Microbiologia

Microbiologia

Introduzione ai batteri e ai virus

Batteri = cellule procarioti. I virus non sono cellule e hanno bisogno di una cellula per moltiplicarsi; sono parassiti obbligati e non possono vivere al di fuori di una cellula.

L'importanza dei microbi

La vita sulla terra sarebbe impossibile senza microbi. I microrganismi che colonizzano l'uomo, chiamati microbiota (complesso di microrganismi che colonizza il nostro corpo), partecipano al metabolismo degli alimenti (es. lattobacilli fondamentali per la digestione del latte e degli zuccheri complessi, altri producono vitamine come la K), forniscono fattori di crescita essenziali, ci proteggono da invasioni di altri organismi (competizione) e stimolano la risposta immunitaria (con la loro presenza attivano in continuazione le cellule del sistema immunitario tenendole sveglie in modo che possano rispondere velocemente alle sollecitazioni di altri batteri).

Microbiota e patogenicità

Microrganismi utili in particolari condizioni possono diventare patogeni (es. E. Coli è commensale ma causa molte malattie cfr. cistite). La malattia è sempre l’esito di un equilibrio che si rompe. “Flora batterica” = microbiota. Il microbiota cambia nel corso della vita.

Il primo incontro con i batteri

Il primo incontro del bambino con i batteri è al momento del parto. Precedentemente il bambino vive in ambiente sterile (placenta) e la sua cute viene colonizzata al momento del parto dai batteri della mamma.

Cambiamenti nel microbiota

Il microbiota cambia durante la vita, addirittura due persone che vivono a stretto contatto hanno microbiota simile, e la contaminazione con ciò che ci è vicino avviene anche con animali.

Fattori che influenzano il microbiota

• Ospedalizzazione: composizione batterica degli ambienti molto particolare, grande uso di antibiotici. Con tre giorni di ospedale il microbiota cambia completamente!
• Terapie antibiotiche: il microbiota è composto da migliaia di microbi, alcuni sensibili all’antibiotico per cui qualche famiglia viene distrutta e ci vogliono settimane per ripristinare il microbiota.
• Uso indiscriminato di disinfettanti

Dimensioni in microbiologia

• Cellula eucariotica: 10-15 micron
• Batterio: 100 nm e 1 micron
• Virus: piccolissimi, nm

Caratteristiche delle cellule procariote e eucariote

Le cellule eucariotiche vivono organizzate in tessuti, i microrganismi vivono nell’ambiente in modo autonomo. Devono essere capaci di assumere autonomamente sostanze chimiche dall’ambiente, devono potersi riprodurre in modo autonomo, devono potersi differenziare in risposta a degli stimoli esterni (evolversi) e devono poter comunicare tra loro. Sono organizzati come comunità. Producono sostanze che servono da segnali per altre cellule.

Cellula procariotica

Caratterizzate da un nucleo non racchiuso in una membrana. Nella cellula eucariotica il messaggero trascritto nel nucleo deve arrivare al ribosoma che si trova nel citosol. Non avere la barriera è un vantaggio evolutivo. I messaggeri appena trascritti incontrano immediatamente i ribosomi per la traduzione in proteine. Meccanismo primordiale semplice, efficiente e veloce per fare proteine. Mancano però molti di quei meccanismi di controllo, traffico dei messaggeri attivi nelle cellule eucariotiche. Meccanismo nei batteri veloce ma può fare molti errori.

Diversità tra cellule procariotiche ed eucariotiche

Dimensioni e diversa organizzazione del nucleo e diverse strutture citoplasmatiche, diversità metaboliche e riproduttive con la cellula eucariotica.

Strutture procariotiche

• Nucleoide
• Organelli (nel citosol)
• Ribosomi (differenti da quelli della cellula eucariotica che sono legati al RE)

NB: la cellula eucariotica ha un sistema vescicolare efficiente per il trasporto delle proteine.

