Microbiologia

Microbiologia

La microbiologia è lo studio di organismi troppo piccoli per essere studiati ad occhio nudo.

Attività microbiche di interesse umano

• Ambientale
• Medica
• Alimentare
• Industriale
• Biotecnologie microbiche
• Veterinaria
• Agraria

La microbiologia si occupa dei batteri, degli archebatteri (Archea) e di alcuni eucarioti microscopici (funghi e protozoi), ma anche di microrganismi che non hanno organizzazione cellulare, ovvero parassiti intracellulari obbligati che, tecnicamente, vanno considerati "non vivi" (poiché non hanno organizzazione cellulare): virus (dotati di un solo tipo di acido nucleico - DNA o RNA - e proteine), viroidi (parassiti obbligati, formati da RNA nudo), prioni (proteine infettive).

La microbiologia è nata quando è stato possibile osservare tali organismi, ovvero con la scoperta del microscopio. Il primo microscopio fu scoperto dagli olandesi Hans e Zacharias Janssen nel 1590-1595, tuttavia presentava un basso potere risolutivo. Successivamente fu scoperto un microscopio più evoluto da Robert Hooke, il quale comunque non permetteva l'osservazione dei batteri. Questi si poterono osservare grazie a Van Leeuwenhoek, il quale costruì il primo microscopio a potere risolutivo più elevato. Egli era un mercante ed osservando i tessuti vide per la prima volta dei batteri; questa scoperta però innescò un dibattito sulla loro origine, che si prolungò per circa due secoli, inserendosi nella polemica sulla teoria della generazione spontanea, accettata senza discussione nel Medio Evo.

Teoria della generazione spontanea

La teoria della generazione spontanea (abiotica) era stata avanzata da Aristotele (300 A.C.). Aristotele riunì in un trattato le sue osservazioni su molti animali, descrivendone con accuratezza il ciclo vitale; tuttavia l'impossibilità di distinguere l'eccessivamente piccolo o la difficoltà di riconoscere come tali stadi di sviluppo molto diversi (ad esempio lo stadio prima e dopo la metamorfosi), fecero sì che arrivò a conclusioni errate, come quella che prevedeva che le rane si originassero dal fango. Questa teoria ebbe comunque largo seguito.

Francesco Redi, un medico italiano, fece un esperimento per confutare tale teoria. Mise un pezzo di carne in una bottiglia aperta, un secondo pezzo di carne in una bottiglia chiusa con una garza ed un terzo pezzo di carne in una bottiglia totalmente chiusa. Nel barattolo aperto le mosche entravano e, depositando le loro uova, determinavano la produzione di nuove mosche; nella bottiglia con la garza le mosche erano attratte e depositavano le uova solo sopra la garza; nella terza bottiglia non si sviluppava nulla.

Inoltre, al tempo si vedeva che lasciando riposare il brodo per alcuni giorni, esso si intorbidiva a causa della formazione di microrganismi, per cui si pensò che la teoria della generazione spontanea fosse valida almeno per i microrganismi. Spallanzani confutò anche tale ipotesi: prese una bottiglia con brodo, la fece bollire (sterilizzandola) e la lasciò aperta; poi prese un’altra bottiglia, la bollì e la lasciò chiusa. Nella bottiglia aperta si sviluppavano microrganismi, in quella chiusa no.

Negli stessi anni Priestly dimostrò che l'ossigeno è fondamentale per la vita, per cui, prontamente, qualcuno sostenne che nella bottiglia chiusa ermeticamente non crescesse nulla a causa dell’assenza di ossigeno. Nell'800 Pasteur mise fine alla diatriba, dimostrando che i microrganismi provengono dall'esterno, ovvero sono trasportati dall'aria. Egli costruì una bottiglia particolare con un becco a collo di cigno e all'interno mise un terreno, il quale venne sterilizzato facendolo bollire. Chiaramente l'aria passava all’interno del contenitore, in quanto esso è aperto. Succedeva però che tale terreno si manteneva sterile perché per gravità, qualsiasi spora o batterio che entrava nel becco della bottiglia, si depositava nella prima ansa, e non aveva la possibilità di arrivare al terreno, mantenendolo sterile. Come controprova venne ruotato il contenitore e posto a contatto con la parte iniziale del becco dove si fermavano i batteri: il terreno veniva contaminato.

• Padri microbiologia medica: Pasteur e Koch.
• Padri microbiologia ambientale: Vinogradskij e Bejerinck.

