Tesi, Esplorazione strutturale di RNA a sequenza casuale: implicazioni per l’origine della vita

ESPLORAZIONE STRUTTURALE DI RNA A SEQUENZA CASUALE:

IMPLICAZIONI PER L’ORIGINE DELLA VITA

RELATORE: CANDIDATO:

Dott. Cristiano Chiarabelli Nancy Tomassetti

CO-RELATORE: Matricola 444881

Prof. Pier Luigi Luisi ANNO ACCADEMICO 2012/2013 A me stessa per avercela fatta

ed alla gioia della mia vita:

Beatrice.

Indice 1

1.Introduzione

1.1 L’origine della terra 2

1.2 L’ambiente primitivo 3

6

1.3 Il mondo ad RNA 7

1.3.1 I ribozimi 8

1.4 La struttura del RNA 11

1.5 Foster assay 14

1.5.1 Ottimizzazione del Foster assay 14

1.6 Costruzione della libreria plasmidica 16

1.7 Studi sulla stabilità dei singoli NB-RNA 17

1.8 Selezione in vitro per stabilità termica delle librerie dei NB-RNAs 19

2.Scopo della tesi 21

3.Materiali e metodi 30

4.Risultati 32

4.1 Controllo della selezione delle sequenze in assenza di S1 34

4.1.1 Ciclo di selezione a 30°C 36

4.1.2 Ciclo di selezione a 50°C 38

4.1.3 Ciclo di selezione a 70°C 40

4.1.4 Ciclo di selezione a 90°C

4.2 Selezione di “quasi specie” ad alte temperature 42

44

4.2.1 Primo ciclo di selezione a 50°C 46

4.2.2 Secondo ciclo di selezione a 50°C 47

4.2.3 Terzo ciclo di selezione a 50°C 49

4.3 Selezione di sequenze di RNA con ciclo Foster di 24 ore 50

5.Conclusioni 52

Bibliografia

1. Introduzione

Non esiste a oggi una definizione di vita accettata da tutta la comunità scientifica. La maggior parte

degli scienziati che lavorano su questo problema concorda che la vita possa essere considerata come

“l’insieme delle caratteristiche e delle funzioni che devono essere possedute da un sistema per

essere chiamato vivo”. Tuttavia, le specificità di queste funzioni rimangono indefinite (Luisi, 1998).

Dal momento che non esiste una definizione indiscutibile della vita è anche difficile definire

l’origine della vita stessa.

Già nell’antichità la vita veniva vista come materia, basti pensare ai grandi filosofi greci, i quali

ritenevano che la vita nascesse in modo spontaneo dagli elementi naturali inanimati grazie

all’effetto dei “flussi vitali”. Fino alla metà del XVII secolo vi era il convincimento che Dio avesse

creato l’uomo e gli altri organismi superiori, mentre gli anfibi, gli insetti o comunque gli animali di

piccole dimensioni si fossero generati dal fango o da sostanze in decomposizione. Aristotele

raccolse le teorie della “generazione spontanea” formulate dai filosofi che lo precedettero e le

sintetizzò in una teoria i cui effetti si sono fatti sentire fino a tempi molto recenti. Secondo lui gli

organismi viventi nascono da altri organismi a loro simili, ma a volte possono scaturire anche dalla

materia inerte. Esisterebbe in tutte le cose un “principio passivo” rappresentato dalla materia ed un