Plasmidi e funzioni cellulari

Plasmidi: DNA extracromosomiale (che hanno oltre al DNA contenuto nel cromosoma) che serve a dare delle caratteristiche di adattabilità. Se un batterio viene trattato con antibiotici utilizza questo DNA per produrre proteine per proteggersi. Sono caratteristiche aggiuntive che possono conferire caratteristiche di patogenicità o resistenza.

Mitocondri e funzioni batteriche

NON TROVIAMO: Mitocondri: molto sviluppati nelle cellule eucariotiche. Nella membrana dei mitocondri si trovano gli enzimi della catena respiratoria deputati alla produzione di ATP. La cellula batterica non necessita di mitocondri, funge in sé da mitocondrio, producendo ATP.

Biotecnologia e OGM

Alcuni OGM vengono utilizzati per la produzione di farmaci. Molte molecole non vengono prodotte da sintesi chimica ma per via biotecnologica: prodotti inserendo nei batteri dei geni che producono una certa proteinafarmaci tumorali biologici.

Cellule procariotiche e loro struttura

Citoplasma

• Genomaacidi nucleici, informazione genetica (minore di quello eucariotico), TUTTO CODIFICANTE, non contenuto in una membrana 'nucleoide'.
• Ribosomi deputati alla sintesi proteica
• Trascrizione e traduzione avvengono CONTEMPORANEAMENTE. (Negli eucarioti avvengono uno dentro e uno fuori la membrana, sono fisicamente separati e non avvengono contemporaneamente).

Parete batterica, caratteristica dei procarioti. Protezione da attacchi ambientali (pressione..) ed è importante per la scissione/divisione batterica.

Flagello

CITOPLASMA costituito per la maggior parte da acqua. Acidi nucleici (DNA, RNAribosomiali, RNAtransfer), enzimi, acidi e ioni inorganici e tutto ciò che serve per il metabolismo batterico.

RIBOSOMIstrutture che consentono di tramutare RNAmessaggero in RNArib. Forma indicata con 70S (S sta per coefficiente di sedimentazione, fu visto che procarioti sedimentavano a 70S da chi li estrasse per la prima volta; eucarioti sedimentano a 80S).

Formil-metionina (f-Met) è il primo amminoacido che troviamo SEMPRE nei procarioti. Tripletta STOP interrompe il processo perché non è codificante, viene rilasciata la catena peptidica. Andrò poi incontro a un suo folding per prepararsi all’attività per cui è stata codificata.

Genoma batterico

GENOMA BATTERICOsingola molecola di DNA bicatenario, circolare a doppia elica. Zone dense di materiale chiamate nucleoide. Ausilio di proteine iston-like (assomigliano ma non sono uguali agli istoni) che assistono la conformazione finale, ripiegamenti del genoma batterico che si avvolge. Deve occupare poco spazio. In questa conformazione il genoma non è trascrizionalmente attivo, non è leggibile. Enzimi come la DNA topo isomerasi e girasi aprono i superavvolgimenti laddove serva per trascrivere esattamente quei geni necessari al metabolismo batterico.

E. Coli è la specie maggiormente studiata per i gram negativi e Bacillus per i gram positivi. CROMOSOMA 4 milioni di paia di basi circa.

Plasmidi

PLASMIDI dimensioni minori rispetto al cromosoma. Conferisce al batterio vantaggi enormi, GENI CODIFICANTI, PROTEINA ACCESSORIE AL METABOLISMO.

Vantaggi dei plasmidi

• Plasmide di fertilitàcontiene proteine necessarie perché batteri entrino a contatto con un’altra cellula e scambiarsi materiale genetico. Se c’è un batterio che possiede un PILO CONIUGATIVO, lo userà per trasferire il suo genoma ad altri batteri (ANCHE TRA SPECIE DIVERSE). Scambio di geni di resistenza agli antibiotici.
• Plasmidi di resistenza contengono geni che portano a resistenza ad antibiotici e veleni.
• Plasmidi di virulenza trasformano un batterio in patogeno. Col plasmide contengono elementi per distruggere altri batteri, attraverso la degradazione di batteri.