La prima dimostrazione diretta del ruolo dei batteri nella malattia deriva dallo studio sul carbonchio effettuato dal medico tedesco Robert Koch. Egli postulò una serie di criteri per dimostrare il rapporto causale tra Bacillus anthracis ed il carbonchio. Questi criteri sono noti come “postulati di Koch”:

1. Il microrganismo deve essere sempre presente in ogni caso di una data malattia, ma deve essere assente negli individui sani.
2. Il microrganismo sospetto deve essere isolato e fatto crescere in coltura pura.
3. Il microrganismo isolato, quando inoculato in un ospite sano, deve riprodurre la malattia.
4. Dall'ospite infetto deve venire nuovamente isolato il medesimo microrganismo.

Domini degli esseri viventi

I tre domini degli esseri viventi sono:

• Bacteria
• Archea
• Eukarya

L'albero filogenetico è stato costruito sulla base dello studio dell'rRNA 16S. I microrganismi sono gli organismi più antichi (la terra ha 4,6 miliardi di anni, i primi batteri erano presenti già 3,7 miliardi di anni fa). Esistiamo grazie ai batteri. Sono ampiamente distribuiti in natura. Sono gli organismi più numerosi: la loro biomassa è superiore a quella di tutti gli altri organismi. Hanno un ruolo ecologico: apporto di ossigeno nell'atmosfera, decompositori della materia organica, responsabili di cicli biogeochimici. Sono responsabili di malattie dell'uomo, di piante e animali ma anche utili per la nostra salute. Utili per l'industria alimentare, farmaceutica e biotecnologica.

Collocazione temporale dei principali eventi nella storia della vita sulla terra

Batteri fossili sono stati individuati in strati laminari di roccia sedimentaria detta stromatolite. Avevano strutture che si ritrovano nei cianobatteri, quindi probabilmente erano già dei cianobatteri. Gli stromatoliti sono ancora presenti, in piccola parte, e sono il risultato dei depositi di carbonato di calcio rilasciato dai batteri.

I batteri: principali morfologie cellulari

La forma dei batteri viene spesso riferita a tre modelli principali:

• Sfere (cocchi)
• Bastoncelli (bacilli)
• Spirali

Tuttavia le variazioni sulle forme principali sono moltissime.

Cocchi

I batteri sferici prendono il nome di cocchi; si possono dividere su un solo piano: se il piano di divisione è sempre uguale si ottengono dei batteri associati in coppie (diplococchi) o associati a formare delle catene lineari (streptococchi). Se invece i 2 piani di divisione si alternano, si possono formare dei gruppi di 4 cellule (tetradi) o, se le divisioni continuano, si possono formare dei foglietti di batteri. Se invece si alternano 3 piani di divisione si formano pacchetti di 8 cellule dette sarcine. Nel caso in cui i piani si alternano in modo casuale si formano invece gli stafilococchi. Inoltre, vi possono essere variazioni sulla struttura di base di forma sferica. Le sfere possono essere irregolari, appiattite su un lato, di forma conica ad una estremità, possono avere un bordo scavato, essere lobati o avere forme di acino.

Bastoncelli

La forma più comunemente osservabile tra i procarioti è cilindrica, questi batteri prendono il nome di bacilli. Le estremità di essi possono essere arrotondate, appuntite, squadrate, rigonfie; possono essere anche ramificati.

Spirali

Una forma meno comune tra i batteri è quella a spirale. Una cellula spiraliforme molto corta è detta vibrione (ad esempio, il colera). Batteri spiraliformi più lunghi e rigidi sono chiamati spirilli. Batteri spiraliformi lunghi e flessibili, capaci di modificare la loro forma durante il movimento, sono detti spirochete. I batteri a spirale possono variare di forma, avere una forma a ciambella o elicoidale (helicobacter). Esistono anche batteri a forma di stella, piatti e quadrati ecc.

Procarioti pluricellulari

Esistono batteri che, osservati al microscopio, sono molto simili a funghi, per questo sono detti attinomiceti. Si tratta di batteri bastoncellari che formano filamenti lunghi e ramificati chiamati ife. Possono essere considerati pluricellulari perché all'interno di una colonia vi sono batteri specializzati a svolgere una determinata funzione: alcune ife crescono sulla superficie del terreno (micelio aereo) altre invece crescono nel terreno (micelio del substrato). Molti cianobatteri hanno un'organizzazione pluricellulare chiamata tricoma. Un tricoma può contenere fino a 100 o più cellule che agiscono in modo concertato per muoversi o svolgere altre attività. Alcune di queste cellule sono in grado di svolgere funzioni specializzate: le eterocisti sono il sito di fissazione dell'azoto, gli acineti sono cellule quiescenti in grado di sopravvivere in condizioni avverse. In altre parole, quando vi è specializzazione cellulare si parla di procarioti pluricellulari e non monocellulari.

