Report laboratorio Microbiologia applicata

Attività 3: batteri lattici

Scopo

I batteri lattici sono microorganismi Gram +, anerobi ossigeno tolleranti, asporigeni, catalasi negativi, con metabolismo fermentativo, produzione primaria di acido lattico e molto esigenti dal punto di vista nutrizionale. Pertanto, il terreno utilizzato (MRS) è caratterizzato dalla presenza di diversi fattori di crescita, per esempio estratto di carne, estratto di lievito, magnesio e manganese (quest'ultimo importante nei meccanismi di difesa contro le specie reattive dell'ossigeno). Il terreno, inoltre, è caratterizzato dalla presenza di agenti tamponanti (potassio fosfato, sodio acetato, diammonio citrato) poiché durante la loro crescita l'abbassamento del pH può dare fastidio alle stesse cellule. È presente anche un tensioattivo che aiuta le cellule a resistere agli stress e favorisce l'ingresso dei nutrienti nel citoplasma. I batteri lattici Lactobacillus, Lactococcus,

Streptococcus, comprendono tanti generi diversi: Leuconostoc, Weissella, Oenococcus, Pediococcus, Carnobacterium, Enterococcus.

Materiali e metodi

Serviranno:

• terreno MRS (Scharlau);
• pipette e pro-pipette;
• bagnetto termostato;
• kit per anaerobiosi. De Man Rogosa

Effettuare una semina per incorporamento su MRS (Sharpe agar, di cui si ha una foto a fianco) senza overlay. Vengono utilizzate tre piastre Petri, in cui si pongono le diluizioni -1, -2 e -3 nella quantità sempre di un 1 mL ciascuna. Il terreno, proveniente dal bagnetto termostatato, viene fatto raffreddare un poco e viene versato sopra ciascuna delle tre piastre in strato sottile. Incubazione a 30°C per 72h in condizioni di anaerobiosi; si determinano i batteri lattici mesofili. L'anaerobiosi durante l'incubazione si ricrea utilizzando delle giare, in cui si pongono le piastre capovolte. All'interno delle giare si inseriscono delle strisce di un kit apposito che ricrea l'anaerobiosi. Il kit contiene

sali diferro; le strisce vengono bagnate per catalizzare la reazione in cui il ferro passa da +2a +3 (si ossida) utilizzando l'ossigeno, che viene ridotto a CO2. Il kit elimina l'ossigeno all'interno della giara e sviluppa CO2.

Risultati

Dopo l'incubazione contare tutte le colonie cresciute. Le piastre contabili sono state quelle con diluizioni -3 (18 UFC/piastra) e -2 (57 UFC/piastra). La formula per il calcolo del risultato finale è la formula per due diluizioni decimali successive contabili e nessun replicato poiché gli altri risultati erano riferiti a diluizioni differenti:

C 18+57 75 UFC∑ 3= = =6,82×10N= V ×1,1 ×d 0,011 g−21× 1,1×10

Discussione e conclusioni

Dopo aver effettuato i calcoli, i risultati sono stati confrontati con alcuni valori presi come riferimento, proposti da un documento della regione Piemonte per la categoria merceologica corrispondente all'insalata mista in busta: UFC5

7−55 ×10 × 10• CBT mesofili: gUFC2 3−1010Escherichia coli:• g UFC5 6−55 ×10 × 10• Batteri lattici (MRS): gPertanto, possiamo concludere che il nostro campione iniziale è ampiamenteEscherichia colicompreso nel range per e per i batteri lattici. Si avvicina di molto,invece, al limite superiore per quanto riguarda la carica batterica mesofili.Quest’ultimo risultato può essere spiegato dal fatto che la busta di insalata è stataaperta il giorno precedente lo svolgimento della mia attività.ANALISI MICROBIOLOGICHE SU ALIMENTI FERMENTATIScopoNell’ultimo turno di laboratorio di microbiologia alimentare ho potuto analizzare lacarica microbiologica di una serie di alimenti fermentati. Con alimenti fermentati siintendono sia alimenti solidi che bevande fermentate da specifici gruppi microbici,solitamente batteri lattici e lieviti. I carboidrati presenti nella matrice di partenzavengono demoliti e

trasformati in altri composti con conseguenti cambiamenti nella conservazione del prodotto (abbassamento pH), nella texture e nelle caratteristiche sensoriali.

Lactobacillus delbrueckii

Io ho lavorato con latte di kefir, determinando i batteri lattici Bulgaricus Streptococcus Thermophilus.subsp. e Le analisi svolte pongono l'attenzione sulla determinazione della carica vitale di questi due microrganismi di importante valenza tecnologica, i cui limiti minimi fanno riferimenti ai seguenti regolamenti:

• Circolare del ministero della sanità N.2 del 4/1/1971;
• Circolare del ministero della sanità N.9 del 3/2/1986;
• D.P.R. N.54 del 14/1/1997;
• Norma UNI N. 59.09 100.0.

Di cui viene portato un estratto:

Devono inoltre essere rispettati i criteri sanitari legati all'igiene presentati dal regolamento C.E. n. 2073/2005, con ultimo aggiornamento nel 2020, del quale si riporta sotto il riferimento al prodotto sottoposto ad analisi:

Le norme applicative di natura generica su

cui si basa invece il processo applicativo sono invece le seguenti:

• ISO 6887, che riguarda le metodiche di diluizione per l'analisi microbiologica dei substrati alimentari;
• ISO 7218, che tratta le linee guida generali e i requisiti per le analisi microbiologiche su substrati alimentari;
• ISO 11133, trattante i metodi di preparazione, produzione, stoccaggio e test di performance dei terreni di coltura;
• ISO 9232: 2003 [IDF 146: 2003], riguardante lo yogurt, con l'identificazione dei microrganismi caratteristici (Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus e Streptococcus thermophilus).

