Microbiologia

Microbiologia

Si occupa dello studio di piccoli organismi non visibili ad occhio nudo e di come questi si rapportano con l'uomo. In particolare, si occupa del ruolo che questi hanno nelle malattie.

Principali settori della microbiologia

• Batteriologia
• Virologia
• Micologia
• Protozoologia

Nasce con la scoperta del microscopio; in particolare, Van Leeuwenhoek osservò i primi "animalcules" (batteri). La teoria della Generazione spontanea, un'antica teoria, affermava che gli organismi viventi generano spontaneamente da materiale non vivente. Ad esempio, si pensava che le rane originassero dal fango e le mosche dalla carne. Tuttavia, questa teoria fu confutata da Francesco Redi, il quale osservò due barattoli: uno aperto, nel quale comparvero delle larve, e uno chiuso in cui non c'erano. Nel barattolo aperto c'erano larve perché erano state deposte le uova. Nel 1800, Pasteur dimostrò che le larve sono presenti nell'aria: versando del terreno non sterile in una fiasca, modellando il collo con il fuoco, sterilizzando il terreno con il calore e forzando l'aria fuori dall'estremità aperta, la polvere e i microrganismi restano intrappolati nella piega, così il liquido resta sterile anche per molti anni.

Microbiologia: rapporti ospite/parassita

Quando si parla di microrganismi commensali, ci si riferisce a quelli che costituiscono la flora normale, cioè quella che normalmente abita nel nostro organismo. Inoltre, le mucose e la cute impediscono la colonizzazione da parte di patogeni, fenomeno noto come interferenza batterica. Le malattie correlate ai microrganismi patogeni si chiamano infezioni. È opportuno fare alcune distinzioni tra i termini principali usati in microbiologia:

• Contagio: possibile trasmissione di germi
• Contaminazione: apporto o presenza di germi su una superficie
• Infezione: superamento delle barriere dell'ospite
• Malattia: replicazione di germi nell'ospite con alterazione della sua omeostasi

Le infezioni sono le conseguenze più comuni della mancata cura di una ferita o di una patologia. Esse possono essere di diversa natura:

1. Endogene: quando si parla di abnorme espansione batterica che costituisce la normale flora microbica. Oppure è un trasferimento di batteri della flora microbica in siti del corpo normalmente sterili.
2. Esogene: i microrganismi provengono dall'ambiente esterno come materiali inanimati, animali infetti, esseri umani infetti.
3. Vie di trasmissione: ad esempio, ingestione di alimenti o bevande contaminate, inalazione di batteri o virus presenti nell'aria, contagio sessuale, inoculazione diretta nei tessuti o nel sangue.
4. Ospedaliere: infezioni che non erano presenti nel paziente al momento del ricovero. I fattori di rischio possono essere i sondini, i cateteri, gli antibiotici, ecc.

Caratteristiche dei microrganismi

• Patogenicità: capacità di un microrganismo di causare malattia
• Virulenza: grado di patogenicità
• Opportunismo: capacità di causare malattie solo in condizioni di aumentata suscettibilità

In particolare, Robert Koch stabilì alcune patologie per determinare le eziologie delle malattie infettive:

1. Determinato germe deve essere sempre presente nelle lesioni.
2. Deve essere possibile isolare il germe in coltura pura.
3. Inoculazione del germe animale deve riprodurre la malattia.
4. Dall'animale inoculato si deve poter isolare lo stesso germe.

Batteri

Sono esseri unicellulari che si replicano per divisione binaria. Hanno nuclei primordiali e DNA extracromosomico: sono cellule procariotiche. La loro parete cellulare è formata da peptidoglicani. Si dividono per:

• Forma:
  • Cocchi
  • Stafilococchi
  • Streptococchi
  • Batteri sporigeni (Bacillus, Clostridium)
  • Flagellati
• Struttura:
  • Essenziali: cromosomi, citoplasma, ribosomi, parete cellulare
  • Accessorie: granuli, plasmidi, flagelli, pili, capsula

Membrana citoplasmatica

Costituita da doppio strato fosfolipidico, è sede di citocromi ed enzimi. Costituisce una barriera idrofobica impermeabile alla maggior parte delle molecole idrofile. Esistono sistemi di trasporto che permettono di trasferire i nutrienti o le scorie dentro o fuori al citoplasma. Fornisce supporto agli enzimi che agiscono nella biosintesi del DNA.

