Genetica

MUTANTI NUTRIZIONALI

La maggior parte dei batteri sono PROTOTOFI: crescono in terreni minimi, è facile coltivarli, anche per

questo vengono scelti. Terreni minimi hanno un gene di glucosio e sali inorganici.

AUXOTROFI: Non crescono in un terreno minimo, devono essere aggiunti i nutrienti specifici

(amminoacidi, proteine) che non sono in grado di sintetizzare da soli, e che sono necessarie per la loro

crescita

Abbiamo parlato degli auxotrofici all’inizio dell’esperimento di Beadle e Tatum su neurospora crassa e

abbiamo dimostrato che gli auxotrofici quando s’incrociano selvatici danno rapporto di 1:1 e quindi è un

singolo gene che è mutato.

Anche nei batteri c’è lo stesso concetto, l’assenza di un metabolita è complementata per far crescere

quel batterio, ecco perché si utilizzano gli auxotrofici.

I fenotipi nutrizionali sono facilmente analizzabili perché i mutanti vengono, appunto, individuati

mediante l’uso di terreni SELETTIVI, perché selezionano, cioè che mancano di una determinata

sostanza.

Nel caso di Coli lo facciamo crescere su un terreno privo di triptofano, nel caso di Salmonella mutante,

quindi Salmonella, auxotrofa la facciamo crescere in un terreno selettivo per istidina.

TEST DI MUTAGENESI sono molto importanti questi test che permettono di selezionare le sostanze

mutanti. 11

GENETICA 10 22/04 Questi test nel tempo

vengono sempre più

raffinati anche perché le

nuove sostanze che

vengono messe in

commercio sono sempre di

più, per cui è importante

avere questi test per fare

in modo di adottare dei

piani per diminuire il più

possibile l’esposizione

dell’uomo a queste

sostanze.

Quindi parliamo di

diminuire e non eliminare

alcune sostanze necessarie, sappiamo che esiste l’EFFETTO DOSE.

EFFETTO DOSE: a concentrazioni crescenti del farmaco o del mutageno notiamo un effetto di “picco di

mutazioni”

Quindi se dobbiamo dare un’ascissa e un’ordinata a questo saggio più diamo farmaco, più c’è

mutazione, meno farmaco meno mutazione.

Questo nel tempo ci elimina del farmaco, del farmaco che ha per esempio 24 ore di vita, cioè che il 50%

del farmaco è distrutto allora questo saggio che ci informa riguardo a quant’ è la dose che genera la

mutazione, deve essere fatto dentro alla finestra di tempo di vita del farmaco stesso, farmaco o

mutagenico, che generano mutazioni. Lo chiamiamo farmaco in qualunque modo.

È importante mettere a punto questi test per selezionare sostanze mutagene, il fine è adottare dei piani

per diminuire l’esposizione dell’uomo a queste sostanze.

Il concetto di sostanza mutagena non è il concetto tutto o niente, questo significa che certe sostanze per

diventare pericolose devono arrivare ad un certo livello, ad una certa dose.

Per esempio esistono delle tabelle per quanto riguarda i coloranti alimentari, alcune volte i coloranti

vengono banditi perché, attraverso gli studi, si è visto che quel livello dose, quantità che era stato

stabilito con i test che diventano sempre più fini non era più idoneo e quindi la sostanza può essere

bandita oppure viene abbassato la quantità di livello di sostanza che può essere aggiunta per esempio

agli alimenti.

Più sono sensibili i metodi di rilevazione della mutazione o dell’effetto del farmaco, più queste soglie

verranno abbassate. Se diventa più sensibile il test devono abbassare le soglie di pericolosità. 10 anni fa

era mutageno dose di farmaco picogrammi/microlitro adesso è mutageno femtogrammi/microlitro.

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GENETICA 10 22/04

L’effetto dose vale anche per le radiazioni, non solo per i mutageni fisici, il concetto è lo stesso.

Questi test possono essere realizzati su vari organismi, possono essere a breve o a lungo termine.

I batteri vengono utilizzati per verificare se una sostanza è mutagena o no, i batteri certamente non

sono l’uomo quindi ci chiediamo QUANTO È VALIDO UN TEST EFFETTUATO SUI BATTERI?

In realtà questi test servono per dedurre un probabile meccanismo causa- effetto anche sull’uomo.

TEST DI AMES IN SALMONELLA .

È uno dei test più utilizzati ed utili per determinare la mutagenesi di una determinata sostanza o di un

determinato composto, è un saggio di screening, vengono utilizzati diversi tipi di batteri mutageni, cioè

che hanno diverse mutazioni, cioè mutazioni frameshift, mutazioni di singole basi, mutazioni indel.

Ciò è utile ad individuare il picco di effetto di mutazione che provoca la sostanza utilizzata.

Se una sostanza reverte il fenotipo del mutante frameshift significa che quella sostanza provoca

delezioni, è un modo indiretto per capire l’effetto della sostanza.

Anche per Coli vengono utilizzati due ceppi diversi, esistono anche ceppi con mutazioni particolari.

