Spettrometria di Massa

Principi generali

Cos'è la spettrometria di massa

La spettrometria di massa è una tecnica analitica particolarmente usata in chimica organica, che permette di ottenere informazioni sulle masse molecolari delle molecole, determinare la formula di struttura di prodotti incogniti, effettuare determinazioni quantitative di composti noti attraverso l’utilizzo di quantità di campione estremamente limitate (dell’ordine dei picogrammi) o presenti a concentrazioni molto basse anche in miscele complesse.

Una molecola per poter essere osservata in uno spettrometro di massa deve essere prima ionizzata. Per ottenere uno spettro di massa, infatti, il pre-requisito essenziale è di produrre degli ioni in fase gassosa che saranno successivamente accelerati mediante un campo elettrico e proiettati in una zona dello strumento, l’analizzatore di massa, che li separa in base alle loro masse (più precisamente come vedremo in base al loro rapporto massa/carica, m/z). Gli ioni separati vengono infine inviati al rivelatore.

Mediante la spettrometria di massa è possibile studiare qualsiasi tipo di composto che sia in grado di essere ionizzato e i cui ioni possano esistere in fase gassosa. Questa tecnica, quindi, risulta completamente diversa dagli altri comuni metodi analitici. A differenza delle tecniche spettroscopiche, essa è un metodo d’analisi distruttivo (la molecola non rimane intatta dopo l’analisi).

Le applicazioni della spettrometria di massa sono estremamente vaste ed includono la rivelazione di uso di steroidi da parte di atleti, lo studio e la determinazione della composizione di sostanze rivelate nello spazio, l’indagine sulla struttura delle molecole organiche, dalle più semplici fino alle macromolecole di origine biologica, la determinazione di "come" i farmaci vengono utilizzati dall’organismo, l’analisi in medicina legale sull’uso o meno di droghe e del loro abuso, analisi ambientali, studi per stabilire l’età e l’origine di campioni archeologici ecc...

Tale tecnica è molto impiegata anche nel settore alimentare ed è spesso associata a tecniche di separazione come la GC, l’HPLC o la 2D-PAGE.

Lo spettrometro di massa

Uno spettrometro di massa è uno strumento utilizzato per misurare la massa di una molecola dopo che questa è stata ionizzata, ovvero alla quale è stata impartita una carica elettrica. Più precisamente, uno spettrometro di massa in realtà non misura direttamente la massa di una molecola, ma il rapporto massa/carica degli ioni che si formano a partire dalla molecola in esame.

La maggior parte degli ioni, ma non tutti, che si possono riscontrare in spettrometria di massa possiede una sola carica (z =1), cosicché il loro valore di m/z coincide numericamente con la loro massa molecolare (o meglio, come vedremo, con la loro massa ionica). Pertanto, in uno spettrometro di massa il campione deve prima di tutto essere ionizzato.

Un secondo requisito richiesto ad un campione per essere analizzato mediante spettrometria di massa, è che si trovi in fase gassosa. Fino a non molto tempo fa gli spettrometri di massa richiedevano il campione già in fase gassosa, ma grazie agli sviluppi recenti sulle tecniche di ionizzazione, l’applicabilità della spettrometria di massa si è estesa anche a campioni in fase liquida o inglobati in matrici solide, che vengono portati in fase gassosa direttamente all’interno dello strumento stesso. In ogni caso, gli ioni risultanti vengono poi separati in funzione del loro rapporto massa/carica (m/z) dall’analizzatore.

In genere uno spettrometro di massa consiste in cinque componenti principali:

• Il sistema di introduzione del campione, che dipende dallo stato fisico del campione;
• La sorgente, dove avviene la ionizzazione dell’analita e il passaggio allo stato gassoso (per campioni liquidi o solidi);
• L’analizzatore, dove gli ioni sono separati in funzione del loro rapporto massa/carica (m/z);
• Il rivelatore (detector), che permette di rilevare e registrare gli ioni;
• Il sistema da vuoto. Da notare che il vuoto (che si aggira intorno ai 10⁻⁶ – 10⁻⁸ torr) è necessario per impedire una perdita di ionizzazione per urto con i gas atmosferici.