Parete cellulare

Formata da peptidoglicano, è rigida e dà la forma al batterio. Il peptidoglicano è formato da due carboidrati azotati: NAM e NAG tenuti insieme da legame beta 1,4. Queste catene sono legate da ponti che possono essere diretti (Gram +) o mediati (Gram -). I Gram+ e Gram- assumono colore diverso a seconda del numero di peptidoglicani. Il peptidoglicano inoltre dà rigidità alla cellula in quanto impedisce la lisi in risposta a variazioni della pressione osmotica. Grazie al lisozima la parete viene digerita ed il batterio esplode. Inoltre, ha attività pirogena e protegge la cellula da sostanze tossiche.

Membrana esterna

Struttura bistratificata asimmetrica composta da lipopolisaccaride (LPS). In sostanza, è una barriera per antibiotici, spessa e difficile da penetrare. Attiva il nostro sistema immunitario. Il LPS è composto da un lipide complesso, il lipide A, al quale è attaccato un polisaccaride costituito da un core e una serie terminale di attività ripetute. Il lipopolisaccaride rappresenta l'antigene principale della cellula batterica, antigene O. Quando si parla di batteriemia si intende la presenza di batteri nel sangue per infezioni. Con sepsi si intende la presenza in circolo di massiccia concentrazione di batteri che induce una risposta infiammatoria. Infine, con shock endotossico si intende una vasodilatazione generalizzata, trombosi e disfunzioni.

Micobatteri

Sono batteri alcool-resistenti, caratterizzati da cere e lipidi che ricoprono i peptidoglicani. Sono difficili da colorare e resistono agli antibiotici. Per identificare il tipo di batterio si usa la colorazione a caldo di Gram: si inizia con il processo di fissazione dei batteri, un processo di colorazione al cristalvioletto. Dopo un po' di tempo si inizia il processo di lavaggio usando una soluzione allo iodio che serve a fissare la prima colorazione. A questo punto inizia un processo di decolorazione a base di alcool.

Per i micobatteri invece la colorazione è chiamata Ziehl-Neelsen:

1. Strisciare il campione in esame su un vetrino portaoggetti, fissarlo con colore e coprirlo con carta da filtro.
2. Applicare delle gocce di fucsina alla carta da filtro.
3. Scaldare il vetrino fino a evaporazione ma senza farlo seccare.
4. Decolorare con soluzione alcolica fino a quando non scompare il colorante.
5. Eseguire la colorazione di contrasto blu.
6. Esaminare al microscopio: i micobatteri trattengono la fucsina e quindi appaiono rosati al microscopio.

Capsula

Costituita da materiale extracellulare sintetizzato da enzimi presenti sulla superficie cellulare. È uno strato addensato e ben definito intorno alla cellula. Contribuisce al potere invasivo dei batteri in quanto è:

• Antifagocitaria
• Conferisce adesività
• Assorbe notevoli quantità di alcuni antibiotici impedendone l'arrivo

Pili

Sono appendici proteiche che ancorano e fanno aderire il batterio, sono più sottili dei flagelli e non hanno struttura avvolta.

Flagelli

Servono a far muovere i batteri e sono formati da subunità proteiche.

Fattori di virulenza

• Capsula: protegge dalla fagocitosi
• Enzimi coagulasi: favoriscono la diffusione del batterio
• Esotossine: tossiche per particolari distretti. Le hanno sia i Gram+ che i Gram-
• Endotossine: febbre ed ipotensione. Le hanno solo i Gram-

Esotossine vs Endotossine

Spore batteriche

Sono forme di sopravvivenza in condizioni sfavorevoli per la vita dei batteri. Restano vitali in condizioni estreme (alta temperatura, presenza di detergenti) e per lunghissimo tempo. Le spore sono resistenti in quanto hanno una parete esterna particolarmente spessa ed impermeabile. È presente acido dipicolinico che stabilizza i ponti disolfuro ed impedisce la denaturazione delle proteine. Originano con la sporulazione:

• Duplicazione cromosoma
• Formazione setti
• Altri processi
• Formazione spora

La spora viene rilasciata dal batterio, poi si va incontro alla germinazione, cioè il passaggio da spora a batterio:

