Spettrometria di massa

Accessibilità degli H al solvente (conformazione nativa o denaturata)

II. pH

III. Labilità di H

Sotto sono riportati gli spettri di massa dell'ubiquitina nella conformazione nativa (a), in quella nativa madeuterata (c), in quella denaturata (b), in quella denaturata deuterata (d). Come si vede la % di scambio è molto più alta per la conformazione deuterata.

Per il calcolo della % di scambio si trovano i pesi molecolari della proteina nativa (a) e della proteina nativadeuterata (c) e si fa la differenza, tale valore si divide per il numero di H labili (144 nel caso dell'ubiquitina) e si moltiplica per 100. Lo stesso per il caso della denaturata.

Invece per identificare i siti di scambio si considera una proteina allo stato nativo e, una parte viene digerita (cioè scissa nei suoi peptidi), mentre l'altra viene denaturata e poi digerita. Si fa un'analisi HPLC dei peptidi provenienti dalla proteina nativa e dalla proteina denaturata.

si confrontano gli spettri. 2-Analizzatori, risoluzione e accuratezza Gli analizzatori separano gli ioni in base al rapporto m/z, in base al fatto che i parametri su cui si basa il funzionamento dell'analizzatore dipendano o meno dal tempo si classificano in: I. Analizzatori statici come l'analizzatore a settore magnetico (o a quantità di moto) II. Analizzatori dinamici come: - Analizzatori a stabilità di percorso come l'analizzatore a quadrupolo: costituito da 4 barre metalliche cilindriche disposte a due a due parallelamente (una coppia di barre si trova sul piano xz, mentre l'altra coppia sul piano yz) che fungono da elettrodi. Le due coppie di barre costituiscono rispettivamente il polo positivo e negativo di un generatore a corrente continua. Inoltre, alla prima coppia è applicata una tensione alternata con frequenza dell'ordine dei megahertz. A causa del voltaggio oscillante, uno ione che viaggia entro il quadrupolo (nello

Lo spazio compreso dalle 4 barre viene attratto e respinto da ciascuna barra compiendo una traiettoria oscillante diversa per ogni valore di m/z. Quindi regolando il campo elettrico è possibile selezionare un particolare ione (un particolare valore di m/z); infatti gli ioni con m/z superiore o inferiore all'intervallo scelto percorrono traiettorie che non li fanno giungere al rivelatore.

Nella pratica, immaginiamo che la coppia di barre nel piano xz agisca da filtro per gli ioni troppo leggeri (filtro passa alto) perché gli ioni pesanti sentono l'effetto di focalizzazione della corrente continua, mentre quelli leggeri sentono la defocalizzazione durante l'escursione negativa della corrente alternata. La coppia di barre nel piano yz agisce invece da filtro per gli ioni troppo pesanti (filtro passa basso) perché questi sentono l'effetto della defocalizzazione della corrente continua, mentre quelli leggeri vengono focalizzati durante l'escursione positiva.

della corrente alternata. In definitiva la coppia di barre sul piano xz non fa passare gli ioni troppo leggeri, la coppia sul piano yz non fa passare gli ioni troppo pesanti, il risultato è che passano solo gli ioni con un limitato intervallo di m/z che però è possibile variare regolando opportunatamente il voltaggio.

I vantaggi dell'analizzatore a quadrupolo sono: semplicità e compattezza, elevata velocità di scansione, ampio range dinamico lineare, possibilità di invertire la polarità degli elettrodi per registrare alternativamente spettri di ioni positivi e negativi, basso costo.

Gli svantaggi sono innanzitutto il fatto che essendo un analizzatore molto sensibile alla contaminazione occorre prestare molta attenzione nella fase di pulizia e assemblaggio (perché anche le impronte possono contaminare l'analisi), inoltre poiché il range m/z si estende fino a 2000-4000 m/z è opportuno usare quest'analizzatore

in accoppiamento con tecniche ESI in grado di generare ioni multicarica che abbassano il valore m/z, infine la risoluzione unitaria (la capacità di distinguere un valore m/z di 100 da uno di 101 per es.) limita l'accuratezza.