“principio attivo” rappresentato dalla forma, questi due principi sarebbero le basi dell’origine della

vita. La teoria della generazione spontanea passò indenne attraverso il medioevo ed il rinascimento

e venne sostenuta da grandi scienziati come Newton, Cartesio e Bacone. Nel XVII secolo iniziarono

le prime sperimentazioni che misero in ginocchio quelle che fino ad allora erano le basi sull’origine

della vita. Dapprima il medico fiammingo B. Van Helmont e successivamente Francesco Redi

misero in moto studi per avvalorare e screditare la teoria della generazione spontanea. Col passare

degli anni la teoria fu progressivamente abbandonata anche se con la nascita ed il perfezionamento

del microscopio vi fu una ripresa di questa, poiché si scoprirono altre forme di vita, prima

sconosciute, come i batteri, i funghi ed alcuni protozoi. Un impatto significativo su questi studi fu

naturalista di tutti i tempi Charles Darwin. La sua teoria dell’evoluzione,

suggerito dal più grande

formulata nel XIX secolo, sostiene che tutti gli organismi viventi potrebbero aver avuto origine da

pochi se non da un singolo antenato comune. Secondo Darwin il processo di selezione naturale

avrebbe creato nuovi organismi capaci di adattarsi ad un ambiente mutevole. Con il consolidamento

1

di questa teoria ed anche grazie al lavoro realizzato da Pascal e da Spallanzani, la teoria

dell’abiogenesi fu abbandonata a favore della teoria della biogenesi, nella quale è la vita che genera

nuova vita. Nonostante questa “brillante” tesi sulla selezione naturale, nessuno si chiese, o meglio

nessuno rispose, al punto cruciale sul quale ci si interrogava da anni, ovvero chi abbia creato il

primo essere vivente che avrebbe generato a sua volta gli altri esseri viventi.

L’origine della

1.1 terra

E’ ormai accertato che la terra ha un’età di circa 4,6 miliardi di anni. I più antichi strati sedimentari,

hanno un’età di circa 3,5 miliardi di anni,

che portano le testimonianze di forme di vita primitive,

per cui si crede che la vita debba essere comparsa sulla terra in questo intervallo di tempo di cui non

vi sono testimonianze. Per comprendere come la vita abbia potuto avere origine dalla materia

inorganica bisogna individuare quali fossero le condizioni ambientali sulla superficie terrestre

dell’epoca. Il sistema solare ha avuto origine dal collasso di una nebula di gas e polveri circa 4,6

miliardi di anni fa e sembra che questo collasso gravitazionale sia durato circa un milione di anni,

tanto da innescare nel sole una reazione termonucleare che ha generato un intenso vento solare,

costituito principalmente da protoni ed elettroni. Questo vento solare disperse sia il vapore che i gas

residui della nebula che ancora avvolgevano la terra, in questo modo il nostro pianeta rimase senza

atmosfera. La terra dopo aver attratto a se comete e corpi vaganti di notevole dimensione iniziò a

raffreddarsi lentamente, scendendo al di sotto del punto di ebollizione dell’acqua, la quale iniziò a

condensare. La condensazione dell’acqua ha dato origine ad un oceano primitivo che ha permesso

l’inizio del ciclo dell’acqua e l’abbassamento della temperatura del pianeta, che si è mantenuta

stabile fino ai giorni nostri. Studi recenti effettuati su antichissimi cristalli di zircone, i più antichi

solidi terrestri tuttora conosciuti, suggeriscono che l’acqua liquida possa aver fatto la sua comparsa

intorno a 4,4 miliardi di anni fa (Wilde et al., 2001; Mojzsis, 2001), rendendo finalmente possibile

lo sviluppo della vita sulla terra. I primi microfossili furono recuperati nei sedimenti di Apex in

Australia (Schopf, 1993) e furono datati 3,5 miliardi di anni fa, molto probabilmente in seguito alla

stabilizzazione degli oceani e dei continenti. 2

L’ambiente primitivo

1.2

Non esiste un generale accordo sulla composizione dell’atmosfera primitiva, ci sono teorie che

parlano di un’atmosfera “riducente” costituita da Metano (CH ), Ammoniaca (NH ), Acqua (H O)

4 3 2

e di un’atmosfera “neutra” composta da Azoto (N

ed Idrogeno (H ) ), Ossido di Carbonio (CO),

2 2 L’unico aspetto sul quale

Biossido di Carbonio (CO ) di origine vulcanica e Vapore Acqueo (H O).

