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LABORATORIO MICROBIOLOGIA APPLICATA: ALIMENTI FERMENTATI
Introduzione
In data 05\03\21 sono state fatte analisi microbiologiche su alimenti fermentati. Gli alimenti fermentati comprendono sia quelli solidi sia le bevande che vengono fermentati dall'azione di alcuni gruppi microbici (principalmente batteri lattici e lieviti). Di conseguenza, i carboidrati dell'alimento vengono demoliti e trasformati in composti differenti (come aldeidi, alcoli, esteri, CO2). Questo porta a un cambiamento del prodotto, sia in termini di conservazione, sia per la sua struttura (texture), sia per le caratteristiche sensoriali.
In questo rapporto tecnico scientifico vengono riportate le analisi per uno yogurt.
Per analizzare l'alimento sono state prese come riferimento:
- la norma ISO 8261 per il campionamento
- la norma ISO 707 per la quantificazione di Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus e Streptococcus thermophilus
- la norma ISO 29981 per la quantificazione di bifidobatteri in prodotti
- derivati dal latte
- la norma ISO 20128 per la quantificazione di Lactobacillus acidophilus
Materiali e metodi:
- Grana Padano stagionato 10 mesi senza crosta acquistato pretagliato all'interno di vaschette di plastica. Preincartato il: 03/03/21. Da consumarsi entro il: 18/03/21
- bilancia tecnica
- diluente: sodio citrato e sale triptone
- becco bunsen con fiamma ossidante per lavorare in sterilità
- bagnetto termostatato
- omogeneizzatore peristaltico stomacher
- sacchetti stomacher monouso sterili
- vortex
- provette in vetro e tappi
- strumenti sterili
- pipette monouso sterili
- propipette
Come prima cosa siglare le provette con le diluizioni corrispondenti: -1; -2;
Prelevare 10 g di Grana Padano in un sacchetto stomacher, aggiungere 90 mL di sodio citrato al 2% preriscaldato a 45°C in bagnetto termostatato e poi omogeneizzato in stomacher per 2 minuti. Il sodio citrato si usa per solubilizzare le caseine, le diluizioni successive vengono fatte utilizzando
Il sale triptone. Trasferire la sospensione nella provetta -1 e allestire la diluizione decimale successiva utilizzando 1 mL di sospensione e 9 mL di sale triptone. Infine siglare 2 piastre petri contenenti terreno HHD e 2 con RBC con: nome, alimento, diluizioni -1 e -2 e nome del terreno. Conta di batteri lattici omofermentanti ed eterofermentanti.
Scopo: Discriminare i batteri lattici omofermentanti da quelli eterofermentanti all'interno del Grana Padano. Ci aspettiamo la presenza di Lactobacillus helveticus ed Lactobacillus fermentum, rispettivamente omofermentante ed eterofermentante.
Materiali e metodi:
- pipette
- propipette
- spatole sterili
- piastre petri con il terreno HHD solidificato. (Biolife) è un terreno differenziale per distinguere gli omofermentanti dagli eterofermentanti. Contiene un indicatore di pH: il verde di bromocresolo che a pH inferiore a 3,8 vira verso il giallo/verde, superiore a 5,5 resta blu. Gli omofermentanti producono principalmente acido
Spatolamento superficiale
Come prima cosa siglare le piastre con: nome e cognome, campione e tipo di terreno.
Porre 100 µL di sospensione -2 e -1, nel seguente ordine in modo da non dover cambiare lapipetta, sulle piastre corrispondenti. Spatolare la sospensione su tutta la superficie dellapiastra, anche sui bordi, finchè tutto il liquido sarà assorbito dal terreno e si sentirà attrito.
Incubare capovolgendo le piastre a 30°C in anaerobiosi per 72h.
Per creare l’anaerobiosi si utilizzano delle giare all’interno della quali si inseriscono dellestrisce che contengono sali di ferro. Le strisce vengono bagnate in modo da catalizzare lareazione di ossidazione del ferro utilizzando l’ossigeno che viene ridotto ad anidridecarbonica.
ContaSegue la
fotografia del risultato:La prima cosa che si può osservare è che sono cresciute numerose colonie, il che era prevedibile dato che questi microrganismi sono importanti al fine di impartire le caratteristiche tipiche del Grana Padano. Inoltre il terreno ha virato a colore verde, questo è indice della presenza di batteri lattici omofermentanti i quali con il loro metabolismo causano maggiore acidificazione, in quanto producono esclusivamente acido lattico. Grazie al terreno utilizzato si possono contare in modo differenziato i batteri omofermentanti (colonie di colore blu o verde scuro con o senza alone) e quelli eterofermentanti (colonie bianche o trasparenti, generalmente più piccole). Sono state contate 274 UFC/piastra di omofermentanti e 24 UFC/piastra di eterofermentanti nella diluizione -2, l'unica contabile. La formula da utilizzare è: N = Σ C / V × n × d Per avere il risultato del numero di omofermentanti ed eterofermentanti la
Conta di lieviti e muffe
Scopo
Questa analisi ha lo scopo di determinare la presenza di lieviti e muffe nel Grana Padano. Si considerano questi microrganismi dei contaminanti, in quanto il formaggio in questione non è erborinato.
Materiali e metodi:
- pipette monouso sterili
- propipette
- spatole sterili
- 2 piastre petri contenenti terreno RBC (Condalab, brand Pronadisa)
La presenza del cloramfenicolo evita la crescita della maggior parte di microrganismi contaminanti. Il colorante rosa bengala limita lo sviluppo di muffe a crescita rapida, le quali potrebbero creare dei problemi per la conta di quelle a crescita più lenta.
