Report Microbiologia applicata

MICROORGANISMO3.1 Introduzione e scopo

L'obiettivo della terza attività è quello di valutare la capacità di un determinato microorganismo, in questo caso Bacillus licheniformis e Pseudomonas putida, di crescere su particolari tipologie di terreno, grazie alla sua capacità amilasica, proteolitica e catalasica. Per vedere le diverse attività enzimatiche verranno utilizzati terreni dalla composizione particolare, come agar latte e agar amido.

3.2 Materiale e metodi

I materiali necessari per poter svolgere questa attività sono:

• slant con Bacillus licheniformis
• coltura pura di Pseudomonas putida
• anse sterili
• capsule Petri con terreno AL, AA, NA
• reattivo di Lugol
• acqua ossigenata

Dopo aver ottenuto una coltura pura a partire dallo slant di Bacillus licheniformis a seguito dell'operazione di striscio, si preleva della biomassa e si effettua nuovamente uno striscio su terreni di agar latte e agar amido per valutare la capacità di crescita del microorganismo.

microorganismoin queste condizioni. Lo stesso viene fatto con la coltura pura di Pseudomonas putida.

La piastra con agar latte (AL) viene utilizzata per valutare l'attività proteolitica dei microorganismi, nei confronti della caseina del latte. Si effettua lo striscio del microorganismo a partire da coltura pura e si incuba a 30°C per circa 24/48 ore in condizioni di aerobiosi.

La piastra con agar amido (AA) viene utilizzata per valutare l'attività amilasica dei microorganismi, ossia la loro capacità di degradare amido utilizzando l'enzima amilasi. Si effettua lo striscio a partire da colonia pura di Bacillus licheniformis e, dopo aver effettuato un periodo di incubazione, si utilizza il reagente di Lugol (soluzione di iodio e ioduro di potassio), deponendone all'incirca 300-400 µL sulla piastra stessa. La soluzione contiene iodio ed esso va a reagire con l'elica dell'amilosio se presente nel terreno, cambiando il colore in blu.

Se il microorganismo avrà invece degradato l'amido, il terreno rimarrà giallo. Per il test della catalasi invece, si prelevano circa 300 µL di acqua ossigenata e la si inocula sulla piastra con terreno agarizzato NA. È un'attività tipica di microorganismi aerobi e consiste nella capacità di degradare l'acqua ossigenata in acqua e ossigeno. 3.3 Risultati e conclusioni Si può osservare che sulla capsula Petri contenente terreno agar latte, entrambi i microorganismi sono in grado di crescere perché c'è la formazione di biomassa, ma la capsula inoculata con Bacillus licheniformis ha un aspetto diverso rispetto a quella inoculata con Pseudomonas putrida. I due microorganismi sono infatti in grado entrambi di crescere in queste condizioni, ma solamente il bacillo è in grado di degradare le caseine del latte portando all'illimpidimento del terreno, a seguito appunto dell'attività proteolitica.

Quanto riguarda l'attività amilasica, si può osservare che entrambi i microorganismi sono in grado di crescere su agar amido, ma dopo aver applicato il reattivo di Lugol si può notare che la piastra contenente bacillo ha zone con colorazione blu solamente dove il microorganismo non è presente, ciò significa che possiede attività amilasica. Per lo Pseudomonas putida invece, non si vede attività amilasica in quanto tutta la piastra assume colorazione blu.

Per quanto riguarda l'attività catalasica, si osserva sulla piastra inoculata con Bacillus licheniformis, che subito dopo aver applicato acqua ossigenata, vi è la formazione di bolle dovute alla degradazione in acqua ed ossigeno; dunque, il microorganismo risulta essere catalasi positivo. Per quanto riguarda invece Pseudomonas putida, è anch'esso catalasi positivo ma con risposta più lenta.

Figura 8. Formazione di bolle

4. VALUTAZIONE UTILIZZO DI

ZUCCHERI DI S. thermophilus e L. delbruckiisubsp. Bulgaricus

4.1 Introduzione e scopo

Questa attività ha come scopo quello di valutare la capacità di un determinato microorganismo, in questo caso Streptococcus thermophilus, di utilizzare zuccheri (galattosio, lattosio e glucosio), attraverso una prova di fermentazione.

4.2 Materiali e metodi

I materiali necessari per svolgere questa attività sono:

• ansa sterile
• coltura pura di Streptococcus thermophilus
• diluente (soluzione fisiologica)
• 4 provette in vetro con terreno liquido BSM e rispettivi tappi
• pipette e pro-pipette

Per poter effettuare l'attività bisogna innanzitutto utilizzare l'ansa sterile e prelevare della biomassa di Streptococcus thermophilus dalla piastra Petri, e conseguentemente ottenere una sospensione diluendo la biomassa con soluzione fisiologica per poter in seguito fare l'inoculo nelle quattro provette.

Le quattro provette servono per poter svolgere il test e ciascuna contiene

terreno BSM, terreno di colore viola, privo di qualsiasi fonte di carbonio che possa supportare la crescita di un batterio lattico. Contiene inoltre un indicatore di pH che vira da colore fucsia a giallo se il microorganismo è in grado di acidificare il terreno (serve per controllare la veridicità della prova).

Per la preparazione delle quattro provette si utilizza una pipetta da 1 mL per prelevare all'incirca 100 µL di soluzione fisiologica e inserirla nei rispettivi tubi. Bisogna in seguito stabilire la concentrazione degli zuccheri che si vogliono utilizzare all'interno di ogni singola provetta.

