Metodologie di analisi

Metodologie di analisi

L'obiettivo di queste lezioni è quello di conoscere i metodi con i quali si giunge a identificare a livello di specie gli organismi che si possono trovare in una matrice alimentare; sappiamo, infatti, che la matrice alimentare è substrato ospite di molti microrganismi e diversi tra matrici stesse. Molte volte i microrganismi sono richiesti (colture starter), questi vanno coltivati e mantenuti in condizioni ottimali nei laboratori per poter essere utilizzati nei vari processi produttivi; nelle matrici alimentari, però, si possono trovare anche dei microrganismi non richiesti che vanno, pertanto, eliminati. Questo significa che quando si devono controllare, dalla materia prima fino alla filiera, tutti i campioni bisogna saper riconoscere in modo preciso i vari microrganismi (se è o meno salubre per l’uomo); il microbiologo deve mettere in pratica dei meccanismi di riconoscimento atti a rispondere a questa esigenza. Nella maggior parte dei casi si basano sullo studio del DNA.

Metodi di base

Prima di applicare queste metodologie bisogna lavorare bene sui metodi di base:

• Corretto campionamento della matrice: noi sappiamo che gli alimenti, soprattutto quelli solidi, possono portare sulla superficie o all’interno diverse tipologie di microrganismo quindi i campioni vanno fatti su più punti della matrice stessa.
• Determinazione della carica microbica: primo indice di qualità dell’alimento che si sta analizzando; ad esempio, abbiamo già visto l’utilizzo del metodo delle diluizioni successive e piastramento. Questo ha lo scopo sia di avere una stima della carica microbica, sia di isolare un numero significativo di colonie.
• Isolamento di un numero significativo di colonie: è alla base dell’identificazione. Noi dovremmo essere in grado di isolare ogni colonia presente nelle nostre piastre per poter avere una coltura pura su cui mettere in atto tutte le operazioni per arrivare alla sua identificazione a livello di specie.

Noi tratteremo la specie batterica, che da questo punto di vista è un ideale modello di studio e applicazione; è la più semplice tra le cellule microbiche. Non possiede, infatti, organelli specifici ma ha una membrana citoplasmatica atta a svolgere varie funzioni che nella cellula eucariote sono compiute dai mitocondri, ad esempio, o dall’apparato di Golgi o dal RE.

Struttura della cellula batterica

La cellula batterica è così strutturata: presenta una parete che la protegge, una membrana citoplasmatica all’interno della quale non ci sono organelli ma un pool enzimatico necessario al metabolismo cellulare; si trovano i ribosomi, necessari alla sintesi proteica, ma non il nucleo, bensì una zona nucleare in cui è compattato il materiale genetico di una cellula procariota.

Una cellula procariota è una cellula aploide, significa che non possiede 2n cromosomi (come una cellula diploide: lieviti, muffe) bensì un'unica molecola di DNA cromosomale; questa ha una conformazione CCC circolare covalentemente chiusa.

Il DNA batterico non porta necessariamente un numero ridotto di informazioni, anzi si può arrivare a 3 milioni di paia di basi nucleotidiche; ciò significa che questa molecola, se fosse disavvolta, avrebbe un diametro superiore rispetto alla cellula procariote che la contiene ed è questo il motivo per cui è compattata. Naturalmente la sua aggregazione non è casuale ma mediato da enzimi specifici.

Molti batteri possono contenere anche delle molecole di DNA extracromosomale che si chiama così perché si trova libero nel citoplasma, sempre struttura CCC ma di dimensioni ridotte: si chiama plasmide. Le funzioni che possiede sono aggiuntive ma che possono aiutare la cellula in condizioni ambientali disagevoli; ad esempio, su diversi plasmidi di cellule antibiotiche sono stati trovate informazioni riguardo la resistenza agli antibiotici o enzimi detossificanti o degradanti.

Alcuni plasmidi sono conosciuti come elementi genetici mobili perché hanno la caratteristica di potersi spostare da una cellula all’altra o di essere “persi dalla cellula stessa per questo motivo l’evoluzione non ha voluto che il plasmide trasportasse informazioni indispensabili che se perse comprometterebbero la vita della cellula.

I plasmidi sono mezzi di trasferimento genico orizzontale ovvero, tramite meccanismi di coniugazione o simili, il plasmide può passare da una cellula all’altra trasportando informazioni.

