partire dal materiale vecchio digerito, soprattutto nelle cellule

nervose, che hanno un ciclo replicativo pressochè inesistente o molto lento,

quindi portano segni evidenti di aging. Se non avvenisse il turnover degli

organelli, la cellula nervosa andrebbe incontro ad apoptosi. Si parla di

neurovirulenza perché, con l’infezione da HSV, questo turn-over viene

stoppato.

Esistono vari vettori erpetici: le stanghette nere che attraversano la struttura

dei vettori rappresentano le delezioni nei geni ICP. Ci sono vettori con il

genoma sostanzialmente integro di HSV, con l’aggiunta di un transgene,

mentre altri presentano più siti di taglio che bloccano la trascrizione dei geni

precoci. Si possiede un’organizzazione diversa, perché sfruttano cassette di

espressioni all’interno del genoma di HSV variabili.

I primi vettori (KLZ, SLZ, SHZ, ecc.) sono utilizzati come vettori reporter, che

producono lac-Z, la timidina chinasi oppure una proteina fluorescente.

Altri, come TOCX e Nurel C, sono vettori erpetici usati nella lotta al cancro,

perché producono TNF-α, per attivare l’infiammazione e il processo

immunitario, o perché producono proteine litiche o tossine. Si hanno, poi,

vettori che portano geni di grandi dimensioni (trascritti per andare a sopperire

alle distrofie muscolari), come THD. Questi trascritti non potrebbero essere

trasportati altrimenti.

Le applicazioni dei vettori erpetici sono tante e coinvolgono il cervello, le

meningi, il midollo spinale, i motoneuroni, il trasporto di fattori coinvolti in

neuropatie periferiche (MGF), il sistema nervoso periferico, il sistema nervoso

autonomo. Le applicazioni per la terapia genica dei vettori erpetici sono

davvero numerose. Ne sono un caso i vari approcci per la lotta al cancro, con la

suicide gene therapy, che causa la morte delle cellule trasdotte, oppure la

produzione di TNF e di IL-10, che porti attivamente il sistema immunitario nella

massa tumorale, oppure il trasporto di proteine w-t (TNF, p63, ATM), che nel

cancro sono mutate o perdute, in un unico vettore, portando le cellule

cancerose a morire, osservando i danni irreversibili subiti da queste cellule.

Un’altra grossa applicazione è in funzione anti-angiogenesi. Le grosse masse

tumorali, per poter sopravvivere, producono una serie di vasi sanguigni, per

attaccarsi alla circolazione del nostro organismo. Si veicola, attraverso il

vettore, un blocco per il segnale di pro-vascolarizzazione e si impedisce

l’irrorazione di sangue della massa tumorale, aumentandone la mortalità per

starving e riducendo la probabilità che una cellula si stacchi dalla massa, vada

nel circolo e produca metastasi.

A livello cerebrale ci sono numerose applicazioni, per curare varie malattie

neurodegenerative, dalla corea di Huntington, all’Alzheimer, al Parkinson, per

evitare la perdita di neuroni con l’utilizzo di Bcl-2 e altre proteine. Il grosso

vantaggio di un vettore erpetico è la sicurezza di portare più trascritti. I vettori

erpetici possono trasportare in una cellula più trascritti, per curare malattie

multifattoriali, per trasportare geni di grandi dimensioni, oppure per

combattere malattie molto aggressive sfruttando la grande tenacia di HSV.

La terapia non neurologica basata su vettori erpetici è sia ex vivo o in vivo. Si

possono avere iniezioni muscolari di vettori per gene replacement (di DMD, ad

esempio), o in cellule adipose, per avere la produzione di proteine circolanti,

come NGF, interleuchine, TNF-α o altri mediatori del sistema immunitario. Si

possono sfruttare le iniezioni nel tessuto adiposo per produrre fattori di

coagulazione in pazienti che soffrono di emofilia. La terapia ex vivo è

paragonabile a quella degli altri vettori: prelievo di cellule staminali dal

paziente, trasduzione con un vettore erpetico, induzione del differenziamento

nel tipo cellulare richiesto, reinfusione delle cellule nel paziente. Si ottiene una

sacca di cellule sane, geneticamente modificate, che rimpiazzano

progressivamente le cellule malate del paziente.

Lo studio di nuovi vettori erpetici è importante perché hanno migliori capacità

di trasporto rispetto agli altri tipi di vettore. Sanno trasportare geni di grandi

dimensioni senza integrarsi all’interno della cellula.

In un vettore erpetico, si hanno U2 e U8, con all’interno una cassetta di

espressione, che contiene un promotore specifico, una sequenza IRES (Internal

Ribosome Entry Site). Questa sequenza si utilizza perché è possibile sfruttare

queste sequenze per far saltare il ribosoma dalla prima parte di un lungo mRNA

fino all’ATG collocata dopo l’IRES: si ottiene, in un unico trascritto, l’espressione

di due proteine, prodotte insieme in un unico mRNA.

I vettori erpetici ibridi

Si possono trasferire ai vettori erpetici caratteristiche da vettori virali di altri tipi

(lentivirali, retrovirali, AAV) per avere cassette integranti. Se ne possono avere

di quattro tipi: con AAV, con EBV (virus di Epstein-Barr), con EBV e un

re