L'introduzione del campione

Complessivamente, quindi, un esperimento di spettrometria di massa consiste nella ionizzazione di molecole in fase gassosa, nella separazione dei diversi ioni prodotti e nella loro rivelazione. L’introduzione del campione, e quindi la sua vaporizzazione, può avvenire sotto alto vuoto (10⁻⁶ – 10⁻⁷ mmHg), per impedire una perdita di ionizzazione per urto con i gas atmosferici.

Il campione può essere introdotto sotto diverse forme fisiche:

• I gas si trovano già nella forma fisica adatta.
• I solidi e i liquidi vengono prima vaporizzati.
• Nei casi di sostanze poco volatili si ricorre a derivatizzazione.

Per composti solidi il campione viene posto all’estremità di una sonda, che viene introdotta nella camera da vuoto attraverso un ingresso a tenuta. Il campione viene quindi evaporato o sublimato in fase gassosa per riscaldamento. Gas e liquidi possono essere introdotti mediante un sistema a flusso controllato. Se un composto è presente in una miscela, per ottenere lo spettro di massa è più conveniente che i vari componenti vengano dapprima separati (Es. GC-MS e LC-MS). Il vapore ottenuto viene poi mandato alla camera di ionizzazione che si trova a pressione inferiore.

La sorgente

Esistono diversi metodi per ionizzare un composto; così, ad esempio, se una molecola è investita in fase vapore da un fascio di elettroni di notevole energia cinetica si può avere per urto la sua ionizzazione a ione positivo o negativo. In genere gli strumenti sono regolati per lavorare con ioni positivi, i quali possono spontaneamente o per urto decomporsi in una serie di frammenti di massa inferiore e questi a loro volta in altri. Il sistema di ionizzazione svolge un ruolo essenziale nella spettrometria di massa, perché da esso dipende anche il numero, la natura e l’abbondanza dei frammenti molecolari che compaiono nello spettro di massa. Per questo motivo le tecniche utilizzate sono numerose e alcune di esse danno origine a particolari varianti nella spettrometria di massa.

Alcune tecniche di ionizzazione sono decisamente potenti, operano cioè ad alta energia e portano ad una frammentazione spinta (TECNICHE HARD), altre invece operano a bassa energia e generalmente non producono frammentazione (TECNICHE SOFT).

Metodi di ionizzazione

I metodi di ionizzazione si dividono in "hard" e "soft":

• Metodo “hard”:
  • Ionizzazione elettronica (Electron Ionization, EI)
• Metodo “soft”:
  • Ionizzazione chimica (Chemical Ionization, CI)
  • Desorbimento di campo (Field Desorption, FD)
  • Plasma desorption (PD)
  • Bombardamento con atomi veloci (Fast Atom Bombardment, FAB)
  • Ionizzazione/desorbimento laser assistito da matrice (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, MALDI)
  • Ionizzazione a pressione atmosferica (Atmospheric Pressure Ionization); comprende Electrospray Ionization (ESI), Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI), Atmospheric Pressure Photoionization (APPI)

In base al tipo di sorgente utilizzata, la ionizzazione primaria del campione viene realizzata in vario modo; tra le tecniche più utilizzate ricordiamo:

• Impatto elettronico (E.I.)
• Ionizzazione chimica (C.I.)
• Bombardamento con atomi veloci (F.A.B.)
• Ionizzazione/desorbimento con laser assistita da matrice (M.A.L.D.I.)
• Electrospray (E.S.I.)

Più avanti incontreremo le tecniche che studieremo più in dettaglio, ovvero EI, ESI e MALDI.

L'analizzatore

Gli ioni generati in sorgente (generalmente ioni positivi) vengono successivamente accelerati mediante piastre metalliche poste ad un potenziale (negativo) variabile (500-8000 V) detto potenziale di accelerazione ed introdotti in un analizzatore che ha il compito di separarli in base al loro diverso rapporto m/z.

Esistono vari tipi di analizzatore, che possono essere suddivisi in due categorie fondamentali:

• Analizzatori di quantità di moto, sistemi cioè in grado di separare ioni aventi valori diversi del prodotto mv (massa·velocità). Analizzatori di questo tipo sono tutti gli strumenti a deflessione magnetica "B", inclusi quelli combinati con un settore elettrostatico "E".
• Analizzatori nei quali la separazione degli ioni è basata sulla stretta dipendenza dal tempo di uno o più parametri del sistema analizzatore (a tempo di volo TOF = time of flight; a stabilità di percorso: analizzatori quadrupolari "Q", trappola ionica IT); a bilanciamento di energia (ICR = ion cyclotron resonance).

