Microbiologia

Coniugazione

Desidera coltivare. Pochi batteri (l'1%) possono essere coltivati, in quanto è necessario conoscere:

• Il metabolismo.
• Le esigenze nutrizionali.
• La temperatura.
• Il pH.

Per la coltivazione vengono messi a punto terreni di coltura di due tipi: terreni liquidi e terreni solidi (liquido + agar).

Il terreno liquido non permette di ottenere una coltura pura, serve in questo senso il terreno solido. Fannie Eishelmius Hesse, moglie di un collaboratore di Koch, suggerirà l'utilizzo di Agar per creare terreni solidi.

Vantaggi dell'Agar:

• Rimane solido fino a 80-90°C.
• Una volta liquefatto, rimane tale fino a 45°C.
• Non viene utilizzato dai batteri a scopo nutritivo.
• Non è tossico.

Fondamentale fu anche la scoperta della piastra Petri.

Vi sono differenti tecniche di piastramento:

• Piastramento per striscio.
• Piastramento per diffusione.
• Piastramento per inclusione (Agar liquefatto a 45°C, all'interno del quale si inseriscono.

• Isolamento dei microrganismi.
• Identificazione e studio delle caratteristiche biochimiche.
• Mantenimento in coltura.
• Conteggio dei microrganismi che contaminano alimenti specifici.
• Coltivazione per la produzione di antibiotici, enzimi, tossine, antisieri, vaccini.
• Valutazione dell'attività di preparati farmacologicamente attivi (per esempio antibiotici, ricerca di sostanze inibenti).

Tutti i terreni necessariamente note all'operatore). I terreni complessi possono essere chiamati brodi, se liquidi, o agar nutritivo, se solidi.

I terreni sono classificati anche in base allo scopo in:

• Terreni differenziali permettono di mettere in evidenza la proprietà di un batterio rispetto ad un'altra, ad esempio un terreno che permetta di vedere la fermentazione di uno zucchero: il batterio che lo fermenta sarà di un colore, quello che non lo fermenta di un altro colore.
• Terreni selettivi terreni utilizzati per far crescere un batterio specifico e non altri; ad esempio un terreno con un antibiotico.
• Terreni di arricchimento sono una sottoclasse dei terreni selettivi, utilizzati per selezionare organismi specifici per una determinata funzione partendo da un insieme di microrganismi non caratterizzati.

Terreni sintetici o minimi.

I terreni minimi sono terreni la cui composizione chimica è perfettamente nota.

Scopi:

• Studi sul metabolismo

cellulare.

• Selezione di mutanti biochimici (auxotrofi).
• Dosaggi microbiologici di fattori di crescita.

Mutante auxotrofo E. coli sintetizza tutti e 20 gli amminoacidi (a partire dal glucosio). Un mutante auxotrofo che non sa sintetizzare arginina, ad esempio, non può crescere se nel terreno non è presente l'arginina.

Terreni complessi.

I terreni complessi sono i terreni utilizzati più comunemente; contengono estratto di carne o di lievito e peptoni (caseina o farina di soia parzialmente idrolizzata). Ad esempio il terreno LB ed il TSA sono molto comuni in microbiologia.

Scopi:

• Essendo substrati molto ricchi, consentono una crescita rapida e un'alta concentrazione cellulare.
• Sono usati anche per la crescita di batteri dei quali non si conoscono le particolari richieste nutrizionali.

Con i terreni complessi è possibile ottenere biomassa; nel caso di quelli solidi è possibile utilizzarli per effettuare conte batteriche ed osservare

caratteristiche morfologiche. Non tutti i batteri crescono su terreni complessi, ad esempio per i microrganismi patogeni sono spesso utilizzati il siero di sangue o il sangue. Un terreno molto utilizzato è l'Agar sangue, ovvero un terreno complesso al quale si aggiunge il sangue defibrinato di un cavallo o di un montone. Un altro terreno è "l'Agar cioccolato", in cui al terreno complesso viene aggiunto sangue quando il terreno è ancora caldo (vengono così lisati gli eritrociti e si ha liberazione di emoglobina).

Terreni selettivi.

Scopi:

• Crescita ed isolamento di un particolare tipo di microrganismo.
• Studi di genetica per isolare e distinguere mutanti e ricombinanti anche molto rari.