• Analizzatori a tempo di volo (TOF) che opera in modo pulsato ovvero analizzando 'pacchetti di ioni' di cui si misura il tempo impiegato al raggiungimento del detector (time of flight). Il funzionamento è molto semplice: gli ioni, che vengono accelerati tutti con la stessa energia cinetica attraverso le piste di accelerazione (dispositivi che accelerano applicando ddp), passano poi in una zona libera da campi elettrici e arrivano al detector in tempi differenti in base alla loro massa; infatti la loro energia cinetica è uguale ma se arrivano al detector in tempi diversi vuol dire che hanno velocità diverse e cioè che si differenziano in base alla loro massa, tanto è che quelli più leggeri.arrivano prima dei più pesanti. Tuttavia, inizialmente questo tipo di analizzatore non veniva usato perché aveva una risoluzione molto bassa: consideriamo un pacchetto formato dallo stesso tipo di ioni (stesso m/z), questi si disporranno non allineati nello spazio fra le slitte di accelerazione e quelli più vicini alla slitta di uscita risentiranno di una minore ddp rispetto a quelli più lontani dalla slitta di uscita. Quindi quelli più vicini alla slitta di uscita usciranno per primi ma con un'energia cinetica leggermente inferiore rispetto a quelli più lontani dalla slitta di uscita che usciranno dopo ma con energia cinetica maggiore, quindi ioni con stesso m/z non si muovono tutti allineati ma il pacchetto è caratterizzato da una certa larghezza. Man mano che si muovono all'interno del tubo di volo quello più veloce ma uscito per ultimo raggiunge quello più lento ma uscito per primo: c'è un puntodetto fuoco spaziale in cui ivari ioni del pacchetto si trovano tutti allineati e dove quindi la larghezza del pacchetto è minima, superato però il fuoco spaziale gli ioni di nuovo non si trovano più allineati (perché quello veloce supera gli altri) e la larghezza del pacchetto aumenta un'altra volta. Per risolvere questo problema quindi si cerca si spostare il fuoco spaziale vicino al detector (negli spettrometri TOF lineari) in modo che gli ioni con stesso m/z arrivino al detector tutti insieme, oppure si usa in Reflectron (TOF a riflessione). Nel Reflectron gli ioni con stesso m/z ma energie cinetiche diverse vengono prima rallentati, fermati e infine respinti con un'inversione della loro direzione di volo per azione di un potenziale dello stesso segno degli ioni. Quelli con energia cinetica maggiore penetrano più profondamente nel campo di riflessione trascorrendo lì un tempo maggiore e perciò questo effetto compensa le differenze.di tempo di volo degli ioni che giungono così insieme al detector. I vantaggi sono la velocità, la sensibilità, l'ampio intervallo di masse che il TOF è in grado di analizzare (fino a 1MDa), la risoluzione e l'accuratezza elevate. Gli svantaggi sono il range dinamico lineare non ampio, sensibilità inferiore al quadrupolo e il costo più elevato del quadrupolo. Il TOF funziona bene con la sorgente MALDI perché entrambi operano in modo pulsato e perché MALDI produce perlopiù ioni a carica singola che il TOF è in grado di analizzare considerato l'ampio range di pesi che riesce a riconoscere. Invece una sorgente ESI è meno indicata perché lavora in modo continuo e quindi occorre interporre un dispositivo che agisca come una trappola ionica in grado cioè di introdurre nell'analizzatore gli ioni in modo pulsato. • Analizzatori a trappola ionica sono dispositivi che separano gli ioni.

1. trappola ionica quadrupolare o tridimensionale: simile al quadrupolo perché opera sullo stesso principio ma non agisce come un filtro di massa. È costituito da un elettrodo centrale ad anello semicircolare e da una coppia di elettrodi a calotta. Gli ioni rimangono intrappolati nella cavità delimitata dall'anello e seguono delle traiettorie a orbita la cui stabilità è influenzata dal rapporto m/z: quelli con m/z elevato seguono orbite molto stabili, quelli con m/z basso meno stabili. In questo modo è possibile espellere sequenzialmente al crescere di m/z aumentando progressivamente il potenziale. I vantaggi sono la compattenzza, la robustezza, la sensibilità e il basso costo (minore del quadrupolo), mentre gli svantaggi sono la risoluzione unitaria e le analisi semiquantitative.
2. trappola ionica bidimensionale
3. trappola ionica a

risonanza di ciclotrone in trasformata di Furier: gli ioni sono intrappolati in una cella cubica in cui, per opera di un campo magnetico elevatissimo unitamente ad un campo elettrico, assumono un'orbita elicoidale con frequenza dipendente dal rapporto m/z. Infatti, la frequenza di ciclotrone dipende solo dall'inverso di m/z e un aumento di velocità è accompagnato da un aumento del raggio dell'orbita. Uno ione costretto a muoversi su una traiettoria circolare in un campo magnetico è in grado di assorbire energia da un campo elettrico in corrente alternata purché la frequenza del campo corrisponda a quella di ciclotrone; in questo modo, l'energia assorbita si traduce in un aumento della velocità di rotazione dello ione (e quindi del raggio di rotazione). Quando la zona tra le piastre contiene un insieme di ioni, l'applicazione di un segnale elettrico alternato di frequenza pari a quella di ciclotrone pone tutte le particelle con

lostesso rapporto m/z in moto coerente e in fase con il campo, mentre gli ioni conuna frequenza di ciclotrone differente, cioè con un diverso rapporto m/z, nonrisentono della presenza del campo. Il moto circolare coerente degli ioni risonantiproduce una corrente immagine che decresce esponenzialmente nel tempo, taledecadimento fornisce un segnale nel dominio del tempo analogo al FID in NMR, poisi passa dal dominio del tempo a quello della frequenza e mediante il rapportoinversamente proporzionale tra frequenza e m/z si ottiene un segnale in funzionedella massa. I vantaggi sono l’alta sensibilità e accuratezza, l’elevato potererisolutivo e l’ampio range di massa. Lo svantaggio principale è l’elevato costo perquesto analizzatore che è il top della tecnologia.

orbitrap che a differenza degli altri dispositivi a trappola ionica non usa un campoelettrico dinamico ma statico. È composto da un elettrodo centrale a forma di fusoe da

ttrodo positivo e respinto dall'elettrodo negativo. Questo processo è chiamato elettrolisi. Durante l'elettrolisi, gli ioni si muovono attraverso l'elettrolita, che è una soluzione conduttiva, e si accumulano sugli elettrodi. L'elettrodo positivo è chiamato anodo, mentre l'elettrodo negativo è chiamato catodo.