Spettrometria di massa

Spettrometria di massa

Applicazioni LC-API-MS

ESI (elettrospray): è una tecnica di ionizzazione soft (più di tutte).

• Per analizzare sostanze da mediamente polari a ioniche, con quelle apolari si hanno problemi di sensibilità e in questi casi per avere segnali più intensi si può promuovere la formazione di addotti molecolari con metalli alcalini [M+Na]⁺, con ioni ammonio [M+NH₄]⁺ o con ioni d’argento [M+Ag]⁺.
• Il range di pesi molecolari analizzabile è notevolmente maggiore di quello delle altre tecniche API grazie al fatto che si formano ioni a carica multipla (MW>100.000 unità) mentre per gli ioni monocaricati è comunque ampio (MW>1.000 unità). C’è effetto matrice a causa delle alte concentrazioni di sostanze diverse dall’analita nelle gocce caricate.
• Le classi di sostanze analizzate: peptidi, proteine, nucleotidi, polisaccaridi, fosfolipidi. È inoltre una valida tecnica per analizzare composti organici ed organometallici a basso peso molecolare.

APCI e APPI: tecniche di ionizzazione soft

• Per analizzare sostanze poco polari o apolari.
• Generano ioni monocarica con MW m/z al massimo fino a 1500. Soffrono di effetto matrice (diminuzione sensibilità) ma è generato da un problema diverso rispetto all’ESI, perché è dovuto alla presenza di sostanze che possono avere caratteristiche più basiche dell’analita (se si lavora in ionizzazione positiva).
• Si analizzano farmaci, lipidi, ormoni steroidei.

L’APPI è una tecnica particolare (con un’applicazione più di nicchia) che spesso porta alla formazione di ioni molecolari (specie radical catoni o radical anioni), ha carattere più soft e viene usata per ionizzazione di idrocarburi policiclici aromatici.

I range di applicazione si sovrappongono ma ognuno ha le sue caratteristiche (es. ESI per analizzare quelle ad alto peso molecolare), esistono sorgenti di ionizzazione che sono in grado di passare da una tecnica all’altra durante la stessa corsa cromatografica: sorgenti APCI/APPI o sorgenti ESI/APPI.

Determinazione del peso molecolare

Determinare il peso molecolare è il primo e più importante obiettivo per decifrare lo spettro di massa: bisogna ricostruire questo valore e, essendo tecniche soft, questo è subito ricavabile dallo ione precursore (non c’è mai un’alta frammentazione a differenza della tecnica per impatto elettronico EI), tuttavia per capire la struttura è spesso utile fare riferimento agli ioni diagnostici derivanti da successiva frammentazione.

Mentre nella sorgente EI si forma un radical catione M⁺°, nelle tecniche API si forma uno ione a numero pari di elettroni. Tuttavia, con particolari tipi di sostanze si possono formare anche nel caso delle tecniche API radical anioni e radical cationi: per esempio in APCI negativo si possono formare radical anioni con molecole che hanno nitrogruppi su sistemi aromatici; in APCI positivo e in ESI positivo si formano radical cationi con molecole che hanno estesa coniugazione mentre, in particolare nel caso dell’ESI, danno radical cationi gli esteri.

Con le tecniche API in ionizzazione positiva si formano principalmente ioni del tipo [M+H]⁺ ma se l’analita non è una sostanza basica come nel caso di esteri o ammidi è più comune formare addotti con lo ione sodio, con lo ione potassio o con lo ione ammonio ma ovviamente la fase mobile dovrà essere opportunamente preparata (con acetato o formiato d’ammonio per esempio). Le sostanze dotate di insaturazione possono invece coordinare Li⁺ o Ag⁺ a formare addotti, questa tecnica viene utilizzata per individuare la posizione dei doppi legami. In ionizzazione negativa invece lo ione più comune è [M-H]^- ma anche in questo caso, se la sostanza da analizzare non ha caratteristiche acide allora si cercherà di formare addotti diversi del tipo [M+Cl]^-, [M+HCOO]^-, [M+CH₃COO]^-.

In ogni caso si preferisce formare lo ione classico del tipo [M+H]⁺ o [M-H]^- piuttosto che gli addotti, anche perché per frammentare ulteriormente gli addotti con i metalli alcalini (per avere gli ioni diagnostici) occorre utilizzare elevate energie che finiscono per frammentare troppo l’addotto ottenendo alla fine moltissimi picchi di bassissima intensità; invece nel caso degli addotti con NH₄⁺ ciò non avviene.

Un'altra caratteristica dell’ESI ma non di APCI o APPI è la formazione di dimeri o oligomeri come [2M+H]⁺ o [2M-H]^- quando la concentrazione dell’analita è alta e quando la sostanza tende spontaneamente a formare queste specie (oligomeri non covalenti o covalenti).

Ioni multicarica in ESI

Il numero di ioni multicarica in ESI è in funzione del numero di siti basici se si lavora in ionizzazione positiva, di quelli acidi in ionizzazione negativa. La distanza tra i picchi isotopici è 1 unità se gli ioni sono a carica singola, 0,5 unità se sono a carica doppia e così via, quindi la distanza tra i picchi è inversamente proporzionale al numero delle cariche. Quindi all’aumentare degli ioni multicarica lo spettrometro dev’essere ad alta risoluzione (soprattutto se ho ioni con numero di cariche maggiori a 3).