Il cloramfenicolo è un antibiotico si lega alla subunità 50S ribosomiale bloccando il meccanismo di traduzione dell'RNA messaggero. In questo modo inibisce la sintesi proteica dei batteri Gram + e Gram -, per alcuni microrganismi ha attività batteriostatica per altri battericida.
Semina per
spatolamentoPorre 100 µL di sospensione -2 e -1, nel seguente ordine in modo da non dover cambiare lapipetta, sulle piastre corrispondenti. Spatolare la sospensione su tutta la superficie dellapiastra, anche sui bordi, finchè tutto il liquido sarà assorbito dal terreno e si sentirà attrito.
Incubare in anaerobiosi a 25°C per 5 giorni controllando le piastre dal secondo giorno in poi.
ContaSegue la fotografia del risultato:
Sono state contate 24 UFC/piastra sulla diluizione -2, l’unica contabile.
La formula da utilizzare è: N = Σ C / V × n × d
Risultati
Batteri lattici: è stata calcolata la media aritmetica tra le UFC contate in 3 replicati delladiluizione -2 -2 5
N = Σ C / V × n × d = (223+260+298) / (0,1 * 3 * 1*10 ) = 2,6 *10 UFC/g
Batteri lattici omofermentanti ed eterofermentanti: mediante l’utilizzo della formula per unasola diluizione contabile è possibile calcolare in modo discriminante
Il valore di UFC per i due batteri. Il calcolo non è stato effettuato in classe
N = UFC * d2
N eterofermentanti = 24 * 10 = 2,4*10 UFC/g2
N omofermentanti = 254 * 10 = 2,54 * 10 UFC/g
Lieviti e muffe: è stata calcolata la media aritmetica tra le UFC contate in 3 replicati della diluizione -2
N = Σ C / V × n × d = (70+91+124) / (0,1*3*1*10 ) = 9,5*10 UFC/g
Discussione e conclusioni
Come ultima cosa sono stati confrontati i dati ottenuti attraverso i calcoli con le "linee guida per l'analisi del rischio nel campo della microbiologia degli alimenti", progetto regionale "analisi del rischio microbiologico legato al consumo di alimenti finalizzato alla riduzione dei costi analitici", approvato con Determinazione della Direzione Sanità della Regione Piemonte n.780 del 18 ottobre 2011. In particolare ci siamo riferiti alla tabella 10.7 destinata a formaggi a base di latte o siero di latte crudo o sottoposto a trattamento termico
inferiore allapastorizzazione, in quanto secondo il disciplinare di produzione del Grana Padano DOP illatte non deve subire alcun trattamento termico.
I limiti di nostro interesse sono
Si può concludere che il campione supera di 10 volte il limite previsto per le muffe, ma non èprevisto un valore potenzialmente dannoso per questo parametro.
Il risultato della conta dei fermenti lattici, inoltre, risulta con lo stesso ordine di grandezza diquello ottenuto dalla conta di batteri lattici totali su terreno MRS. Questo è positivo in quantoentrambi i terreni permettono la crescita di fermenti lattici.
LABORATORIO MICROBIOLOGIA APPLICATA:ALIMENTI FRESCHI
Introduzione
In data 08/01/21 sono state fatte analisi microbiologiche su alimenti freschi, nello specifico inquesto rapporto tecnico scientifico vengono riportate le analisi per un pacchetto di insalatache rientra nella categoria dei vegetali di IV gamma. I prodotti di quarta gamma sono traquelli destinati dal produttore al
consumo umano diretto, senza che sia necessaria la cottura o altro trattamento per eliminare o ridurre a un livello accettabile i microrganismi presenti (Reg. CE 2073/2005). La destinazione al consumo diretto, senza cottura, rendono pertanto sicurezza e igiene un requisito qualitativo essenziale dei prodotti di quarta gamma. Gli alimenti freschi sono quelli che non hanno subito trattamenti di conservazione che dopo raccolta o cattura o macellazione o preparazione/confezionamento sono stati mantenuti refrigerati e che hanno conservazione limitata. Per analizzare l'alimento sono state prese a riferimento: - la norma ISO 4833 per la conta della carica batterica totale - la norma ISO 16649 per la quantificazione di Escherichia coli β-glucuronidasipositivi - la norma ISO 15214 per la quantificazione dei batteri lattici. Scopo: Le analisi sono state effettuate allo scopo di quantificare la carica batterica totale e verificare la presenza di Escherichia coli, indicatore principale di sicurezza e igiene per il consumo diretto.rietà. Mettere i 10 g di insalata nel sacchetto stomacher monouso sterile e aggiungere 90 ml di diluente sterile sale peptone. Chiudere il sacchetto e omogeneizzare per 2 minuti nel peristaltico stomacher. Prelevare 1 ml della diluizione ottenuta e trasferirlo nella provetta siglata -1. Agitare la provetta per 10 secondi per omogeneizzare la diluizione. Ripetere l'operazione per le diluizioni -2, -3, -4 e -5. Semina in piastre petri sterilePrelevare 1 ml dalla diluizione -1 e versarlo sulla prima piastra petri vuota. Distribuire uniformemente il campione sulla superficie della piastra inclinandola leggermente. Ripetere l'operazione per le diluizioni -2, -3, -4 e -5, utilizzando una piastra petri vuota per ogni diluizione. Incubazione delle piastre petriLe piastre petri vanno incubate a 37°C per 24-48 ore. Conteggio delle colonieDopo l'incubazione, contare le colonie presenti su ogni piastra petri e registrare i risultati. Calcolo della contaminazione fecaleCalcolare la contaminazione fecale esprimendo il numero di colonie presenti sulla piastra petri della diluizione -1 come UFC/g di insalata. Discussione dei risultatiDiscutere i risultati ottenuti e confrontarli con i limiti di accettabilità stabiliti dalle normative vigenti.
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