Report laboratorio Microbiologia applicata

Laboratorio di microbiologia generale

Introduzione

Le attività svolte durante la prima esperienza di laboratorio mi hanno permesso di far pratica e prendere confidenza con gli strumenti e con le procedure più utilizzate in microbiologia. Nella prima parte di questo report si farà luce essenzialmente alla descrizione delle procedure e delle tecniche di diluizione e piastramento, di isolamento in coltura pura e delle metodiche per la determinazione della colorazione di Gram. Sono state anche effettuate prove di fermentazione e analisi per discriminare la presenza di specifici enzimi prodotti dai microorganismi di interesse (catalasi, amilasi e proteasi).

Attività 1: Diluizione, piastramento e determinazione della carica vitale di un campione

Scopo

Lo scopo di questa prima attività è quello di determinare la carica vitale di un campione di suolo (prelevato nel cortile di via Mangiagalli 25, Milano) dopo diluizione, semina in piastra mediante spatolamento e incubazione. Si esegue la tecnica dello spatolamento in quanto si può così conoscere esattamente il volume di campione; inoltre la carica vitale deve essere espressa in UFC per grammo di campione, pertanto dopo aver contato le colonie in piastra bisognerà ricordarsi del numero di diluizioni effettuate per ottenere una crescita non confluente. In questa attività verrà calcolata solo la carica batterica mesofila dal momento che l'incubazione avverrà a 30°C in aerobiosi per 48 ore.

Materiali e metodi

• Beuta per preparare il campione
• Campione di suolo
• Bilancia tecnica
• Provette di vetro
• 4 piastre Petri già con terreno agarizzato (due NA e due MA)
• Soluzione fisiologica (composta da cloruro di sodio 9 g/L e da acqua distillata)
• Vortex
• Pipette sterili monouso e pro-pipette
• Pennarello
• Spatole sterili
• Becco Bunsen con fiamma ossidante (o cappa a flusso laminare)

Si inizia preparando il campione, unendo 10 g di terra a 90 mL di soluzione diluente (cioè fisiologica), in modo da avere la prima diluizione (10^-1). Con un vortex si procede ad omogeneizzare la provetta. Queste azioni vanno effettuate nell'intorno di un becco Bunsen con fiamma ossidante per garantire sterilità ed evitare ogni forma di contaminazione.

Successivamente si procede a marcare le 5 provette in dotazione, ciascuna con la diluizione che si intende ricreare. Ciascuna provetta contiene 9 mL di soluzione fisiologica (9 gr/L di sodio cloruro) per evitare stress osmotici. Si inizia con la prima diluizione decimale, utilizzando una pipetta sterile e una pro-pipetta, prelevando 1 mL di campione e ponendolo all'interno della prima provetta, per ottenere così la diluizione 10^-2. Si procede omogeneizzando e, in seguito, prelevando 1 mL rilasciandolo in un'altra provetta fino alle diluizioni 10^-5 e 10^-6.

Giunti a questo punto, si procede nominando le piastre con terreno agarizzato da utilizzare con nome e cognome, indicazione del campione e tipo di terreno. Per il campione di terra verranno usati terreni poco selettivi: un nutrient agar (NA, favorisce i batteri) e un malt agar (MA, favorisce lieviti e muffe per la presenza di malto). Sul primo verranno stese le diluizioni 10^-3 e 10^-4, sul secondo verranno stese le diluizioni 10^-2 e 10^-3, di modo da ottenere delle piastre che al termine dell'incubazione siano contabili.

Il terreno NA è composto da:

• Estratto di carne 3 g/L
• Peptone 5 g/L
• Agar agar 15 g/L
• Acqua distillata 1000 mL

Nutrient Agar è un terreno a base di peptoni di carne utilizzato per la coltivazione dei microrganismi non particolarmente esigenti sotto il profilo delle richieste nutritive. I peptoni forniscono carbonio, azoto e vitamine sufficienti per la crescita della maggior parte dei microrganismi non esigenti (enterobatteri, stafilococchi).

Il terreno MA è invece composto da:

• Estratto di malto 30 g/L
• Agar agar 17 g/L
• Acqua distillata 1000 mL

A questo punto, prelevare con una pipetta sterile circa 100 µL dalla diluizione meno concentrata (nel caso di NA è la diluizione 10^-4) e rilasciarli sul terreno. Con una spatola, anch'essa sterile, distribuire omogeneamente il campione su tutta la superficie della piastra fino a quando il liquido sarà completamente assorbito dall'agar. Ripetere l'operazione con la provetta più concentrata (terreno NA, diluizione 10^-3). Cambiare pipetta e ripetere l'operazione con l'altro terreno (il terreno MA). Porre le piastre in incubazione a 30 °C in aerobiosi per 48 ore, al termine delle quali contare le singole colonie aiutandosi con un pennarello. Le colonie per essere contabili devono essere non meno di 30 e non più di 300 per piastra.