Durante il presente corso di studi studieremo quattro tipi di analizzatori: l’analizzatore a settore magnetico, a tempo di volo, quadrupolo e trappola ionica.

L'analizzatore a settore magnetico

Tale analizzatore basa il suo funzionamento sulla proprietà che mostra uno ione accelerato da un potenziale elettrico V quando passa attraverso un campo magnetico B normale alla direzione dello ione stesso. In tali condizioni, infatti, uno ione accelerato assumerà una traiettoria circolare, il cui raggio di curvatura risulterà proporzionale al suo rapporto m/z (e se z è 1, sarà quindi proporzionale alla sua massa).

Le leggi fisiche che stanno alla base di questo dispositivo sono abbastanza semplici. All’uscita della camera di ionizzazione il fascio di ioni è accelerato attraverso un potenziale V di 6000 – 8000 Volt, assumendo una energia cinetica Ec ¹/2 m ². La quale sarà pari all’energia fornitagli dal campo elettrico zV, per cui:

1/2 m = zV²

Lo ione accelerato quindi acquista energia cinetica a spese del campo elettrico. D’altra parte, gli ioni accelerati, entrando in direzione perpendicolare ad un campo magnetico B saranno soggetti ad una deflessione dovuta al bilanciamento di due forze, la forza centrifuga Fc e la forza centripeta Fm,

Forza centrifuga Fc = m²/r

Forza centripeta Fm = Bzv/r

dove m è la massa dello ione, la sua velocità, z la sua carica, B la forza del campo magnetico ed r il raggio di curvatura assunto dallo ione.

Il bilanciamento di tali forze costringe gli ioni ad assumere una traiettoria circolare all’interno del settore magnetico. Pertanto, in tali condizioni, affinché uno ione possa percorrere il settore magnetico (il cui raggio r è fisso), la sua forza centrifuga dovrà eguagliare la forza centripeta ed il raggio di curvatura della sua traiettoria circolare deve coincidere con il raggio di curvatura del settore magnetico:

m²/v = Bzv/r

Se non ci fosse tale bilancio, lo ione colliderebbe con le pareti dell’analizzatore, non arrivando al rivelatore. Combinando le due equazioni:

1/2 m²/v = zV²

m²/v = Bzv/r

Otteniamo l’equazione finale che descrive il principio di funzionamento di tale analizzatore:

B²r = 2Vz

Tale equazione illustra che, per un dato valore di campo magnetico B e di potenziale di accelerazione V, a ciascun valore del rapporto m/z corrisponde un raggio di curvatura r.

Questa equazione descrive quella parte di ioni la cui traiettoria corrisponde esattamente al raggio di curvatura r del tubo e quindi raggiunge il rivelatore. Lo spettro di massa è prodotto generalmente variando nel tempo l’intensità del campo magnetico B in modo che tutti gli ioni prodotti in sorgente con differente rapporto m/z, possano assumere a determinati valori di B un raggio di curvatura pari a quello del settore magnetico e quindi possano raggiungere il rivelatore passando attraverso una fenditura posta all’uscita del settore magnetico (scansione di campo).

Negli analizzatori a focalizzazione magnetica si parla di settori a singola focalizzazione quando l’analizzatore sfrutta il solo campo magnetico per effettuare la selezione degli ioni in base al rapporto m/z. Questi strumenti non riescono a raggiungere un’elevata risoluzione, ovvero due ioni con valori di m/z molto vicini vengono visti dallo strumento come un unico segnale.

