Cenni di Microbiologia

Esiste un momento di diploidia nelle cellule batteriche? Sì

In quale momento? Nella coniugazione batterica.

Questa coniugazione su quali batteri è vista? Su Hfr.

Questo evento è diploidia? Sì.

Come si chiama l’evento e quale tipologia di replicazione c’è? Exconiugante e merizigote.

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Il crossing over deve essere doppio per fare in modo che ci sia ricombinazione e i momenti di scambi sono

legati ai tempi di ingresso dell’F’ in Hfr nel ricevente F-.

Quindi l’elica si svolge, come arriva il primo allele c’è l’allineamento, l’ultimo più tardivo è quello a venti

minuti della coniugazione. Le distanze tra gli alleli in questi eventi di crossing over sono misurati in minuti.

Come si identificano le funzioni di trasformazione e di tetrazione oggi.

Ci sono delle tecnologie di clonazione dei DNA delle linee parentali Hfr, si colora il genoma del DNA di Hfr

con dei coloranti che rispondono a particolari raggi laser su eccitazione e questi pigmenti sono delle cianine

che vanno nel rosso. L’elemento F- quindi quello che riceverà l’integratore, generalmente ha un DNA che si

può ricombinare con un pigmento che va a legare un DNA endogeno sotto eccitazione del laser ed

emettere il verde. Quindi questo evento di coniugazione che porta a merizigoti nel microscopio sarà visibile

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con colore giallo, perché il giallo sta nell’intensità rosso-verde e questi sono batteri o tutti gialli o che

stanno avendo eventi di combinazione.

Quindi se diamo ai loci dei particolari nomi allelici con l’evento di ricombinazione potrebbero esserci

fenomeni ricombinanti o meno ricombinanti. Il genotipo può essere A+ o A- a seconda se sia di

ricombinazione o meno. Queste metodologie di permetteranno di vedere le distanze tra gli alleli. Se noi

mettiamo una serie di altri loci che danno resistenza a particolari substrati, crescendo poi il dominante sui

substrati possiamo fare la mappa di quello che si è integrato e quale no e determinare anche quanti

crossing over sono avvenuti affinché ci sia stato l’evento ricombinante.

La legge è “più sto in coniugazione e più passo alleli e nei tempi di coniugazione passo gli ultimi alleli

presenti sul plasmide F” e da questi elementi si deduce anche che l’F è un vettore circolare in quanto

continua a mandare lo stesso ordine di alleli quanto più la coniugazione avviene (per cui i nuovi alleli che

sta donando sono sempre gli stessi del circolo).

Questo è importante perché cosi noi dissezioniamo l’azione di resistenza a quel particolare substrato.

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Altro metodo per generare i ricombinanti in batteri: utilizzare i BATTERIOFAGI

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Esistono più tipi di batteriofagi, tra questo il T4, il quale è costituito da una testa che è un icosaedro, in

questa struttura di proteine c’è il suo genoma dna, poi c’è una struttura a collo o collare centrale vuota

dove queste proteine generano un canale e nella parte esterna c’è una guaina di struttura del batteriofago,

in fondo abbiamo la piastra basale che è piena di proteine che hanno capacità recettoriali, cioè che

reagiscono con altre proteine.

Il batteriofago una volta piegata la membrana e attraverso proteine che degradano la parete extracellulare

del batterio e legato, invia il suo genoma all’interno del periplasma del batterio stesso.

Infezione multipla di batteriofagi

Alcuni sono vuoti e stanno inviando nella cellula il loro genoma ed altri si stanno staccando per andare ad

infettare nuove cellule.

Abbiamo due tipologie diverse di infezioni a batteriofagi:

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→dove

-INFEZIONE DI TIPO LITICA il batterio se ha infettato copia se stesso tante volte all’interno del

batterio e poi lo uccide con una fase litica,quindi il batterio esplode ed i fagi vanno ad infettare nuovi

batteri. →dove

- CICLO LISOGENO il batteriofago utilizza la macchina di replicazione però convive nel genoma del

batterio stesso. Questi fagi lisogenici sono molto importanti perché hanno la capacità di integrare il loro

genoma nel genoma del batterio integrato.

Uno dei fagi più importante da studiare è il batteriofago λ [lambda].

Questo fago non infetta l’uomo, ma solo E-Coli, pertanto è facile maneggiarlo e nella slide si osserva una

piastra con una patina di batterio ad alta concentrazione di colore giallognolo che infettata da lambda ha

generato delle aree di placca.

Un batterio è stato infettato da lambda, ha riconosciuto il prodotto ed è andato ad infettare una colonia

accanto, quindi dove c’è l’area di placca c’è un lambda che sta crescendo, più una particolare tipologia.

Si tocca con uno stuzzicadenti questa area di placca, la inserisco in una beuta dove c’è un altro E-Coli

vergine e faccio fare altre ricombinazioni ecc..., cresco milioni di lambda che daranno milioni di DNA.

Un esperimento fatto nel 1952 ha dimostrato che utilizzando un batteriofago possiamo far avvenire la

ricombinazione nel genoma ospite coinfettando con 2 T2, (uno che può infettare solo un ceppo 1 e un altro

che può infettare entrambi i ceppi 1-2 di Coli). La coinfezione ha dimostrato che questi due ceppi sono stati

ricombinati all’interno di un batterio e si è quindi generato un nuovo ceppo di batteriofago che aveva la

resistenza ad entrambi.