Considerando che la concentrazione iniziale degli zuccheri (glucosio, lattosio e galattosio) è del 20% p/v, e che il volume finale deve essere di 5 mL (con concentrazione finale del 5%), la quantità di zucchero da aggiungere in 5 ml per far sì che si abbia una concentrazione finale dell'1% è di 0,25 mL o 250 µL.

Dopo aver nominato

Le quattro provette con i rispettivi nomi degli zuccheri che si andranno ad aggiungere ed il controllo negativo, si prosegue con il prelievo di 250 µL di ogni singolo zucchero e lo si inocula nella rispettiva provetta. Incubare a 37°C per circa 48 ore in condizioni di anaerobiosi altrimenti i microorganismi potrebbero svilupparsi all'interno delle provette.

4.3 Risultati e conclusioni

I risultati ottenuti risultano in parte concordanti con i risultati attesi tranne che per il controllo positivo, ossia il lattosio, che sarebbe dovuto virare ad una colorazione gialla, ma è rimasto di colorazione rosa. Ciò significa che il microorganismo non è cresciuto e quindi non ha potuto acidificare, dunque l'analisi è invalidata. Si può però osservare che la provetta con glucosio è virata ad una colorazione gialla e ciò significa che il microorganismo è in grado di utilizzare questo zucchero, mentre le provette contenenti

galattosio è rimasta invariata perché lo Streptococcus thermophilus non è in grado di utilizzarlo.

Risultati attesi | Risultati ottenuti
Controllo negativo | Fucsia (-) Fucsia (-)
Glucosio | Giallo (+) Giallo (+)
Lattosio | Giallo (+) Fucsia (-)
Galattosio | Fucsia (-) Fucsia (-)

5. COLORAZIONE DI GRAM
5.1 introduzione e scopo
Lo scopo di questa attività è quello di differenziare i microorganismi gram positivi e gram negativi sulla base della colorazione osservata al microscopio ottico in campo chiaro. In questo caso la colorazione gram era riferita al Bacillus licheniformis, un batterio gram positivo.

5.2 Materiali e metodi
I materiali occorrenti per poter svolgere questa attività sono:
- slant con Bacillus licheniformis
- vetrino
- cristal violetto, Lugol e safranina
- becco bunsen
- ansa sterile
- etanolo e acqua distillata
- microscopio ottico a contrasto di fase

Per poter svolgere questa attività bisogna innanzitutto prelevare labiomassa dallo slant e posizionarla sul vetrino. Fissare con il calore utilizzando il becco bunsen con fiamma ossidante applicando qualche goccia d'acqua sul vetrino stesso. Una volta effettuato il fissaggio, si effettua la colorazione utilizzando il colorante cristal violetto e aspettare qualche minuto e rimuovere l'eccesso con l'acqua. Immergere in seguito per circa un minuto nel reattivo di Lugol ed effettuare la decolorazione con lavaggio con etanolo. Questo passaggio è importante perché determina il lavaggio del colore dai batteri gram negativi in quanto la loro membrana si scioglie, mentre i gram positivi non subiscono decolorazione. L'ultima fase di colorazione avviene con la safranina, la quale serve per colorare gli eventuali gram negativi senza interferire con la colorazione dei gram positivi. Si osserva in seguito il vetrino al microscopio ottico a contrasto di fase, in campo chiaro con gocce d'olio (per immersione) con obiettivo ad.

ingrandimento 100X.

Figura 10. coloranti utilizzati

5.3 Risultati e discussione

La prova effettuata ha confermato che il Bacillus licheniformis è un batterio gram positivo inquanto mantiene una colorazione rosa e questo è dovuto al fatto che la sua membrana è più difficile da rompere (non si scioglie in etanolo) in quanto contiene peptidoglicani.

Figura 11. B. licheniformis osservato al microscopio

MICROBIOLOGIA INDUSTRIALE

1.SEMINA DI Saccharomyces cereviseae

1.1 Introduzione e scopo

Saccharomyces cereviseae è un lievito utilizzato in ambito alimentare per la produzione di impasti lievitati, birra, vino principalmente, e possiede due tipologie differenti di metabolismo, quello fermentativo e quello respirativo. Esistono dunque due differenti tecniche di coltura, quella in alto strato dove è presente tanto glucosio e poco ossigeno, dunque per effetto crab tree fermenta, e la tecnica a basso strato, dove la concentrazione di glucosio è a valori normali.

cereviseae 1.2 Materiali e metodi Per poter svolgere questa attività sono necessari: - beuta - slant di S. cereviseae - becco bunsen - pipetta e pro-pipetta - 5 mL di soluzione fisiologica - terreno MEB e glucosio Innanzitutto, preparare la beuta contenente in questo caso terreno MEB con glucosio in concentrazione di circa 150 g/L in quanto si andrà a utilizzare la tecnica in alto strato per osservare la sua capacità di formare biomassa. Si inocula lo slant con circa 4-5 mL di soluzione fisiologica in modo tale da portare in sospensione i microorganismi, in seguito si pipetta e si mette il tutto all'interno della beuta. Si utilizza il becco bunsen e si inocula la beuta (precedentemente rinominata) e si chiude con tappo disteso in modo che l'ossigeno passi nella coltura e infine incubata. Figura 12. Slant Figura 12. Beuta con S. cereviseae