A tal proposito si definisce Potere Risolutivo di uno spettrometro di massa l’abilità dello spettrometro di separare due ioni con valori m/z molto vicini. In particolare, per due ioni di massa/carica m ₁ > m ₂, la risoluzione R sarà:

R = m₁ / (m₁ - m₂)

Generalmente per gli analizzatori magnetici a singola focalizzazione R non supera il valore di 2000-3000. Ciò significa che se all’interno dell’analizzatore con potere risolutivo pari a 2000 sono presenti due ioni con m₁ = 2000 e m₂ = 1999, questi due ioni verranno separati e produrranno due segnali distinti nello spettro di massa. In tal caso infatti, applicando la formula sopra riportata, il valore di R richiesto per separare tali ioni è pari a 2000. Ma se all’interno di tale analizzatore sono ad esempio presenti due ioni con m₁ = 2001 e m₂ = 2000,5, il valore di R richiesto per ottenere due segnali distinti di tali ioni sarà pari a circa 4000, ovvero il doppio di quello che ha effettivamente l’analizzatore magnetico a singolo fuoco. Ciò si traduce nel fatto che questi due ioni verranno “visti” dallo strumento come un solo segnale, con conseguente perdita di informazioni.

I limiti di risoluzione di un settore magnetico sono strettamente correlati al fatto che l’equazione B²r = 2Vz è rigorosamente valida solo se ioni con uguale m/z hanno esattamente la stessa energia cinetica iniziale. In realtà dopo l’accelerazione gli ioni con uguale m/z non hanno tutti la stessa velocità.

Queste differenze di velocità sono viste dall’analizzatore come differenze di massa, producendo nello spettro di massa finale picchi tanto più allargati quanto più ampie sono le distribuzioni di velocità. L’inserimento di un settore elettrostatico tra la sorgente e l’analizzatore magnetico (Analizzatori a doppia focalizzazione) può attenuare notevolmente tale dispersione e aumentare la risoluzione di un fattore fino a 50 volte superiore.

Gli analizzatori a doppia focalizzazione sono composti da un settore elettrostatico, all’interno del quale gli ioni provenienti dalla sorgente sono focalizzati in base alla loro energia traslazionale, e dal settore magnetico, in cui gli ioni sono separati in base al rapporto m/z. Gli ioni con stesso rapporto m/z focalizzati nel settore elettrostatico presentano esattamente la stessa energia traslazionale: per tale motivo, questi analizzatori sono definiti ad alta risoluzione (fino a 150.000).

Rivelatore

Senza un sistema di rivelazione adatto, l’informazione portata da sorgenti ed analizzatori non potrebbe essere registrata. La maggioranza dei rivelatori funzionano ad impatto ionico o per cattura ionica. Tutti i tipi richiedono una superficie che raccolga gli ioni e dove la carica venga neutralizzata sia per la raccolta sia per donazione di elettroni. Si realizza quindi un trasferimento di elettroni ed un flusso di corrente che può essere amplificato ed infine convertito in un segnale registrabile su carta o processabile da un computer. Come collettore e rivelatore degli ioni si usa comunemente un moltiplicatore elettronico, costituito da una serie di elettrodi in cascata.

Quando uno ione arriva sul primo elettrodo questo emette un fascio di elettroni che vanno a colpire il secondo elettrodo, il quale a sua volta emette una quantità maggiore di elettroni e così via. Il risultato è una forte amplificazione del segnale che viene poi digitalizzato ed elaborato infine dal calcolatore dello spettrometro per la presentazione dello spettro di massa.

Lo spettro di massa

Lo spettrometro “consegna” i risultati sotto forma di uno spettro di massa, cioè di una serie di picchi di intensità variabile; la posizione di ogni picco corrisponde ad un determinato valore di m/z. In uno spettro di massa, l’asse delle X riporta valori di rapporto m/z e l’asse delle Y i valori di abbondanza relativa degli ioni analizzati.

In linea di principio z può assumere qualsiasi valore, tuttavia nei comuni processi di ionizzazione si formano prevalentemente ioni monovalenti. L’intensità dei picchi sono espresse in percentuali del picco più intenso, il cosiddetto picco base cui si assegna arbitrariamente il valore 100. Gli spettri prodotti con questa tecnica sono normalizzati, indipendenti dallo strumento impiegato e quindi sono comparabili direttamente. Gli ioni oggetto della forma più comune in spettrometria di massa sono ioni positivi ottenuti ad esempio per rimozione di un elettrone (ionizzazione EI). Lo ione ottenuto per semplice rimozione di un elettrone dalla molecola è detto ione molecolare.

Nei processi di ionizzazione hard oltre alla ionizzazione della molecola e la formazione dello ione molecolare avvengono dei processi di frammentazione (che vedremo successivamente), i quali determinano scissioni di alcuni legami.