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Esiste una terminologia in microbiologia detta ‘fare trasduzione Generalizzata’ e comporta essenzialmente

da un lato l’utilizzo del batterio e dall'altro del fago; il batterio può replicarsi utilizzando il genoma del fago

oppure il batterio prende il genoma del fago integrandolo nel plasmide che è presente nel batterio stesso

(generalizzando integrandolo nel cromosoma batterico stesso). Quindi quando si parla di trasduzione

generalizzata si intende tutti i meccanismi di interazione fago-batterio come il passaggio del genoma da

batterio-fago o il passaggio di genoma fago-batterio attraverso il plasmide (genoma batterico). Se si marca

il DNA del fago con un particolare isotopo si può poi seguire alla trasduzione generalizzata. Si può notare

che il DNA va dal plasmide al cromosoma e dal cromosoma al batteriofago, oppure che ritorna ricombinato.

Nel 1928 un laboratorio del professor Griffiths ha condotto un esperimento su un batterio che genera la

Polmonite (streptococcus pneumoniae). Questo esperimento è stato molto interessante perché combinava

microbiologia con studi critici negli animali e in particolare nei topi. La tipologia di esperimento prevedeva

un laboratorio che era in grado di verificare la tipologia di batterio e l'evento danno nel topo. Streptococco

ha due diversi fenotipi: uno di tipo S (smooth= membrana liscia), un altro di tipo R (rough= membrana

rugosa). Quando il primo viene iniettato nel peritoneo dei topi si genera un trofismo diretto ai polmoni

causando la polmonite e la morte del topo. Quando il secondo viene iniettato negli stessi topi questi

sopravvivono. Quindi il fenotipo dello streptococco può dare un evento letale o l'evento vita in funzione del

tipo di membrana che ha(liscia=muore/rugosa=vive). L’esperimento era basato su cos'era la sostanza che

dava la morte.

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Dopo aver ucciso il batterio, distruggendolo a 65 gradi, lo iniettano nei topi e notano che i topi continuano

a vivere, per cui era stato distrutto qualcosa nel batterio. Hanno provato quindi a mettere in coniugazione i

due ceppi (mettendo vicino i batteri morti degradati al calore morti con quelli di tipo R). Il risultato furono

topi morti. Questo risultato aprì delle ipotesi tra le quali la più importante era che ci fosse qualcosa che

passasse da questo batterio morto al batterio R e generava quindi letalità. E’ stato poi prelevato il siero dai

polmoni dei topi morti ed è stato inoculato in beute per farlo crescere e piastrare su piastre agar e infine

essere osservato al microscopio. È stato notato che i batteri di tipo R avevano cambiato la membrana in

una consistente simile a quella dei ceppi S.

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Quindi la conversione del fenotipo era un evento stranissimo. Per questo loro utilizzavano molto la

microbiologia e il microscopio per distinguere i due genomi fenotipicamente. Questo qualcosa che

convertiva i ceppi R in S fu scoperto nel 1943 da un team formato da Avery Macleod e Mccarty.

Loro presero questi pneumococchi morti e li trattarono con enzimi che tagliano via gli zuccheri delle

proteine. Dopo averli accoppiati al Ceppo R, li inoculavano nei topi. Da qui notarono che i topi morivano

dando lo stesso risultato. Presero poi il siero dai polmoni e notarono che i streptococchi erano di tipo S.

Riprovarono con enzimi che tagliano via i lipidi da un lato e degradano l’RNA Messaggero dall’altro, ma

notarono sempre lo stesso risultato. A questo punto provarono con una nuova sostanza che era stata

appena isolata chiamata DNAasi che tagliava i ponti fosfodiesterici e notarono che i topi sopravvivevano.

Isolando da questi polmoni i pneumococchi notano che erano di tipo R quindi dimostrarono che questo

qualcosa che era passato nei batteri di tipo R era DNA e si era integrato nel genoma dello pneumococco.

Questo esperimento è stato importante perché ci dice che quello che si eredita è DNA e non proteina.

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Un altro importante esperimento è stato quello di Hershey e Chase negli anni ‘50 che hanno studiato il

batteriofago T2. Questo batteriofago(virus) ha la capacità di infettare la cellula batterica e integrarsi

convivendo col genoma del batterio.

L'esperimento è stato molto semplice per cui gli scienziati si sono chiesti se il materiale che il batteriofago

dà al batterio per essere resistente a quel determinato substrato è un materiale legato alle sue proteine

oppure è un materiale legato al suo DNA.

Se io marco il batteriofago ossia lo faccio crescere in una sostanza liquida che contiene zolfo-35 che per

definizione va a marcare tutte le proteine, gli aminoacidi da loro costituiti diventano con zolfo -35 e se la

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beuta non ha altro zolfo il fago per sopravvivere acquisisce quell’isotopo, poi infetto l’E. Coli e stacco i fagi

che sono ancora legati alla membrana e vado a misurare nel batterio che isotopo trovo.

Con questo esperimento differenziale da un lato con lo zolfo dall’altro col fosforo (sapendo che il fosforo

va a legarsi al DNA perché fa parte di questo) misuro l’isotopo e capisco cosa si è integrato. Il risultato è

stato che i batteri erano tutti fosforo-32 positivi ma non erano zolfo-35 positivi. In questo esperimento

della trasformazione batteriofago-batterio, chiamata trasduzione, notiamo che quello che si passa non è

protei