Rapporto superficie/volume

Le dimensioni ridotte dei batteri sono convenienti per lo scambio con l'ambiente esterno. I batteri più piccoli hanno un diametro di 100-200 nm, alcune spirochete hanno una larghezza di 500 micrometri. Il batterio Escherichia coli ha un diametro di 1-1,5 micrometri ed è lungo da 2 a 6 micrometri. È necessario considerare il rapporto superficie/volume: tanto più grande è il rapporto tanto più sono facilitati gli scambi ed è per questo che i batteri sono piccoli. La maggior parte dei batteri si trova nell'ordine dei micron. Esistono anche batteri giganti, di dimensioni molto maggiori, come ad esempio Epulopiscium fischelsoni. Batteri di dimensioni notevoli utilizzano adattamenti per mantenere un rapporto superficie/volume adeguato agli scambi necessari all'organismo. Nel caso di E. fischelsoni la membrana è molto involuta, quindi la superficie è molto grande, ciò favorisce il trasporto di nutrienti. Un altro batterio gigante è Thiomargarita namibiensis. Esso è presente nelle coste della Namibia, è un batterio sferico con un diametro compreso tra 100 e 750 micron (è l'unico batterio visibile ad occhio nudo). Il suo volume è più di 100 volte di quello di E. fishelsoni. Circa il 98% della cellula è occupato da un vacuolo contenente nitrati. Il citoplasma è relegato in un sottile strato addossato alla membrana cellulare: il suo sottile spessore favorisce una diffusione adeguata delle sostanze.

Struttura procariotica

La differenza fondamentale con gli eucarioti è l'organizzazione del materiale genetico: nei procarioti esso è privo di membrana ed occupa tutto il citoplasma, mentre negli eucarioti è localizzato e rivestito da doppia membrana, la membrana nucleare. Il nucleoide, contenente il materiale genetico, tende ad occupare gran parte del citoplasma. Sono presenti nel citoplasma anche corpi di inclusione e ribosomi, ma non sono presenti gli organelli tipici delle cellule eucariotiche (mitocondri, reticolo endoplasmatico, Golgi etc.). È presente una membrana citoplasmatica. All’esterno della membrana vi è una parete batterica. All’esterno della parete può essere presente un ulteriore strato di natura polisaccaridica compatto, detto capsula. Molti presentano un flagello per il movimento. I procarioti non sono meno organizzati delle cellule eucariotiche ma sono organizzati differentemente.

Membrana citoplasmatica

È fondamentale per:

• Trattenere citoplasma ed impedire la fuoriuscita dei componenti cellulari presenti all’interno
• Punto di contatto con l’esterno

Funzioni (maggiori che negli eucarioti):

• Barriera permeabile in modo selettivo: consente il passaggio di alcune molecole ed ostacola il passaggio di altre
• Regola il passaggio di sostanze che spontaneamente non attraversano la membrana, grazie a sistemi di trasporto
• Nei batteri è la sede di importanti processi metabolici: respirazione e fotosintesi (che nelle cellule eucariotiche avvengono nelle membrane del mitocondrio e dei cloroplasti)
• Sede della conservazione dell’energia cellulare, si parla di forza protomotrice, la quale è dovuta ad un accumulo di H⁺ all’esterno della cellula e di OH^- all’interno, ciò genera un potenziale elettrico che viene sfruttato dai batteri
• Sede di sintesi di lipidi e costituenti della parete
• Sede dei recettori della chemiotassi. I batteri sono in grado di analizzare l’ambiente in cui si trovano grazie alla presenza dei chemiorecettori

Struttura della membrana

I costituenti di base sono i fosfolipidi, molecole anfipatiche (con testa idrofila e coda idrofobica). Sono costituiti da una struttura di base rappresentata dal glicerolo, del quale due ossidrili sono connessi mediante legame estere ad acidi grassi, mentre un ossidrile è legato ad un sostituente, ad esempio l’etanolammina. Nella membrana sono presenti anche proteine integrali, proteine periferiche, zuccheri (connessi ai fosfolipidi o alle proteine). Una caratteristica delle membrane batteriche è l’assenza degli steroli (non vi è colesterolo), i quali sono sostituiti da molecole strutturalmente simili detti opanoidi. Inoltre, un’altra caratteristica, è la presenza di una maggiore quantità di proteine presenti all’interno della membrana rispetto agli eucarioti (vi sono le proteine necessarie alla fotosintesi e alla respirazione). Circa il 50% della membrana è costituita da proteine.