Plasmide vettore: plasmidi sintetizzati in laboratorio che vengono inseriti nei batteri.

Membrana

MEMBRANA doppio strato lipidico permeabile, presenta proteine con diverse funzioni, tra cui alcune che connettono esterno con interno per far entrare ed uscire sostanze in maniera funzionale al metabolismo.

Contenuto della membrana

• Contenuto proteico elevato (70%). Le proteine di membrana possono essere integrali (attraversano il doppio strato) o periferiche (esterne). Non sono mai glicosilate.
• Lipidi di membrana: fosfolipidi (acidi fosfatidici, fosfatidilglicerolo, difosfatidilglicerolo, fosfatidiletanolammina, fosfatidilserina). Aminoacidi esterificati con glicerolo. Acidi grassi a catena ramificata.
• Enzimi respiratori
• Opanoidi (steron-like), simili a steroidi: la membrana citoplasmatica batterica manca di steroli, fatta eccezione per i micoplasmi. In alcune specie sono presenti gli opanoidi, simili agli steroli (molecole pentacicliche)
• PBP (penicilling binding protein): recettori di origine proteica presenti sulla superficie esterna della membrana, fondamentali per diverse funzioni metaboliche.

Sistema di trasduzione

• Sensore (percepisce stimoli e variazioni parametri ambientali)
• Regolatore (avvisato dal sensore, attiva geni specifici che codificano proteine per rispondere allo stimolo)

Trasportatori

Trasportatori proteine da esportare al di fuori del citosol, contengono all’N terminale una sequenza specifica di riconoscimento e vengono veicolate all’interno del canale.

Sistema di secrezione di tipo terzo è un fattore di virulenza importante, è un ago attraverso il quale il batterio trasporta delle proteine importanti ALLA BASE DELLA LORO INVASIONE DI UNA CELLULA EUCARIOTICA.

Funzione della membrana

• Ritenzione del contenuto cellulare
• Trasporto di metaboliti (trasporto attivo, passivo o facilitato)
• Barriera osmotica
• Secrezione di enzimi extracellulari e altre proteine
• Fosforilazione ossidativa
• Supporto di molecole trasportatrici

Parete batterica (parete cellulare)

PARETE BATTERICA (PARETE CELLULARE) Si trova a diretto contatto con la membrana. Protegge da shock ambientali (funzione di PROTEZIONE). Se viene danneggiata la parete batterica il batterio lisa (muore), anche per minime modificazioni.

Funzioni della parete

• Protezione meccanica: attraverso il peptidoglicano (mureina) nei gram positivi.
• Protezione chimica: peptidoglicano e acidi teicoici nei gram +; peptidoglicano e lipopolisaccaride nei gram-
• Protezione osmotica
• Conferimento forma
• Trasporto: attraverso le porine dei gram – e maglie peptidoglicano nei gram +.
• Funzione immunitaria
• Virulenza: soprattutto LPS gram –
• Ancoraggio e adesione: Flagelli, pili, fimbrie
• Metaboliche (ioni Ca²⁺ e Mg²⁺ nei gram -)
• Responsabile della colorazione dei Gram

Gram positivi e Gram negativi

Gram negativi hanno parete batterica più sottile (membrana plasmatica, periplasma o spazio periplasmatico e membrana esterna (OM)). Gram positivi (membrana plasmatica, parete con diversi acidi).

Gram fu il primo ad accorgersi di questa differenza lavorando con dei coloranti, trattando cellule batteriche con cristal violetto e iodio (mordenzante), i quali interagiscono formando cristalli ingombranti. Gram positivi rimanevano viola, Gram negativi erano trasparenti. Mettendo colorante senza decolorare aveva viola(GRAMpos) e rosa (GRAMneg). Cristalli escono dai GRAMnegativi con la decolorazione, mentre rimangono intrappolati nei GRAMpositivi. Metto colorante di contrasto (SENZA DECOLORARE) tipo sapranina e i GRAMnegativi appaiono rosa.