Successivamente calcolare la concentrazione di carica vitale (UFC/g) nel campione scelto: C = ΣN / (V × F × d + (0,1 × F))

Con n₁ = numero di piastre della prima diluizione, n₂ = numero di piastre della seconda diluizione, V = volume inoculato (0,1 mL), d = diluizione più concentrata (prima diluizione contabile), n = 1 (poiché non ho effettuato replicati tecnici).

Risultati

Non è possibile conoscere esattamente il numero esatto di colonie solo osservando le piastre dopo l'incubazione. Tuttavia è ragionevole dedurre come il numero di colonie sia superiore nelle piastre con il terreno MA e con il terreno NA, cioè 10^-2 e 10^-3, nelle piastre più concentrate. Questo ci consente di considerare corretta la pratica svolta. Supponiamo di aver contato 35 colonie nella piastra con diluizione 10^-4 NA e 214 colonie nella piastra con diluizione 10^-3 NA: UFC = (35 + 214) / (0,1 × 1,1 × 10^-3 × 1,1 × 10^-6) = 2,3 × 10⁶ UFC/g.

Attività 2: Isolamento in coltura pura

Scopo

In questa seconda attività di laboratorio si vuole ottenere delle colture pure a partire da uno slant contenente biomassa. Una coltura pura è una popolazione di cellule derivanti dalla divisione di una singola cellula e può essere ottenuta mediante la tecnica dello striscio superficiale su piastre con terreno agarizzato. La tecnica dello striscio superficiale consente di separare le colonie, e da una di esse viene prelevata della biomassa con un'ansa sterile, che viene poi inoculata su una nuova piastra Petri. La tecnica dello striscio superficiale è una tecnica di semina che, contrariamente alla tecnica di inglobamento e di spatolamento, non può essere utilizzata nella conta vitale poiché non si trasportano in piastra volumi noti e definiti di sospensione.

Materiali e metodi

• Slant con Bacillus licheniformis
• Anse e spatole sterili
• Becco Bunsen con fiamma ossidante (o cappa a flusso laminare)
• Pennarello
• Incubatore
• Autoclave per sterilizzare ad umido
• 2 piastre Petri con terreno agarizzato NA

Si inizia questa attività di laboratorio facendo crescere un microorganismo ambientale (Bacillus licheniformis) in coltura pura in dei tubi di vetro contenenti terreno agarizzato, chiamati “slant”. Questo microorganismo è in grado di sopravvivere su un terreno agarizzato come questo per molto tempo perché è molto poco esigente. La prima parte dell'attività mira ad ottenere uno striscio superficiale con colonie ben separate tra loro. Successivamente infatti, solo da una di queste si andranno a prelevare alcuni microrganismi per inocularli su un nuovo terreno agarizzato (per effettuare cioè un isolamento in coltura pura). È necessario lavorare nell'intorno di un becco Bunsen per assicurare la sterilità.

Si inizia quindi prelevando con un'ansa dei microorganismi dallo slant, dopo aver flambato la provetta. Una volta prelevata la biomassa, la si depone su piastra Petri con terreno agarizzato NA (precedentemente intestata con nome, cognome, indicazione del campione e tipo di terreno). L'ansa deve essere parallela al terreno e, senza effettuare troppa pressione, si descrive uno striscio su metà dello stesso, dopodiché sui quarti. Lo scopo di questi movimenti è distanziare le colonie tra loro, diluendo la biomassa prelevata per ottenere una crescita non confluente. Si pone ad incubare la piastra (a 30°C per 24/48 ore in aerobiosi) e, quando le colonie saranno cresciute, si prepara una nuova ansa per prelevare della biomassa.

Per ottenere delle colture pure si procede adagiando quindi la nuova ansa su una singola colonia e si effettua di nuovo lo striscio su una nuova piastra con terreno NA. Infine, si pone in incubazione la nuova piastra alle stesse condizioni (30°C per 24/48 ore in aerobiosi).