Gli opanoidi

Gli opanoidi hanno una struttura molto simile agli steroli. Sono presenti in quantità enormi nei sedimenti organici; sono le molecole organiche più abbondanti sulla terra. Si stima che la quantità di opanoidi sia pari quasi alla massa del carbonio organico di tutti gli organismi viventi (10^11-12 tonnellate). La funzione degli opanoidi è quella di stabilizzare la membrana batterica. Esistono alcuni batteri che fanno eccezione, tra cui i micoplasmi, in cui sono presenti gli steroli. Tali organismi non hanno parete, sono circondati esclusivamente da membrana plasmatica. Non sono in grado di sintetizzare steroli, li recuperano dalle cellule che infettano. Esistono anche batteri che sintetizzano steroli, ma sono chiaramente un’eccezione. Gli opanoidi sono molecole planari, rigide, che stabilizzano le code idrofobiche dei fosfolipidi.

Le membrane degli archeobatteri

Le membrane degli archeobatteri differiscono da quelle dei bacteria e degli eucarya. La molecola di glicerolo è legata ad idrocarburi a catena ramificata (formati da unità di isoprene), mediante legami etere e non estere. Generalmente gli idrocarburi a catena ramificata sono formati da 20 atomi di carbonio. Negli archeobatteri generalmente si formano delle membrane bi-stratificate di dieteri. Tuttavia si può formare anche un monostrato di tetraeteri, formati ciascuno da due molecole di glicerolo legate tra loro da una singola molecola. Queste membrane si ritrovano in archeobatteri estremofili, ovvero archeobatteri che vivono in condizioni estreme, soprattutto per quanto riguarda le temperature. Si possono anche trovare situazioni intermedie, con membrane in parte monostratificate ed in parte bistratificate.

Parete delle cellule procariotiche

In ambienti ipotonici l’acqua tende ad entrare all’interno delle cellule per il fenomeno dell’osmosi: la cellula si gonfia e può anche scoppiare. Se consideriamo un batterio con sola membrana plasmatica questo presenta una concentrazione interna di soluti maggiore rispetto a quella esterna. Digerendo la parete batterica con penicillina o lisozima, ad esempio, si può ottenere una cellula circondata esclusivamente da membrana (si parla di protoplasto o sferoplasto, che presenta una forma tonda, mentre la parete fornisce la forma caratteristica del batterio). La cellula si mantiene in tal modo solo se si trova in un ambiente isotonico. Se invece si trova in un ambiente ipotonico l’acqua entra internamente ed il batterio va incontro a lisi. La funzione principale della parete è quella di proteggere i batteri dalla lisi osmotica. Inoltre conferisce la forma alla cellula ed una certa protezione verso sostanze tossiche e rappresenta il sito di azione di numerosi antibiotici.

Colorazione di Gram

La colorazione di Gram fu messa a punto dal medico danese Gram, e permette di distinguere batteri Gram-positivi e Gram-negativi. Questi due tipi di batteri hanno un’organizzazione diversa della parete. Il primo passaggio per tale colorazione è la fissazione: si pone un campione di batteri sul vetrino e li si fissa tramite calore o trattamento chimico; nel primo caso, il vetrino viene passato sulla fiamma del becco Bunsen, ciò uccide i batteri ma consente di farli attaccare ad esso. Successivamente si aggiunge il colorante cristal-violetto, che entra nei batteri e li colora di violetto. Viene poi utilizzata la soluzione di Lugol, definita mordente, la quale ha la funzione di fissare il colorante nella cellula batterica (senza il Lugol, fornendo acqua il colorante esce) mediante la formazione di un complesso iodio-cristal violetto. A tal punto ancora non vi sono differenze tra batteri Gram-positivi e negativi. Successivamente si utilizza una soluzione di alcool etilico/acetone (1:1), un decolorante. Nei Gram-positivi il colorante viene trattenuto all’interno, mentre nei Gram-negativi il colorante viene completamente lavato. Successivamente si aggiunge la safranina, un ulteriore colorante che permette di visualizzare i batteri Gram-negativi.

Peptidoglicano (mureina)

Il peptidoglicano è un eteropolimero di amminozuccheri acetilati (acido N-acetilmuramico e N-acetilglucosammina, abbreviati NAM e NAG), legati tra loro con legame glicosidico beta 1→4. Connessi al NAM vi sono L-alanina, D-acido glutammico, acido meso-