Microbiologia

Microbiologia: cellule batteriche

La microbiologia studia i microrganismi non visibili ad occhio nudo, essi si suddividono in base all'analisi di RNA ribosomiale nell'albero filogenetico in; Archea, Batteri ed Eucarioti.

Forme e dimensioni delle cellule batteriche

Le cellule batteriche hanno dimensioni che variano dai 0,2 ai 8 nanometri ed hanno forme diverse: coccide, bastoncellare, spirillo ecc. I cocchi si possono unire a due a due in diplococchi o in forme filamentose chiamate streptococchi. I cocchi inoltre possono unirsi in ammassi irregolari chiamati stafilococchi.

Colorazioni

Possono essere semplici o composte.

• Semplici: serve un solo colorante per rendere visibile il batterio
• Composte: servono due coloranti sovrapposti

La colorazione del gram permette di identificare i batteri in gram positivi o gram+ e gram negativi o gram-. La prima tappa si ha fissando il batterio su un supporto come un vetrino tramite calore che uccide il batterio e permette l'entrata dei coloranti che altrimenti sarebbero bloccati dal batterio vivo. Poi si aggiunge il primo colorante chiamato cristalvioletto che colora le cellule di viola. Si aggiunge una soluzione iodata o liquido di noogle che fissa il primo colorante. Il processo di decolorazione avviene attraverso l'aggiunta di alcool. I gram + non vengono decolorati ma restano viola mentre i gram - si decolorano. (Il mantenimento del colore è dato dalla struttura della parete). Si aggiunge un secondo colorante rosso di safrina che colora i gram-.

Architettura batterica

Il batterio ha due zone con genoma; il nucleoide che contiene un cromosoma circolare e i plasmidi che hanno DNA extracromosomico che ha origine dalla replicazione autonoma, questi sono geni non essenziali per la replicazione come ad esempio geni per la farmacoresistenza.

Membrana plasmatica

La membrana plasmatica è formata da un doppio strato fosfolipidico più flessibile però di quella eucariote, ma con la stessa composizione chimica. Infatti possiede proteina con funzioni diverse; trasporto di sostanze, proteine enzimatiche per la respirazione e la produzione di energia. Le membrane plasmatiche dei batteri possiedono estroflessioni dette mesosomi per aumentare il volume di membrana e con esso la maggiore produttività di energia.

• Lascia passare acqua, zuccheri, sostanze liposolubili, CO₂
• Contiene enzimi necessari per la respirazione
• Contiene enzimi per la sintesi del peptoglicano (componente fondamentale della parete batterica)

I meccanismi di trasporto di membrana sono la diffusione, il trasporto passivo e il trasporto attivo.

Parete batterica

All'esterno della membrana plasmatica. Basilare per i procarioti perché permette la distinzione in gram+ o -, e ha diverse funzioni:

• Esoscheletro dei batteri, contenitore rigido che dà forma al batterio
• Regola lo scambio dei solventi tra interno ed esterno, senza parete i batteri non sopravvivono perché entra troppa acqua che causa la lisi cellulare
• Barriera selettiva per impedire l'ingresso di sostanze dannose
• Regola l'entrata delle sostanze nutritive

Parete dei gram +

Componente fondamentale è il peptidoglicano formato da due subunità; nacetilglucosinina e acido muranico legate da un legame beta 1-6. L'acido muranico sarà unito a nacetilglucosinina da un legame beta 1-4. Sul beta 1-4 può agire il lisozima che scinde permettendo l'entrata di liquidi. Parete spessa 20-30 nm.

Parete dei gram -

Anche qui la componente fondamentale è il peptidoglicano. Ha uno spazio periplastico con proteine di Brau. Qui sono localizzati gli enzimi con capacità inibitorie di alcuni antibiotici. È più sottile rispetto a quella dei gram + ed è anche più permeabile.

Capsula

È un involucro mucoso più esterno costituito da polisaccaridi che riveste sia i gram+ che i gram-. Impedisce l'azione di antibiotici e il processo di fagocitosi, inoltre favorisce l'adesione dei batteri ai tessuti specifici.

Flagelli

I batteri, soprattutto quelli a forma cilindrica, possono avere uno o più flagelli, che sono organi locomotori che si originano dalla membrana plasmatica e si estendono per circa 15-20 nm. I flagelli sono responsabili di: mobilità, infatti sono organi di propulsione che ruotano in senso orario o antiorario e chemiotassi, cioè movimento dei metaboliti, questa può essere positiva se richiama metaboliti o negativa se il batterio fugge da sostanze dannose. Il flagello è diviso in tre parti; filamento, uncino o gancio e corpo basale. I batteri monotrichi hanno un solo flagello a un polo, i lofotrichi hanno un ciuffo di flagelli a un polo e i peritrichi possiedono flagelli tutto intorno al corpo.