Parete dei Gram positivi

Comprende principalmente un complesso glicopeptidico chiamato mureina, peptidoglicano, mucocomplesso, mucopolisaccaride, al quale sono legati acidi teicoici e alcune molecole di zuccheri (mannosio, arabinosio, galattosio). È polare (idrofila).

Il peptidoglicano è composto da lunghe catene di due amminozuccheri, NAM e NAG, legati da legame 1-4β glucosidico a formare un disaccaride, che costituisce il monomero (unità strutturale) del peptidoglicano. I monomeri sono uniti tra loro da legame 1-4β glucosidici all’esterno del batterio. Al COOH del NAM sono legati 5 amminoacidi: L-alanina, acido D-glutammico, L-lisina (o DAP, acido diaminopimelico), D-alanina, D-alaina. Alla lisina sono legati altri amminoacidi, diversi a seconda della specie batteriche (es. stafilococco 5 glicine).

Gli amminoacidi sono legati all’esterno da legami crociati, poiché il batterio non è in grado di produrre ATP lì. In alcuni casi nei gram positivi si forma un legame di transpeptidizzazione: si stacca la D-alanina in posizione 5, fornendo l’energia necessaria per far legare la D-ala in posizione 4 con una catena peptidica omopolimerica che si lega all’ultimo amminoacido attaccato alla L-Lys della catena successiva, mediante enzimi.

NB: nei GRAM NEGATIVI il legame crociato consiste nel legame diretto tra la D-alanina in posizione 4 e l’acido diaminopimelico DAP di una catena adiacente. Acidi teicoici: legati al peptidoglicano, non fondamentali per la rigidità. Presumibilmente servono alla sistemazione sterica dei polimeri. Non risulta chiaro il loro ruolo, forse protezione, funzionano da adesine e possono stimolare rilascio citochine e monochine per il processo infiammatorio.

Parete dei Gram negativi

Più complessa di quella vista per i gram positivi, in quanto i batteri gram negativi possiedono una membrana esterna (ME) ancorata stabilmente al peptidoglicano, con struttura simile alla membrana citoplasmatica. Fornisce ai batteri un’ulteriore barriera di permeabilità (antibiotici, farmaci..).

Componenti della parete dei Gram negativi

Contiene strutture peculiari che le conferiscono caratteristiche importanti dal punto di vista patologico e fisiologico:

• Lipoproteinaimportante per il collegamento tra ME e peptidoglicano (legami covalenti tra aminoacidi terminali della proteina e l’acido mesodiaminopimelico del peptidoglicano).
• Porine complessi proteici che permettono il passaggio di piccole sostanze cariche all’interno del peptidoglicano (max 600 dalton). Le più famose sono trimeri che si fondono nella zona centrale a formare un canale. Sono inattive in assenza/alterazione di LPS.
• Lipolisaccaride (LPS) STRUTTURA PECULIARE DEI GRAM NEGATIVI, presente nel foglietto esterno della ME. Rappresenta l’antigene somatico gruppo-specifico nell’ambito di una specie (antigene O) e contiene il lipide A, porzione tossica che funziona da endotossina.

Struttura del Lipopolissaccaride (LPS)

• Polisaccaride gruppo-specifico (esterno) = antigene O: polisaccaride complesso che costituisce una molecola con caratteristiche antigeniche e peculiari per le varie specie batteriche.
• Core polisaccaridico: meno peculiare per polisaccaride O.
• Lipide A (parte più interna): integrato nella membrana esterna ME. Rappresenta l’endotossina dei batteri gram negativi (prevalentemente colpisce le cellule fagocitarie che inglobando e lisando i batteri la liberano e la rendono attiva).