• Reidratazione delle spore, con diminuzione di acido dipicolinico
• Forma vegetativa

Le spore sono difficili da eliminare perché, a differenza dei batteri, sopravvivono ad alta temperatura. Per eliminarle bisogna usare la tecnica di sterilizzazione: 121° per 15 minuti. La sterilizzazione può avvenire per metodi fisici: quando il calore è secco (con stufe a secco) a 160° per 2 ore, umido (autoclave) a 121° per 15 minuti, denatura le proteine ed inattiva gli enzimi, pastorizzazione veloce, a 72° per 15 secondi, oppure lenta a 63° per 30 secondi. Quest'ultima tecnica non altera le proprietà dei cibi. La filtrazione per liquidi che non possono essere riscaldati. Metodi chimici: con agenti antimicrobici che uccidono i microrganismi senza lisi (battericidi), uccidono i microrganismi con lisi (batteriolitico), come ad esempio la penicillina, inibiscono la crescita (batteriostatico), disinfettanti che uccidono i microrganismi e vengono usati per gli oggetti; infine gli antisettici che uccidono i microrganismi e sono per gli esseri viventi.

Crescita batterica

La crescita batterica avviene per scissione binaria, che spesso è influenzata dall'ambiente in cui vivono.

Fasi della scissione binaria

1. La cellula si allunga e il DNA si replica.
2. Si duplica il cromosoma batterico (due copie uguali del cromosoma) che migrano ai poli opposti.
3. Invaginazione centrale ed unione delle membrane al centro della cellula: si forma il setto trasverso.
4. Avviene separazione e scissione.

Fattori condizionanti la crescita microbica

• Fattori nutrizionali:
  • H₂O: fattore indispensabile per le reazioni chimiche
  • Macronutrienti: servono in grandi quantità, come Carbonio, Azoto, Fosforo, Zolfo ecc.
  • Micronutrienti
  • Fattori di crescita come vitamine, aminoacidi, nucleotidi

Crescita batterica e ATP

I batteri prendono energia dall'ATP prodotta dalla respirazione aerobica, in cui si producono 36 molecole di ATP; oppure anaerobica, in cui non viene usato l'ossigeno, si producono 2 molecole di ATP; infine abbiamo la fermentazione, che può usare oppure no l'ossigeno: in questo caso l'acido piruvico viene convertito in altri composti che hanno già energia. Esistono diverse fasi di crescita batterica:

1. Fase di latenza: periodo in cui le cellule si adattano al nuovo ambiente. Si formano enzimi e prodotti intermedi del metabolismo.
2. Fase esponenziale: velocità di crescita è uguale alla variazione del numero di cellule o della massa per unità di tempo (v=N/t). La velocità varia da un microrganismo all'altro.
3. Fase stazionaria: esaurimento dei nutrienti ed accumulo di prodotti tossici che provoca l'arresto della crescita. Alcune cellule crescono mentre altre muoiono; questi due processi sono bilanciati in modo che non vi sia accumulo di cellule.
4. Fase di declino o morte: diminuzione della conta vitale, con possibile lisi.

Coltivazione di batteri

Richiede l'utilizzo di 'terreni' con cui si cerca di produrre artificialmente un ambiente in grado di soddisfare le esigenze metaboliche. Esistono terreni liquidi o solidi. Il materiale solido è chiamato agar, di cui 1-2% è sciolto a caldo (t>80°). Dopodiché si gelifica con il raffreddamento, non è tossico o degradato dai batteri ed è una superficie adatta per la replicazione. I terreni liquidi sono i brodi. In questi terreni i batteri crescono in colonie che vengono generate da una singola cellula vitale. Esistono diversi tipi di terreno:

• Comuni: come gli agar comuni
• Arricchiti: agar sangue, agar cioccolato
• Selettivi: terreni con antisettici o antibiotici
• Differenziali: permettono di evidenziare particolari caratteristiche metaboliche

Caratteristiche metaboliche dei batteri

• Batteri aerobi: crescono in presenza di ossigeno
• Batteri anaerobi: muoiono in presenza di ossigeno
• Batteri microaerofili: crescono meglio con poco ossigeno e il 5% di CO₂

Provette con brodo tioglicolato (agente riducente che elimina O₂ riducendolo ad acqua)

