Report tecnico-scientifico di Microbiologia applicata

MATERIALI UTILIZZATI:

Piastre Petri della esperienza precedente (del 06/10/22);

- Anse monouso sterili;

- Becco Bunsen;

- 3 piastre Petri;

-

METODI E PROCEDURA:

In questa esperienza l’obiettivo finale è quello di isolare delle colonie per lavorare con colture pure.

Per prima cosa abbiamo siglato le 3 nuove capsule Petri con nome, cognome e la sigla del terreno

corrispondente:

NA per la piastra in cui piastrare B. licheniformis;

- M17 per la piastra in cui piastrare S. thermophilus;

- MRS per la piastra in cui piastrare L. delbrueckii subsp. bulgaricus;

- Abbiamo poi provveduto a prelevare una colonia a nostra scelta da ciascuno dei 3

terreni ottenuti nella scorsa esercitazione (S. thermophilus da M17, L. delbrueckii

subsp. bulgaricus da MRS e B. licheniformis da NA) per poi poterle piastrare sui

terreni delle nuove piastre.

Nel nostro caso però, non avendo ottenuto colonie di L. delbrueckii subsp.

bulgaricus non è possibile prelevare una colonia dalle piastre di MRS, si prelevano

allora 2 colonie di S. thermophilus dalle piastre di M17, di cui una viene strisciata

sulla piastra nuova di MRS e l’altra viene strisciata sulla piastra nuova di M17.

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Perciò dalla piastra di M17 con diluizione 10 si prendono i microrganismi da una

colonia casuale attraverso l’uso di una ansa monouso sterile e li semino tramite

striscio sia in una nuova piastra di M17 che in una nuova piastra di MRS.

Immagini 1.21 Striscio di

colonie di B. licheniformis

sul terreno NA. 13

Poi con una nuova ansa sterile prendo una colonia di microrganismi dalla piastra di NA della scorsa

esercitazione e la semino sempre con la tecnica dello striscio (Immagine 1.21) su una piastra di NA

nuova. Queste piastre verranno poi messe ad incubare alle stesse condizioni utilizzate nella prima

esercitazione:

Anaerobiosi a 37°C per 48 ore per le piastre contenenti MRS e M17;

- Aerobiosi a 30°C per 48 ore per la piastra contenente NA.

-

3.3 Risultati e discussione Data esperienza: 20/10/2022

Nelle immagini 1.22 - 1.23 - 1.24 possiamo osservare rispettivamente le piastre di M17 (S.

thermophilus), MRS ( ) e NA (B. licheniformis) dopo incubazione.

S. thermophilus Immagini 1.23 Colonie di S. thermophilus (non

Immagini 1.22 Colonie di S. thermophilus presenti) sul terreno MRS dopo incubazione.

sul terreno M17 dopo incubazione. Immagini 1.24 Colonie di B. licheniformis

sul terreno NA dopo incubazione.

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In un piastramento per striscio ben eseguito le colonie devono essere ben distinguibili tra loro. Nel

caso in cui le colonie siano ben separate, si possono confrontare tra loro dal punto di vista

morfologico. Questo accade parzialmente sia nell’immagine 1.22 che nell’immagine 1.24, dove è

possibile osservare alcune colonie ben isolate, a discapito di altre zone della piastra dove le colonie

sono parecchio ravvicinate e infatti si può notare che le colonie qui sono poco distinguibili, questo

potrebbe essere dovuto ad un errore legato all’inoculo di una quantità eccessiva di biomassa.

Nell’immagine 1.23 si può notare come non siano cresciute colonie siccome è stato seminato S.

thermophilus in una piastra con terreno MRS, il quale è selettivo nei confronti di L. delbrueckii subsp.

bulgaricus, inibendo perciò il microrganismo che abbiamo piastrato, il quale non sarà presente e

visibile sulla piastra.

Valutazione dell’attività amilasica, proteolitica e catalasica

4. 4.1 Introduzione e scopo Data esperienza: 20/10/2022

Lo scopo di questa esperienza è quello di verificare la presenza di particolari enzimi, quali amilasi,

proteasi e catalasi in un microrganismo isolato in coltura pura (Bacillus licheniformis). Quindi

comprendere se il microrganismo preso in esame operi la degradazione dell’amido (attività

amilasica), la degradazione di proteine (attività proteolitica) e quella dell’acqua ossigenata (attività

catalasica).

Per svolgere questa attività si usano dei terreni dalla composizione particolare per discriminare la

presenza di una specifica attività enzimatica. Sottoponendo questo microorganismo ad incubazione

con terreno ad elevata specificità è possibile comprendere se si tratta di una specie:

• Proteasi + o proteasi –

• Amilasi + o amilasi –

• Catalasi + o catalasi -

4.2 Materiali e metodi

MATERIALI UTILIZZATI:

3 piastre Petri con terreno di coltura;

- Acqua ossigenata;

- Reattivo di Lugol (Iodio + ioduro di potassio);

- Anse e pipette sterili monouso;

- Becco Bunsen;

- Piastra di NA della precedente esercitazione;

-

I 3 terreni presenti nelle 3 piastre (Immagine 1.25) hanno caratteristiche

differenti in base alla tipologia di attività enzimatica da ricercare:

o Terreno agarizzato AGAR-LATTE, siglato AL (Immagine 1.26):

Con questo terreno valuto l’attività proteolitica di B. licheniformis.

Si valuta quindi la capacità di crescere su AGAR-LATTE da parte di B.

licheniformis. Dove se il nostro isolato cresce significa che presenta Immagine 1.26 Composizione

terreno AGAR-LATTE

attività proteolitica nei confronti delle caseine del latte. 15

La crescita la si può quindi osservare sotto forma di un illimpidimento del latte presente

nel terreno, partendo da una piastra opaca.

o Terreno agarizzato AGAR-AMIDO, siglato AA (Immagine 1.27):

Con questo terreno valuto l’attività amilasica di B.

licheniformis, partendo da una piastra trasparente.