Nel caso di proteine ho diversi ioni multicarica, ottengo una gaussiana con picchi vicini per bassi valori di m/z e picchi più distanti all’aumentare del rapporto m/z. Il calcolo del rapporto massa su carica si fa dividendo la massa totale (analita M + massa dell’agente di carica n×m se ce ne sono n) per la carica totale (data dal numero di agenti di carica presenti su una stessa molecola M).

Ovviamente se l’agente di carica è il protone la sua massa che è 1 non compare nella formula ma se l’agente di carica è per esempio un metallo alcalino allora la sua massa deve comparire nella formula. Essendo l’ESI una tecnica soft, lavora in condizioni non denaturanti permette quindi di studiare anche la struttura di una proteina a differenza del MALDI che, benché venga usata molto per l’analisi delle proteine, non è usata per studiarne la struttura.

Sostanze analizzabili con ESI, in dettaglio

• Ioni come sali di ammonio quaternari rilevabili come cationi o sostanze dotate di gruppi fosfato e solfato rilevabili come anioni.
• Sostanze acide o basiche (deboli) dove è sufficiente regolare opportunamente il pH per favorire la protonazione o la deprotonazione, per farlo si aggiungono additivi volatili:
  • Per ionizzare ammidi, peptidi, proteine uso acido formico, acetico e trifluoroacetico.
  • Per ionizzare acidi uso ammoniaca, trietilammina o tributilammina.

Tuttavia, nella separazione cromatografica soprattutto a fase inversa (più comune) gli acidi/basi deboli utilizzati non sono in accordo con le condizioni dell’ESI (o ISI) quindi bisogna neutralizzare post-column prima di iniziare la ionizzazione ESI affinché si abbia una buona separazione cromatografica e una corretta analisi MS.

• Sostanze polari che non possono essere ionizzate per protonazione o deprotonazione come eteri, esteri, ammidi e carboidrati. In questi casi occorre favorire la formazione di addotti con metalli alcalini o gruppo ammonio (in ionizzazione positiva), con alogenuri, formiato o acetato (in ionizzazione negativa).

Determinazione di proteine con MALDI o ESI

Prima si usava la cromatografia a esclusione dimensionale, ma è una tecnica che richiede tempi lunghi quindi oggi si preferisce usare la spettrometria di massa con ESI o MALDI oppure l’elettroforesi, anche se quest’ultima ha lo svantaggio di richiedere tempi lunghi.

Con ESI o MALDI è possibile:

• Determinare il peso molecolare della proteina.
• Individuare le isoforme (cioè proteine che differiscono per un singolo amminoacido).
• Individuare la mappatura peptidica e quindi confermare la struttura primaria.
• Studiare la conformazione proteica (struttura secondaria o terziaria), soprattutto con ESI.
• Studiare le interazioni covalenti e non covalenti.

Gli α-amminoacidi che costituiscono le proteine si distinguono sulla base dei gruppi R legati che (conferiscono proprietà diverse) in polari, neutri, basici a pH 6-7, acidi a pH 6-7.

• Si ricavano ioni negativi dalla deprotonazione di amminoacidi acidi come aspartato, glutammato, tirosina, cisteina, residuo C-terminale.
• Si ricavano ioni positivi in seguito a protonazione di amminoacidi basici come arginina, lisina, istidina, residuo N-terminale.

Il peso molecolare di una proteina si determina assumendo che due picchi vicini differiscano per una sola carica acquisita dove:

• M = peso molecolare della proteina
• m₁ e m₂ = masse degli ioni multicaricati
• n₁ e n₂ = numero di cariche acquisite

Si costruisce un sistema di equazioni e risolvendo si ottiene il peso molecolare.

Calcolo del peso molecolare di un peptide (l'insulina bovina)

A partire da 4 picchi: si procede prendendo coppie di valori m/z a partire dai due maggiori (in questo caso m₂=2867,2 e m₁=1912.3, dove m₂ è il maggiore di m₁ in modo che il Δm=m₂-m₁ sia un valore positivo). Si scrivono 3 equazioni (si preferisce usare questo metodo, più diretto, rispetto allo svolgimento del sistema di equazioni). Si svolge l’equazione e si trova il valore di n che si inserisce nell’equazione per trovare il valore di M. Infine, si compila la tabella procedendo allo stesso modo per le tre coppie di valori di m/z. Sappiamo che abbiamo ottenuto un risultato attendibile perché, oltre ad avere valori di n crescenti che indicano che ogni volta il peptide ha acquisito una sola carica, abbiamo valori di M molto simili. Il valore esatto di M si ottiene facendo una media aritmetica dei valori ottenuti.

Studio del folding proteico con ESI-MS

Con ESI-MS è possibile studiare il folding proteico, ovvero il ripiegamento della proteina a formare la cosiddetta struttura terziaria. Infatti, la struttura terziaria influisce sulla distribuzione degli stati di carica: proteine allo stato nativo si trovano sottoforma di aggregati globulari e quando si fa un’analisi ESI-MS il solvente interagisce solo con gli amminoacidi con cui riesce ad entrare in contatto, ovvero quelli “esterni” quindi solo quelli saranno ionizzati.