• Aerobi obbligati: sono presenti solo in superficie
• Anaerobi: solo sul fondo
• Aerobi facoltativi: crescono sia con O₂ che senza O₂, quindi lungo tutta la provetta
• Microaerofili: a distanza dalla zona maggiormente ossigenata
• Aerotolleranti: lungo tutta la provetta

Effetto della temperatura sulla crescita

Per ogni organismo è possibile stabilire:

• Temperatura minima: al di sotto della quale non si ha crescita
• Temperatura ottimale: alla quale si ha la massima velocità di crescita
• Temperatura massima: al di sopra della quale non si ha crescita

Esistono alcuni batteri chiamati psicotolleranti che sono capaci di crescere intorno agli 0°C, ma hanno la temperatura ottimale tra 20-40°C.

Crescita secondo pH

Ogni organismo cresce in un determinato intervallo di pH all'interno del quale possiamo individuare il pH ottimale. Questo pH è di solito compreso tra 5-9.

• Acidofili: pH ottimale di crescita molto basso, tra 2-5
• Alcalofili: pH ottimale di crescita molto elevato, vicino al 10

Sistemi tampone: in una cultura il pH può modificarsi durante la crescita a seguito delle reazioni metaboliche che consumano o producono sostanze acide o basiche. Le sostanze tampone devono essere addizionate al terreno di coltura per mantenere il pH costante. Il pH è una funzione logaritmica: la variazione di una unità di pH corrisponde ad una variazione di 10 volte della concentrazione di ioni idrogeno.

Gli effetti osmotici sulla crescita microbica

• H₂O è uno dei principali fattori che influenzano la crescita microbica.
• La disponibilità dell'acqua è in funzione delle concentrazioni di soluti disciolti nell'acqua.
• La disponibilità dell'acqua è espressa come attività dell'acqua, che è il rapporto tra la pressione di vapore dell'aria in equilibrio con una sostanza/pressione di vapore dell'acqua pura.
• Di solito il citoplasma dei batteri ha una concentrazione di sali più elevata dell'ambiente esterno. Per osmosi, l'acqua penetra all'interno della cellula: equilibrio idrico positivo.
• La maggior parte dei microrganismi è incapace di vivere in ambienti in cui l'attività dell'acqua è molto bassa, in quanto si disidratano.
• Alotolleranti: organismi che sopportano una riduzione di attività dell'acqua ma crescono meglio in assenza di soluti aggiunti.
• Alofili: organismi che possono vivere in condizioni di elevata salinità.

In condizione di bassa attività dell'acqua, i microrganismi possono solo ottenere acqua dall'ambiente alzando la concentrazione di soluti al loro interno.

Antibiotici

Sostanze di origine naturale che inibiscono o uccidono i batteri e la loro replicazione. Possono essere prodotti dai miceti o dai batteri stessi. In natura servono alla specie che li produce per limitare la crescita di altre specie concorrenti quando le risorse alimentari sono limitate. I chemioterapici sono sostanze di attività antibatterica prodotta per sintesi chimica. Uno dei primi antibiotici scoperti fu la penicillina, scoperta da Fleming quando fece su un terreno di coltura un preparato di batteri ai quali diede questa sostanza: egli osservò che intorno alla colonia non crescevano più batteri ma anzi c'era un alone, questo voleva dire che i batteri non si attaccano e quindi che la penicillina inibisce la replicazione batterica.

Gruppi di antibiotici divisi per meccanismo di azione

• Agiscono sulla parete cellulare, come la penicillina.
• Agiscono sulla membrana citoplasmatica, come le poliximine.
• Agiscono sulla sintesi e sulla funzionalità degli acidi nucleici, come rifampicina.
• Agiscono sulla sintesi proteica a livello di trasduzione.

Effetti collaterali

• Selezione dei batteri resistenti
• Sensibilizzazione allergica del paziente
• Effetti tossici

Resistenza agli antibiotici

Selezione dei batteri, già presenti in coltura o nel paziente, portatori di mutazioni che conferiscono resistenza. Origina da mutazioni spontanee in natura. Il meccanismo è semplice: il batterio produce enzimi che degradano l'antibiotico, ad esempio la penicillasi inattiva la penicillina attraverso l'anello beta-lattamico. Oppure si può verificare un'alterazione dell'antibiotico.