Pili e fimbrie

Sono entrambi appendici filamentose diverse dai flagelli. Le fimbrie sono più corte e sono presenti su tutto il soma batterico perché servono ad aderire alle superfici da colonizzare, i pili sono pochi o a volte ne è presente solo uno e sono più lunghi delle fimbrie. Sono organi sessuali o di coniugazione che permettono il passaggio di DNA da un batterio all'altro.

Genetica batterica

Replicazione del DNA

Nella cellula procariotica esistono due tipi di molecole di DNA; cromosomico e extracromosomico (plasmidi). Il DNA cromosomico, circolare e superspiralizzato, viene creato con un processo semi-conservativo. La sintesi in direzione 5'-->3'. Nei batteri ci sono 3 DNA polimerasi (1°, 2° e 3°, l'ultima è la più importante). Nella sintesi sono coinvolti diversi enzimi di cui i più importanti sono le topoisomerasi. Il DNA batterico ha un secondo meccanismo di duplicazione detto a "rolling circle" tipico dei plasmidi. Quando questi vengono trasferiti da un batterio donatore a uno ricevente tramite pilo sessuale (coniugazione) il DNA si duplica per cui alla fine del trasferimento si hanno due DNA plasmidici, uno nel donatore e uno nel ricevente.

Sintesi proteica

Il flusso di informazione dal DNA alle proteine avviene in maniera diversa nei procarioti e negli eucarioti. Gli eucarioti hanno due sequenze di DNA; esoni e introni. Nei procarioti tutte le sequenze vengono tradotte, non ci sono introni. Nei batteri che sono senza membrana nucleare la trascrizione è contemporanea alla traduzione e quindi il flusso è continuo mentre negli eucarioti il messaggero prima di andare nei ribosomi deve seguire un processo di maturazione nel nucleo, quindi si dice che l'RNA va in splicing che elimina le sequenze introniche per poi passare nel citoplasma in forma lavorata o matura. I messaggieri batterici sono policistronici cioè codificano per più proteine mentre negli eucarioti sono monocistronici. I batteri inoltre possiedono un'unica polimerasi.

La sintesi proteica nei batteri viene regolata in tre modi:

• Regolazione indotta dal substrato: quando aggiungiamo un substrato questo si lega al gene repressore e lo inattiva per cui si avvia la trascrizione
• Regolazione aporepressore: il prodotto finale viene legato all'aporepressore e lo rende inattivo
• Regolazione da meccanismo feedback: viene sintetizzato un certo prodotto finale che interagisce con il primo enzima di reazione metabolica di quel prodotto provocando un cambiamento allosterico così che non possa più agire sul substrato

Mutazioni

L'evoluzione batterica avviene grazie a mutazioni e ricombinazioni. Le mutazioni sono le più frequenti e riguardano le triplette di DNA. Se nel ceppo selvatico, cioè nel batterio normale, avviene una mutazione a un codone viene detto silente, se avviene invece la comparsa di codon si chiama non sense. Se c'è una mutazione agli aminoacidi la mutazione è detta missense. Le ricombinazioni invece sono più rare e avvengono in seguito a trasferimento di materiale genetico da un batterio A a uno B.

Scambio genetico nei batteri

Trasformazione

Fu scoperta nel 1928 sullo streptococcus pneumoniae che provocava infezioni mortali nel topo. La virulenza è dovuta alla presenza di capsula nel batterio. Uno scienziato ha provato a inoculare nel topo lo stesso batterio però senza capsula e ha osservato che il topo non moriva. A questo punto ha mescolato batteri vivi senza capsula a batteri morti con capsula e ha visto che il topo moriva comunque. Isolando quindi i batteri ha visto che c'erano batteri vivi con capsula, era dunque avvenuta trasformazione, l'elemento trasformante era il DNA perché è resistente al calore con il quale uccideva i batteri. Le condizioni che influiscono sull'efficienza della trasformazione sono le caratteristiche fisico-chimiche del DNA e lo strato fisiologico della cellula trasformata. Il DNA deve essere a doppia elica e avere una elevata omologia con il DNA della cellula ricevente se si vuole avere trasformazione. La cellula ricevente invece deve essere in stato fisiologico competente cioè non deve avere attiva la sintesi proteica e l'inibizione della sintesi della parete. Le fasi della trasformazione sono:

• Assorbimento: del DNA libero alla cellula ricevente
• Ingresso: del DNA nella cellula
• Eclisse: Il DNA a doppia elica viene trasformato a singola elica
• Ricombinazione: Il DNA donatore si appaia al ricevente con un meccanismo di sostituzione in una zona di omologia

Coniugazione

Trasferimento tramite materiale genetico attraverso un pilo sessuale. Mediata da un plasmide particolare chiamato plasmide F. La coniugazione tra una cellula F+ (con plasmide F) e una F- è molto efficiente. Il pilo sessuale forma un ponte fra le due cellule e con un meccanismo a "rolling circle" la cellula passa attraverso il ponte il DNA e lo duplica. Alla fine del processo le due cellule saranno entrambe F+ e ognuna avrà quindi una copia del plasmide F. Le cellule F+ o hFr possono trasferire geni cromosomiali, per il passaggio di tutto il cromosoma batterico occorrono circa 100 minuti. Il ponte però è debole e a volte si rompe per cui in genere non tutto il cromosoma passa e vengono trasferiti solo i geni in testa (a, b, c, d ecc..), quasi mai i t, u, v, e z e quindi nella cellula F- non si riforma il plasmide e rimane una F-. Alcune volte però nelle cellule hFr il plasmide integrato può escidersi, cioè si forma un plasmide ricombinante che porta con sé alcuni geni batterici. Questi plasmidi ricombinanti danno il nome alla cellula F' che possono trasferire alcuni geni batterici presenti del plasmide. La coniugazione è un meccanismo tipico dei batteri gram-, mentre i gram+ possono coniugarsi mediante alcune sostanze di aggregazione.

Esistono vari tipi di plasmidi:

• Coniugativi: con fattore F
• Plasmidi R: R sta per resistenza a antibiotici contenuti nel trasposone
• Plasmidi di virulenza: possiedono dei geni con fattori di virulenza, ad esempio geni che codificano tossine batteriche
• Plasmidi metabolici: contengono geni con funzioni metaboliche

Trasduzione

La trasduzione è dovuta a particolari virus dei batteri chiamati fagi. I batteriofagi sono di vario tipo e possono essere o a RNA o a DNA a singolo filamento o a DNA a doppio filamento. Questi ultimi interessano la trasduzione. I fagi possono essere classificati in base al meccanismo di infezione o virulenti o attenuati, i primi quando infettano un batterio attivano un ciclo litico replicativo producendo nuovi fagi e liberano questi attraverso la lisi del batterio. I fagi attenuati invece hanno un ciclo lisogeno oppure quando vengono attivati da stimoli esterni come radiazioni ultraviolette passano al ciclo litico. Nel ciclo lisogeno il fago infetta la cellula, il suo DNA si integra nel cromosoma batterico con il nome di profago dove rimane in uno stato di latenza. Il meccanismo di infezione avviene quando il fago si lega ai recettori di membrana esterna attraverso le fibre della coda. Una volta legato la coda si ancora alla membrana attraverso le pine e libera un lisozima (enzima) che rompe i legami beta 1-4 del peptidoglicano del DNA formando lesioni di membrana. Il corpo poi si contrae come una siringa e il DNA del virus viene iniettato nel citoplasma del batterio. Poi parte il ciclo litico o quello lisogeno.

Ciclo litico: in seguito all'infezione il DNA virale si circolarizza e poi, ad opera di DNA polimerasi del fago vengono prodotti nuovi DNA fagici ad opera di RNA polimerasi si formano mRNA che vanno sui ribosomi batterici e traducono proteine fagiche (enzimatiche o strutturali). Le strutturali si associano e formano i nuovi fagi. La cellula quindi si rompe e i fagi escono per iniettare nuove cellule.

Ciclo lisogeno: Il DNA si integra al cromosoma della cellula finché non viene stimolato e comincia il ciclo litico.

Esistono due tipi di trasduzione; generalizzata e specializzata. La trasduzione generalizzata si ha nel ciclo litico dove qualsiasi gene batterico va da un batterio A a uno B. La trasduzione specializzata avviene nel passaggio dal ciclo lisogeno a quello litico e in questo caso possono essere trasferiti solo quei geni batterici adiacenti al profago integrato. La conversione lisogena si ha alcune volte nei batteri quando il profago non è completamente silente ma alcuni geni vengono espressi. Questi prodotti virali possono influenzare il fenotipo del batterio es. produzione di tossine e antigeni. In alcuni batteri le tossine possono dunque essere di natura fagica (tossina della difterite, della scarlattina e del botulismo sono le più importanti).

