Appunti degli studenti per corsi ed esami del Prof. Luisi Pierluigi

Tesi, Esplorazione strutturale di RNA a sequenza casuale: implicazioni per l’origine della vita. Il Mondo a RNA è una delle ipotesi nell’ambito dell’origine della vita, nata dal bisogno di rispondere al problema di come le molecole biologiche potessero essere implicate nella nascita dei primi organismi viventi. Questa teoria si basa sul fatto che l’RNA è una molecola che può aver giocato un ruolo chiave nell’origine della vita. L’idea del mondo a RNA è basata sulla comparsa di molecole di RNA nel brodo primordiale con due funzioni importantissime: contenere l’informazione genetica e svolgere la funzione di enzimi catalizzando la loro stessa sintesi. Nonostante i recenti progressi fatti in questo campo, alcune domande fondamentali rimangono senza risposta: può un RNA aver catalizzato le reazioni necessarie per l’auto-replicazione sulla terra primordiale? Possono gli RNA aver partecipato alla nascita sia alle proteine che agli acidi nucleici? Per risolvere questi interrogativi nel corso degli anni sono stati affrontati diversi studi teorici e pratici per cercare di ricreare un mondo ad RNA in laboratorio. In questo quadro si inserisce il progetto "Never Born Biopolymers" (NBBs) e in particolare il progetto "Never Born RNAs" (NB-RNAs), che ha come obiettivo l’esplorazione dello spazio delle sequenze alla ricerca di RNA strutturati con proprietà biologiche. Questo progetto nasce dalla constatazione che le molecole di RNA esistenti sono solo una piccola parte di quelle teoricamente possibili. Conoscendo lo stretto rapporto che esiste nelle molecole biologiche tra struttura e funzione si è deciso di esplorare lo spazio delle possibili sequenze in cerca di molecole di RNA casuali con un fold stabile anche ad alte temperature. Per effettuare tale ricerca si è utilizzato un saggio sperimentale denominato RNA Foster Assay (RNA folding stability test). Questo saggio utilizza la nucleasi S1, un enzima specifico per single strand, ovvero una nucleasi che taglia regioni a singolo filamento, in associazione con temperature di incubazione crescenti. Gli RNA ripiegati sono molto più resistenti di quelli che non lo sono e questi ultimi vengono degradati più velocemente. La nucleasi S1 è stata scelta perché ha la capacità di funzionare in un ampio intervallo di temperature e questo ha permesso di controllare la stabilità delle molecole di RNA, questo perché un aumento della temperatura destabilizza il fold inducendo un’apertura delle strutture a doppio filamento in ambito locale e/o globale, di conseguenza gli RNA diventano suscettibili all’attacco della nucleasi. Partendo da questi principi ho suddiviso il progetto in tre parti: la prima è la dimostrazione che in un esperimento precedente effettuato nel 2011 dal Dott. Anella la selezione delle sequenze di RNA è avvenuta grazie alla nucleasi S1 e non semplicemente a causa dei passaggi di clonaggio. Nella seconda parte della mia ricerca ho verificato se fosse o meno possibile ottenere una famiglia di sequenze simili, cioè una quasi specie, resistenti ad alte temperature, che avessero la stessa struttura, in modo da confermare la ridondanza delle strutture rispetto le sequenze. Infine ho voluto osservare se fosse possibile selezionare in vitro sequenze diverse da quelle trovate precedentemente, ma partendo da due librerie diverse: la libreria complessa originale di partenza prodotta per effettuare le selezioni e la libreria selezionata a 50°C durante gli step di selezione.