Condizioni selettive adottate:

• Nutrizionali.
• Aggiunta di particolari inibitori.

Terreni con sali biliari o coloranti come eosina, blu di metilene, fucsina basica inibiscono la crescita dei batteri Gram positivi.

Terreni di arricchimento.

Si basano sul

principio darwiniano della selezione naturale (selezione di un particolare batterio all'interno di un ecosistema).

Scopo:

• Partendo da una popolazione mista al termine si ottiene una popolazione costituita dai microrganismi più adatti ad una determinata condizione sperimentale.

Terreni differenziali.

Scopo:

• Mettono in evidenza particolari attività metaboliche. L'attività metabolica può essere evidenziata dalla formazione di composti colorati, o di un alone intorno alla colonia, come conseguenza del metabolismo cellulare.

Tali terreni non esercitano una pressione selettiva, mettono solo in evidenza alcune caratteristiche dei batteri.

Esempi di attività enzimatiche rilevabili:

• Presenza esonucleasi, nucleasi.
• Fermentazione degli zuccheri (isolamento di mutanti incapaci di utilizzare un determinato zucchero).

Esempio di terreno differenziale: terreno EMB; composto in particolare da triptone, eosina e blu di metilene. Quest'ultimi due sono

utilizzando la scissione binaria. Durante questo processo, il batterio si divide in due cellule figlie identiche. La crescita batterica può essere influenzata da diversi fattori, come la temperatura, il pH, la disponibilità di nutrienti e la presenza di sostanze inibitorie. I batteri possono crescere in diverse forme, come singole cellule, coppie, catene o gruppi. La velocità di crescita batterica può variare a seconda delle condizioni ambientali e del tipo di batterio.attraverso un processo di scissione binaria (divisione del DNA e citochinesi). Alcuni procarioti si dividono per gemmazione o frammentazione. Per ciclo cellulare si intendono tutti gli eventi compresi tra la formazione di una nuova cellula e la successiva divisione cellulare. Crescita microbica. Lo studio della crescita batterica è fondamentale per studiare la fisiologia dei microrganismi. La crescita cellulare è definita come un aumento ordinato dei costituenti cellulari. Con il termine crescita della popolazione si intende un incremento delle cellule di una popolazione microbica. Il numero di cellule originate da una serie di divisioni è uguale a 2^N, dove N è il numero delle divisioni. Il tempo di generazione può essere descritto sia in termini di singola cellula che a livello di colonia; nel caso di una singola cellula è il tempo che impiega il batterio a dividersi; nel caso di una popolazione è il tempo impiegato dalla popolazione a.

raddoppiare di numero. La costante del tasso di crescita è il numero di generazioni nell'unità di tempo. Tale parametro ci dà l'idea della velocità con cui cresce un singolo batterio o una popolazione batterica.

Graficamente: La curva esponenziale di crescita ci fornisce poche informazioni; si utilizza quindi una scala logaritmica: la crescita viene così visualizzata come una retta (si utilizza in particolare un foglio di carta semi log, vedi immagine di destra). Questo permette di confrontare facilmente la velocità di crescita di batteri diversi.

Dalla retta risultante sul foglio di carta semi log inoltre si può calcolare anche il tempo di generazione (si prendono due valori numerici della popolazione, ad esempio 5 e 10, e si valuta il tempo necessario per passare tra i due valori; questo perché il tempo di generazione è il tempo necessario per raddoppiare la popolazione).

Curva di crescita. La curva di crescita

batterica è solo inizialmente caratterizzata da una crescita esponenziale (fase esponenziale: dove le cellule si dividono sempre con lo stesso tempo). Una curva di crescita in una sistema chiuso (si parla di coltura batch, ovvero una coltura in una beuta con terreno che non viene rinnovato) prevede diverse fasi correlate al consumo dei nutrienti e all'accumulo dei prodotti di scarto. Fase di latenza. All'inizio della curva di crescita si nota una fase di latenza, fase durante la quale il numero di componenti della popolazione non aumenta. Si tratta del tempo necessario ai batteri per adeguarsi alle condizioni del terreno. La durata di tale fase dipende: - Dal tipo di inoculo (età, provenienza, danneggiamento dei batteri). - Dalla natura del terreno. La fase di latenza è un esempio di crescita sbilanciata: alcuni componenti sono sintetizzati ed altri no.