2 2

entrambe le teorie concordano è che non fosse presente O libero (Lazcano and Miller, 1996),

2

l’Ozono (O

tantomeno ), la cui assenza permetteva ai raggi ultravioletti del sole di raggiungere la

3

superficie del pianeta in quantità molto più elevata rispetto ad oggi e, grazie alla loro energia, di

formare composti primitivi. l’atmosfera primitiva fosse di tipo “riducente” e che da queste

Nel 1929 Haldane ipotizzò che

sostanze attraverso apporti di energia si sarebbero formate le sostanze fondamentali per l’origine

della vita [Figura 1.1].

Figura 1.1 Evoluzione molecolare. Da alcune reazioni chimiche di sintesi tra acqua, metano e ammoniaca

si sarebbero generati i primi composti organici, dai quali sarebbero derivati composti chimici ancora più

complessi ( www.luciopesce.net ). pioggia e dai fiumi si sarebbero raccolte in un “oceano primitivo”,

Queste sostanze trasportate dalla

dove reagendo avrebbero formato molecole complesse dando origine ad un “brodo caldo diluito” e

3

qui avrebbero avuto origine i primi organismi. Lo stesso concetto venne formulato molto tempo

prima da Darwin, il quale in una lettera ad un suo amico scriveva:

“Si dice spesso che esistono oggi tutte le condizioni per la prima formazione di un organismo

vivente, condizioni che potevano essere state presenti anche in passato. Se (ma quale grosso "se"!)

si potesse immaginare che in qualche piccolo stagno caldo, con ogni sorta di sali ammoniacali e

fosforici, luce, calore, elettricità, ecc., si fosse potuto formare chimicamente un composto proteico

pronto a subire trasformazioni anche più complesse, oggi tale materia sarebbe subito divorata o

assorbita, cosa che non sarebbe invece avvenuta prima della formazione degli esseri viventi”

(Darwin, 1888).

Qualche anno dopo queste parole di Darwin il ricercatore sovietico Aleksandr Ivanovic Oparin

avanzò le stesse idee di Haldane (Oparin, 1924). Oparin e Haldane erano entrambi di formazione

atea e quindi, lontani da condizionamenti e pregiudizi di carattere religioso; affrontarono il

problema relativo all’origine della vita da un punto di vista prettamente materialistico. Oparin al

contrario di Haldane ipotizzava sì un’atmosfera primitiva a carattere fortemente “riducente”

composta da Idrogeno, Vapore Acqueo, Metano, Azoto ed Ammoniaca, ma non credeva

nell’esistenza dell’Anidride Carbonica. In tale atmosfera le scariche elettriche dei fulmini e le

radiazioni ultraviolette solari avrebbero provocato la sintesi di semplici composti organici fra cui

aminoacidi, purine e pirimidine che disperdendosi negli oceani avrebbero formato il cosiddetto

“brodo primordiale”, nel quale si sarebbero formati casualmente acidi nucleici e proteine. Le idee

diffuse da Haldane ed Oparin furono il punto di partenza di vari esperimenti che ricercavano

l’origine della vita. Il più importante di questi fu l’esperimento commissionato dal professore

L’esperimento

americano Harold Clayton Urey al ricercatore Stanley Miller tra il 1952-1953.

voleva dimostrare l’ipotesi del “brodo primordiale” (Miller, 1953). Per fare questo Miller costruì un

apparecchio composto da due ampolle di vetro riempite rispettivamente di acqua tenuta ad alte

temperature (che mimava l’oceano ancestrale) e di una miscela di Idrogeno, Ammoniaca e Metano

[Figura 1.2]. 4

Figura 1.2 L’esperimento di Miller. Miller costruì un apparecchio composto da due ampolle di vetro

riempite rispettivamente di acqua tenuta ad alte temperature (che mimava l’oceano ancestrale) e di una

Il vapore prodotto dall’acqua veniva fatto convogliare nel

misc