Materiali e metodi

Per questa fase preliminare serviranno:

• Autoclave per sterilizzare ad umido o stufa per sterilizzazione a secco;
• Termostato in grado di capace di mantenere il terreno inoculato alle temperature sopra riportate;
• Provette, beute o bottiglie con tappo a vite adatte alla sterilizzazione e alla conservazione dei terreni di coltura e l'eventuale incubazione dei terreni.

• liquidi;
• Piastre Petri sterili;
• Anse e spatole ad L;
• Materiali sterili per prelevare il substrato (pinzette e cucchiai monouso);
• Pipette graduate a svuotamento totale, graduate, con suddivisione da 0,1 ml e capacità da 2 ml (si predilige l'uso di pipette in plastica sterile monouso ma in alternativa si possono utilizzare pipette in vetro opportunamente sterilizzate a fiamma). Le pipette devono essere dotate di pro pipette adeguate o, in alternativa, si può usufruire di micro pipetta (opportunamente tarata) a puntale monouso;
• pHmetro per il rispetto delle condizione di pH nella produzione del terreno;
• Bagnomaria per la produzione del terreno;
• Dispositivi di protezione individuale per l'operatore (guanti, camice e occhiali);
• Cappa a flusso laminare o fiamma a bunsen per mantenere le condizione di sterilità operativa;
• Omogeneizzare meccanico del substrato (Stomacher);
• Bag adeguata allo Stomacher;
• Soluzione diluente per il substrato.

( acqua con NaCl 9%);

 Vortex per omogeneizzare le eventuali diluizioni decimali;

 Giara da anaerobiosi con relativo gaspak;

 Prodotto preso in esame: “Latte di Kefir senza lattosio alla frutta. Latte vaccino fermentato senza lattosio (inferiore a 0,1g per 100g) alla frutta arricchito con vitamina B6 e rame. Senza lieviti.” (di cui si riporta sotto una fotografia dimostrativa).

I terreni di coltura che ho utilizzati per queste attività sono stati due:

- MRS pH 5,7;

- M17 Agar.

In ordine verranno presentati e descritte le rispettive composizioni.

MRS pH 5,7

De Man Rogosa Sharpe agar per la conta dei batteri lattici in anaerobiosi con incubazione a 37°C (±1) per 72 ore (±3) in anaerobiosi ottenuta in giara con “gaspak”.

Il kit contiene sali di ferro; le strisce vengono bagnate per catalizzare la reazione in cui il ferro passa da +2 a +3 (si ossida) utilizzando l’ossigeno, che viene ridotto a CO2. Il kit elimina l’ossigeno

all'interno della giara e sviluppa CO2.

Lactobacillus delbrueckii

Tale terreno viene quindi utilizzato per l'individuazione di Bulgaricus subsp. e mantenendo il pH acido permette una miglior isolamento creando Streptococcus Thermophilus, un ambiente ancor più sfavorevole allo sviluppo di meno acido tollerante. I batteri lattici di cui si fa ricerca sono molto esigenti sono quindi presenti diversi componenti specifici nel terreno di coltura.

Di seguito viene riportata la composizione del terreno:

• Peptone: 10,0 g
• Estratto di carne: 10,0 g
• Estratto di lievito: 5,00 g
• Glucosio: 20,0 g
• Idrogeno fosfato di potassio: 2,00 g
• Acetato di sodio: 5,00 g
• Ammonio citrato: 2,00 g
• Magnesio solfato: 0,20 g
• Manganese solfato: 0,05 g
• Polisorbato 80 (noto anche come "Tween 80"): 1,00 g
• Agar: 13,0 g
• Acqua: 1000 mL

In questo terreno il peptone, l'estratto di carne e l'estratto di lievito forniscono azoto, carbonio, zolfo ed altri essenziali fattori di crescita. Il glucosio è la

fonte di energia. Il ilmagnesio, il manganese solfato intensificano la crescita dei lattobacilli. Gli agentitamponanti (potassio fosfato, sodio acetato, ammonio citrato) sono inoltre necessaripoiché durante la loro crescita l'abbassamento del pH può dare fastidio alle stesse cellule. È presente anche un Tween 80 che aiuta le cellule a resistere agli stress e favorisce l'ingresso dei nutrienti nel citoplasma. M17 Agar viene usato per l'isolamento e l'enumerazione degli streptococchi lattici dallo yogurt, formaggio, composti base ed altri prodotti caseari. Il terreno è raccomandato da International Dairy Federation e dal Rapporto ISTISAN 96/35 per l'isolamento selettivo e la determinazione di Streptococcus Thermophilus nel yogurt in anaerobiosi con incubazione a 37°C (±1) per 72 ore (±3) in anaerobiosi ottenuta in giara con "gaspak". Il kit contiene sali di ferro; le strisce vengonobagnate percatalizzare la reazione in cui il ferro passa da +2 a +3 (si ossida) utilizzandol’ossigeno, che viene ridotto a CO2. Il kit elimina l’ossigeno all’interno della giara esviluppa CO2. Il componente chiave di questo terreno è il sodio glicerofosfato che Lactobacillus delbrueckii Bulgaricus inibisce lo sviluppo di subsp. Di seguito viene riportata la composizione del terreno:

• Idrolisato triptico di caseina: 2,50 g
• Peptone: 2,50 g
• Peptone di soia: 5,00 g
• Estratto di lievito: 2,50 g
• Estratto di carne: 5,00 g
• Sodio glicerofosfato: 19,0 g
• Magnesio solfato: 0,25 g