Divisione batterica

I batteri si dividono per scissione semplice e non hanno mai lo stadio di meiosi. Questa scissione comincia con la duplicazione del cromosoma ancorato alla membrana citoplasmatica, poi segue l'allontanamento delle due molecole di DNA dovuto alla crescita della membrana citoplasmatica. Comincia a formarsi un setto membranoso che divide le due molecole e sul setto comincia a formarsi la parete che una volta completa separa in due cellule distinte. In certi batteri come streptococchi e stafilococchi questi setti rimangono a lungo incompleti dando forma a catenelle o aggregati che si vedono dopo la colorazione di gram. Nel nostro organismo si possono formare batteri senza parete chiamati forme L. La parete manca per l'azione di certi antibiotici che agiscono sulla sintesi della parete. Le forme L sono associate alla cronicizzazione di certe malattie che però sono molto rare.

Si formano anche spore cioè forme di resistenza presenti in alcune specie batteriche gram+ come ad esempio il bacillus e clostridium (tetano), queste spore permettono la sopravvivenza anche in condizioni ambientali sfavorevoli come calore, essiccamento, raggi UV e agenti chimici ostili ecc. Le spore mancano di sintesi e in stato di letargo possono resistere per secoli.

Spora

La spora possiede diverse strutture:

• Core o protoplasta: più interna che contiene DNA, RNA e proteine immerse nel residuo di citoplasma. Il DNA è legato a proteina a basso peso molecolare chiamate SASP che lo rendono resistente ai raggi UV. Sale dipicolinico di calcio per la termo-resistenza.
• Cortex o corteccia: Involucro composto da peptoglicano modificato (lattami del peptoglicano) per cui è resistente al lisozima
• Mantello sporale: Altro involucro formato da una tunica interna e una esterna composte di proteine colforate molto resistenti ad agenti fisici e chimici
• Esosporio: Membrana fosfoproteica (non sempre presente)

La cellula si trasforma in spora attraverso la sporulazione e viceversa tramite germinazione.

Sporulazione

Divisa in fasi. La cellula comincia a sporificare in assenza di metaboliti (cibo) e duplica il genoma formando un setto che separa il DNA. La separazione differenzia nella regione piccola la prespora o endospora perché nasce all'interno della cellula batterica che prende il nome di sporangio perché contiene la spora. Poi la prespora si circonda di due membrane all'interno delle quali si forma la corteccia. Inizia la deidratazione della spora e cominciano poi a formarsi le due tuniche. Infine l'endospora viene liberata attraverso lisi dello sporangio. La durata del processo è di 6-7 ore.

Germinazione

Quando si ristabiliscono le condizioni metaboliche ottimali e in seguito a uno stimolo di attivazione derivante dall'invecchiamento della spora e da microfratture in tratti sporali. La durata del processo è di 1-2 ore e divisa in fasi. Cominciano gli scambi metabolici con l'esterno. Vengono degradate le varie membrane e inizia l'idratazione e la termosensibilità. Esocrescita cioè fase finale con formazione di DNA, messaggeri e proteine e la nuova cellula batterica comincia a uscire dalla spora duplicandosi.

Crescita batterica

I batteri per crescere hanno bisogno di energia o carbonio. L'energia può provenire da fonti di natura organica, di natura inorganica o da fonti di luce. Quelli che usano fonti organiche sono detti chemi-organotrofi, quelli che usano quelle inorganiche sono detti chemiolitotrofi mentre quelli che usano la luce fototrofi. Gli aerobi invece ottengono energia solo in presenza di ossigeno, mentre altri solo in assenza di ossigeno e sono detti anaerobi. Esistono inoltre batteri misti detti aerobi-anaerobi facoltativi e sono la maggior parte di interesse medico. Come fonte di nutrizione richiedono invece tutti il carbonio, se richiedono composti organici sono detti eterotrofi se usano solo CO₂ sono autotrofi.

La crescita batterica ha bisogno di requisiti come; acqua, temperatura adeguata, corretto livello di pH, pressione osmotica, concentrazione salina e aerobiosi o presenza di ossigeno.

Coltivazione di batteri

I batteri si coltivano in terreni di coltura o liquidi o solidi:

• Solidi: terreno liquido poi solidificato con aggiunta di agar (polisaccaride)
• Liquidi: acqua e agenti vari

I terreni liquidi servono alla "coltura" batterica mentre quelli solidi anche alla differenziazione. Il passaggio da un terreno liquido a uno solido è importante per differenziare delle colonie visibili anche ad occhio nudo. Le colonie hanno diversa forma o consistenza a seconda del fenotipo. La crescita microbica si misura con; conta totale delle cellule.