Si valuta quindi la capacità di crescere su AGAR-AMIDO di B.

licheniformis. Dove se il nostro isolato cresce significa che è in

grado di utilizzare l’amilosio che compone l’amido e perciò

esso presenta attività amilasica nei confronti dell’amido

presente nel terreno.

o Nutrient Agar, siglato NA (Immagine 1.17): Immagine 1.27 Composizione

terreno AGAR-AMIDO

La terza piastra contiene infine Nutrient Agar (NA) e ci serve per

mantenere l’isolamento della coltura pura di B. licheniformis per

procedere poi con il terzo passaggio. Immagine 1.25 Piastre utilizzate,

rispettivamente di AA, AL e NA.

Durante l’esperienza abbiamo inoculato le 3 piastre (Immagine 1.25) partendo da un’unica colonia

prelevata dal terreno NA inoculato nella scorsa esercitazione ed incubato.

Abbiamo quindi prelevato una colonia con l’ansa monouso sterile dalla piastra di NA della scorsa

esercitazione e abbiamo provveduto ad effettuare gli strisci sulle 3 diverse piastre.

Prima abbiamo inoculato la piastra di NA dividendo la stessa in 3 settori ed effettuando i 3 strisci

come descritto nelle esperienze precedenti (uno più fitto per metà piastra e due più leggeri e ampi

nei restanti due quarti di piastra).

In seguito abbiamo inoculato le piastre di AGAR-AMIDO e AGAR-LATTE effettuando sempre tre

strisci, anche se in questo caso avremmo potuto compiere anche solamente uno striscio singolo in

quanto ci interessava evidenziare l’attività enzimatica del microrganismo e non puntavamo

all’ottenimento della coltura pura.

Le capsule sono poi state messe ad incubare (30°C per 48 ore in aerobiosi) con l’agar rivolto verso

l’alto in modo tale che la condensa non creasse problemi. 16

4.3 Risultati e discussione Data esperienza: 27/10/2022

▪ Per la piastra opaca contenente il terreno AGAR-LATTE (AL) (Immagine 1.26) si va ad

effettuare una valutazione fenotipica, dove si va quindi ad osservare i cambiamenti

fenotipici all’interno della piastra, se vi è stata una risposta fenotipica ad una eventuale

crescita ed una eventuale attività proteolitica da parte del microrganismo inoculato.

Si può osservare che, in corrispondenza della crescita

delle colonie di B. licheniformis, il latte e le sue proteine

sono rimasti integri solamente sul bordo della piastra,

dove è appunto rimasto l’alone bianco del terreno.

Questo è accaduto per il semplice fatto che in quella

zona non è stato seminato il microrganismo e quindi le

caseine non sono state degradate, a differenza delle

zone in cui è passata l’ansa e vi è quindi stato lo striscio

dei microrganismi dove invece le caseine sono state

degradate, eliminando l’alone bianco del terreno e la sua

conseguente opacità creata sulla piastra.

Questo dimostra che B. licheniformis è in grado di

crescere sul terreno AGAR-LATTE e che possiede attività

proteolitica siccome è andato ad idrolizzare le caseine

determinando un totale illimpidimento del terreno presente Immagine 1.26 Piastra di AGAR-

nella zona della piastra in cui il microrganismo è cresciuto. LATTE con evidente illimpidimento

dovuto alla crescita di B. licheniformis.

▪ Anche sulla piastra trasparente contenente AGAR-

AMIDO (AA) (Immagine 1.27) B. licheniformis è

stato in grado di crescere, poiché è possibile notare

visivamente la crescita delle colonie sulla piastra.

Per poter verificare la capacità da parte del

microrganismo di degradare l’amido presente nel

terreno (andando a consumare amilosio) c’è però

bisogno di effettuare una prova ulteriore,

utilizzando questa volta un metodo colorimetrico

attraverso l’utilizzo del reattivo di Lugol (soluzione

di iodio in ioduro di potassio), contenuto in una

piccola provetta di plastica da 500 μL (Immagine

1.28).

Con l’utilizzo di una propipetta munita di pipetta

(Immagine 1.29) abbiamo preso il volume di questo

reattivo e lo abbiamo posizionato sulla piastra di AGAR- Immagine 1.27 Piastra di AGAR-AMIDO

AMIDO in corrispondenza della crescita del batterio. con evidente crescita di B. licheniformis.

Si nota subito che dove ho la crescita del microrganismo il liquido rimane di colore giallo-

arancione mentre nell’intorno, lungo i bordi della piastra dove non è presente il batterio,

diventa blu scuro. Infatti questo composto naturalmente è giallo-arancione e cambia

colorazione nel momento in cui si intercala nell’elica dell’amilosio, diventando blu scuro.

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← Immagine 1.28 ← Immagine 1.29

Piccola provetta da Pipetta, propipetta

500 μL contenente il e reattivo di Lugol.

reattivo di Lugol.

Per questa motivazione dove il batterio non si è sviluppato ritroviamo ancora amilosio e il

composto intercalandosi nelle eliche vira il suo colore (Immagine 1.30), viceversa dove il

microrganismo si è sviluppato il composto rimane della sua colorazione naturale

(Immagine 1.31) non essendo più presente l’amilosio, il quale è stato idrolizzato da B.

licheniformis. Immagine 1.30 Colorante di Lugol che ha

Immagine 1.31 Colorante di Lugol che ha virato la sua naturale colorazione dovuta

mantenuto la sua naturale colorazione alla presenza di amilosio.

dovuta all’assenza di ami