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GENETICA 10 22/04

TEST DI AIMES NEL LIQUIDO

• Vengono utilizzati ceppi di Salmonella His –

• Si fanno crescere in terreno liquido

• Questi esperimenti in genere vengono fatti in grandi quantità in quanto si fanno esperimenti con

quantità crescenti di sostanza sospetta

Quando eseguiamo l’esperimento è fondamentale portare un CONTROLLO. Negli esperimenti vanno

SEMPRE PORTATI controlli positivi e controlli negativi. In questo caso portiamo il controllo negativo che

serve per fare un confronto tra le mutazioni spontanee, e quindi il numero di colonie che crescono

sulla piastra dove non c’è la sostanza e si confrontano con quelle che ci sono sulla piastra in cui è

presente il farmaco.

Nella coltura di controllo c’è o acqua o la sostanza che viene utilizzata per la diluzione del mutageno.

Viene piastrata la piastra di batteri insieme alla sostanza mutagena. Nel nostro terreno di coltura è

sempre presente un po’ di istidina, in quantità di mutante per dare la spinta alla crescita batterica,

dopodiché quelle che His - non crescono più ma se nel frattempo si sono creati dei mutanti His +

cresceranno ecco perché si aggiunge un po’ di istidina nel hagar che serve da innesco per la crescita

batterica. 14

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Le piastre vengono incubate a testa in giù per circa 48 ore a 37 gradi.

Cosa è successo? Piastra di controllo ci sono alcune colonie, ma dato che la mutazione spontanea esiste

non ci meravigliamo che ci siano.

I risultati possono essere di due tipi: sulle piastre in cui è stato messo la nostra sostanza mutagena può

capitare ci sia un numero di colonie limitato oppure un numero elevato di colonie.

Che cosa significa questo ? supponiamo che sulle piastre del test ci siano alcune colonie His +.

Innanzitutto faccio il confronto con il controllo e conto le colonie che ci sono:

• se il numero di colonie è paragonabile deduco che quella non è una sostanza mutagena.

• se invece ho tante colonie, questo mi dice che la sostanza è un mutageno perché mi ha

provocato la regressione di molti batteri.

Non tutte le sostanze sono mutagene di per sé ma lo possono diventare: in questo caso si parla di

PROMUTAGENI, TRAMUTAGENI.

Quando diventano mutageni? Quando metabolizzano soprattutto a livello epatico.

È chiaro che il test di Aimes non mi evidenzia le sostanze promutagene.

Non tutte le sostanze sono mutagene, ma lo possono diventare, in questo caso si parla di promutageni.

Quando diventano mutageni? Per esercitare la loro attività necessitano dell'attivazione metabolica, soprattutto a

livello epatico all'interno di tessuti di organismi superiori.

In questo caso il test classico di Ames non smaschera i promutageni, dunque è servita una modifica

all’esperimento: Tale modifica è stata apportata aggiungendo nel

medium di coltura dei batteri anche l’estratto di

fegato di ratto S9, un estratto di enzimi epatici che

simulano il metabolismo dei mammiferi responsabili

dell'attivazione di molti procancerogeni.

Esiste anche un’attivazione metabolica extraepatica:

fondamentalmente quando parliamo di attivazione

metabolica è molto più usato l’esperimento con il

fegato. Tuttavia esiste anche una serie di mutageni

che hanno un'attivazione extraepatica, un esempio è

al livello dello stomaco o al livello delle vesciche: un

esempio pratico lo possiamo osservare se prendiamo

in osservazione i nitriti, che non sono altro che dei

conservanti messi nei prodotti alimentari. Questi

reagiscono con le ammine, derivanti dalla degradazione del cibo, che nello stomaco che in presenza di acidità

gastrica formano delle microsammine elettrofile che vanno ad interagire con il DNA, per la precisione il DNA delle

cellule della mucosa gastrica.

Qual è la conseguenza di tutto questo? L’insorgenza del carcinoma gastrico.

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GENETICA 10 22/04 Osserviamo ora il test di Ames di un solido:

Notiamo due piastre: sulla piastra di sinistra

abbiamo una serie di colonie cresciute,

mentre sulla piastra destra osserviamo un

qualcosa al centro, poi uno spazio vuoto e

alla fine tante colonie che man mano che si

allontanano dal centro diminuiscono. Cosa

significa ciò?

Questo rappresentato è proprio

l’esperimento di Ames di un solido:

Si seminano i batteri su una piastra di

terreno solido di agar più una piccola

quantità di istidina (per permettere la

formazione delle colonie iniziali, dunque per favorire la creazione di mutanti, e per svelare le mutazioni che

necessitano di più cicli di riproduzione cellulare prima di manifestarsi a livello fenotipico: per esempio le

mutazioni puntiformi). In seguito al centro del terreno di coltura si colloca un disco di carta da filtro contenente la

sostanza oggetto d’esame (campione), che si diffonde nel terreno

generando così un gradiente di concentrazione. Il vuoto intorno si crea

poiché una volta messo questo dischetto di carta è talmente alta la sua

concentrazione che non c'è crescita batterica e dunque risulta letale, ma

man mano che ci allontaniamo si crea un gradiente di crescita: si crea

dapprima una grande presenza di colonie batteriche e più ci avviciniamo

alla periferia più ci avviciniamo allo stesso numero di colonie del

controllo (cioè lo stesso numero di colonie presente nella piastra di

sinistra):

Questo cosa significa? Significa che nella piastra di destra inizialmente

c’è stata una grandissima quantità di cellule retromutate mentre più ci

avviciniamo alla periferia più ci avviciniamo al numero di colonie che si creerebbero spontaneamente.

Ci sono però dei limiti al test di Ames, quali sono?

Uno dei primi limiti l&rsqu