Risultati

Nella piastra ottenuta a partire dallo slant è possibile osservare la crescita delle colonie disposte in modo caratteristico dallo striscio (striscio a zig zag per ciascuno dei tre quadranti). Nella piastra ottenuta con prelievo di biomassa da una singola colonia cresciuta sulla prima piastra, si è ottenuto un risultato simile, con una maggiore evidenza dello striscio ed una netta distinzione delle colonie che risultano meglio identificabili. Il risultato ottenuto corrisponde a quello atteso.

Attività 3: Caratterizzazione fenotipica di un isolato ambientale

Scopo

Lo scopo della terza procedura è discriminare la presenza di particolari enzimi, quali amilasi, proteasi e catalasi, in un microorganismo isolato (nel mio caso Pseudomonas putida, un batterio noto per la sua capacità di metabolizzare solventi organici). Per svolgere questa attività si usano dei terreni dalla composizione particolare per discriminare la presenza di una specifica attività enzimatica. Sottoponendo questo microorganismo ad incubazione con terreno ad elevata specificità è possibile individuare se si tratta di una specie catalasi + o catalasi -.

Materiali e metodi

• Slant con Pseudomonas putida
• Anse e spatole sterili
• Acqua ossigenata
• Lugol
• Pennarello
• Fiamma Bunsen ossidante (o cappa a flusso laminare)
• Incubatore
• Autoclave per sterilizzare ad umido
• 2 piastre Petri con terreno NA
• Piastre Petri con terreno AL, AA e piastra con H₂O₂ (in totale 3 piastre)

L'Agar Amido (AA) è composto da:

• Estratto di carne 3 g/L
• Peptic digest of animal tissue 5 g/L
• Amido solubile 5 g/L
• Agar agar 15 g/L
• Acqua distillata 1000 mL

L'Agar Amido è un terreno specifico per test di attività enzimatica che prevede incubazione a 30°C in aerobiosi per 24/48 ore. La presenza di amido permette di verificare, in associazione all'utilizzo di LUGOL (Iodio + ioduro di potassio), la capacità del microrganismo di produrre enzimi capaci di degradare le catene di amilosio (questi enzimi sono chiamati amilasi) e la sua capacità ad usare l'amilosio come fonte di carbonio per il suo sviluppo.

L'Agar Latte (AL) è un terreno composto da:

• Latte scremato 100 g/L
• Agar agar 15 g/L
• Acqua distillata 1000 mL

L'Agar Latte è un terreno specifico per test di attività enzimatica che prevede incubazione a 30° in aerobiosi per 24/48 ore. Viene usato per vedere se i microorganismi hanno attività proteolitica, in questo caso nei confronti delle caseine del latte. Nel caso in cui il microrganismo fosse in grado di degradare le caseine in esso presente si comporterebbe un illimpidimento del terreno nell'area di crescita.

Procedura

Per quanto riguarda la piastra con Agar Latte, si effettua uno striscio su questo terreno particolare a partire da una coltura pura di Pseudomonas putida; se dopo incubazione (30°C per 24/48 ore in aerobiosi) si denota illimpidimento nell'intorno delle colonie allora il test è positivo e Pseudomonas putida ha attività proteolitica.

Sulla piastra con Agar Amido si effettua lo striscio (sulla piastra opportunamente preparata) e l'incubazione, e quando le colonie sono cresciute vi si depone sopra 200-300 µL di una soluzione colorante di iodio e ioduro di potassio (Lugol) utilizzando una pipetta. Questa sostanza si intercala alle catene di amilosio cambiando il suo colore da giallo/arancio a blu. Pertanto, se il Lugol mantiene la sua colorazione originale dopo essere stato adagiato sulla piastra deduciamo che i microorganismi hanno attività amilolitica (hanno utilizzato l'amilosio presente nel terreno che non può, quindi, più reagire con il Lugol). Se le colonie appaiono giallo/arancio Bacillus licheniformis produce amilasi.

Infine si effettua il test della catalasi: questo test si svolge aggiungendo della semplice acqua ossigenata (H₂O₂) a una piastra su cui è stato fatto crescere il microorganismo di interesse. Se si nota la presenza di schiuma, il test è positivo; i microorganismi presenti sono catalasi + (enzima della classe delle ossidoreduttasi che catalizza la reazione di decomposizione dell'acqua ossigenata ad acqua e ossigeno). Dopo aver effettuato uno striscio di Pseudomonas putida in piastra, posto ad incubare alle condizioni citate sopra e aggiunto l'acqua ossigenata, se si forma della schiuma il microorganismo è catalasi positivo.