Infine, il peptidoglicano ha una struttura più sottile di quella dei gram positivi. Immerso in un piccolo spazio periplasmatico.

Eccezione

PEPTOGLICANINA GNAM Zuccheri legati da legame beta-1,4. Parete fatta da ripetizione perfetta NAM-NAG-NAM-NAG-NAM.. legati da legame beta-glicidico-1,4. Legami orizzontali tra zuccheri e legami verticali peptidici tra amminoacidi strato superiore e inferiore. Nel caso dei gram neg esiste un legame tra dialanina finale e acido. Nei gram pos questo legame peptidico presenta ponte pentaglicinico (5 glicine).

Funzione dei peptidoglicani

PEPTOGLICANO è rimosso dal lisozimaPROTOPLAST. Nella fase di sintesi gli amminoacidi sono 5 e non 4 come prima. Rimozione del 5 amminoacido e rottura del legame peptidico fornisce energia per legame peptidico con 4 amminoacido dell’altro.

Acidi della parete dei Gram positivi (teicoici)

Aderenza a qualunque tipo di superficie.

Gram negativi e membrana esterna

GRAM NEGATIVI MEMBRANA ESTERNA presenta lipopolisaccaride (LPS) che può dare shock endotossico quindi morte. ENDOTOSSINA tossina componente strutturale del batterio. LPS si libera esclusivamente per lisi batterica, va in circolo quando il batterio muore.

Componenti della membrana esterna

• Proteine canale o porine
• Enzimi di resistenza beta lattamici si trovano nei peptoglicani(?)SHAPERONINE

LPS ha una componente lipidica, lipide A, poi polisaccaridico e tutta una serie di zuccheri in quantità e tipo specifici. Possono variare molto all’interno di una specie. Componente endotossica in un LPS è il lipide A, non può essere liberata se non per lisi del batterio. Classificare ceppi diversi della stessa specie attraverso parte O dell’LPS attribuendo dei numeri. Batterio lisa e libera LPS (o meglio componente A), riconosciuto da proteina del sangue che si accorge che è una molecola NON-SELF e lo presenta ad un macrofago (cellula dell’immunità innata). Macrofago dà STORM CITOCHIMICO, potente rilascio mediatori chimici che porta a una serie di conseguenze sistemiche per cui la persona muore da shock endotossico. Micobatteri impermeabili, cera intorno al batterio, non entra colorante. Si usa un alcol-acid resistant, con fenoli e calore (zihel-neelsen).

Capsula

CAPSULA (non tutti ce l’hanno) strato di polisaccaridi o polipeptidi che protegge dalla fragocitosi, conferisce adesione e protezione dall’essiccamento. Molti hanno la capsula di acido glutammico e non polisaccaride, l’ospite non riconosce come NON SELF ma come SELF. Consiste in un fattore di virulenza ma ha anche funzione protettiva, isolando il batterio dall’ambiente esterno. Se fagocitato resiste, e talvolta distrugge il fagocita. La capsula contiene antigeni che stimolano la produzione di anticorpi specifici nell’ospite.

S Layer

Alternativo alla capsula, fatto di proteine organizzate in maniera perfetta, struttura ordinata.

Flagelli e pili

• FLAGELLI strutture che consentono movimento.
• PILI adesione. Pilo F permette il passaggio di materiale genetico da una cellula all’altra.

Microbiologia (20/02) Immunologia

Risposte alle infezioni

Come emergono le malattie infettive (provocate da microbi)? Tante persone vengono infettate ma pochissime manifestano la malattia. Infezione: dal latino “inficio” cioè “introdurre”. Microorganismo introdotto nel nostro corpo. Malattia è un esito molto raro rispetto alle infezioni.

Fattori che influenzano l'esito della malattia

• La carica microbica: numero fisico di microorganismi che ci invadono, che entrano nel nostro corpo.
• Virulenza: il grado di ‘cattiveria’ dei micr