Concetto di specie batterica

Per poter studiare le metodologie di analisi va prima ripreso il concetto di “specie batterica”: è l’unità tassonomica di base e deve rispettare tre caratteristiche, due delle quali dono legate allo studio del patrimonio genetico.

Per specie batterica si intende un insieme di colture pure che sono state scoperte in tempi e ambienti differenti ma che hanno:

• Elevata similarità fenotipica
• Elevata omologia genetica (infatti il fenotipo è manifestazione del genotipo)
• Elevata omologia filogenetica: i rapporti filogenetici sono legati all’ambiente evolutivo che ha determinato il loro sviluppo.

Per ogni specie microbica finora conosciuta esiste un ceppo di riferimento detto “type” che viene mantenuto in vita in collezioni internazionali (la più importante è l’ATCC American Type Culture Collection) e può essere richiesto dai laboratori all’occorrenza.

È quindi necessario lo studio del DNA della cellula; facciamo un breve excursus: il DNA è una struttura a doppio filamento che acquisisce una forma a doppia elica composta da:

• Desossiribosio
• Quattro basi azotate che si legano solo secondo uno specifico ordine (ATTA; GCCG) e che determinano la complementarietà dei filamenti.
• Gruppo P

Per mantenere la stabilità della struttura ci sono legami idrogeno che si instaurano sulle basi azotate:

• Due tra A e T
• Tre tra G e C

I filamenti sono anche antiparalleli:

• 5’-3’
• 3’-5’

All’estremità 5’ c’è libero un gruppo P, all’estremità 3’ è libero un -OH. Proprio per il fatto che i filamenti sono complementari nello studio del DNA si osserva un solo filamento (5’-3’). Questa organizzazione del DNA cromosomale possiede migliaia di paia di basi che sono caratterizzate da un’organizzazione specifica che ne permette la lettura: genoma, è un codice costituito da triplette, i cosiddetti codoni che sono 64. Ci sono molto più codoni rispetto alle informazioni (amminoacidi), si parla di codice genetico degenerato che ha lo scopo di minimizzare l’effetto delle mutazioni. Per ogni amminoacido i codoni cambiano dell’ultima lettera (vacillamento della base nucleotidica): sono quindi le prime due che determinano effettivamente l'amminoacido.

A questi vanno aggiunti i codoni di inizio e stop:

• Inizio: ATG
• Stop: TAA

Questa lunga serie di basi nucleotidiche viene distinta in regioni, i geni o operoni. In sintesi è una regione del DNA che codifica per un prodotto del fenotipo ed è delimitato da un codone di inizio ed uno di stop, con codoni intermedi con specifici amminoacidi che determinano la proteina finale.

Lungo il genoma batterico ci sono una serie di geni (fino a 3000-4000) codificanti per tutto ciò che la cellula necessita per la propria vita; ciò non significa che tutti debbano essere contemporaneamente tradotti nei loro prodotti.

Flusso dell'informazione genica

Ricordiamo innanzi tutto qual è il flusso dell’informazione genica: abbiamo le informazioni portate a livello del DNA che vengono poi trascritte in mRNA a singolo filamento, il quale va ai ribosomi per la sintesi proteica.

Due parole sul processo di trascrizione: i vari geni posseggono a monte una regione nucleotidica che non è codificante ma che è riconosciuta dalla RNA polimerasi che è in grado di svolgere il processo di trascrizione sull’RNA. Questa sequenza si chiama sito promotore ed è caratteristico di ciascun gene presente nel genoma.

L’RNA, dunque, giunge ai ribosomi che sono dotati di due subunità attive; i ribosomi completi dei batteri si chiamano 70 S dove S significa Swetter dal nome del ricercatore che per primo ha classificato i ribosomi e le varie unità in funzione della loro densità.

• Maggiore
• Minore

I ribosomi sono attivi se all’interno delle subunità si trova il DNA ribosomale, catene polipeptidiche specifiche che rendono funzionale l’intero ribosoma al momento della sintesi proteica.

Abbiamo parlato del sito promotore che permette lo svolgersi della trascrizione; il punto è che la cellula non può permettersi di sprecare energia per promuovere la trascrizione contemporanea di tutte le informazioni che si trovano lungo il genoma. Anzi, evolutivamente parlando quello che fa è cercare di accumulare quanta più energia possibile dall’ambiente, spendendo quella immagazzinata solo per lo svolgimento di attività necessarie.

Regolazione genica

Questo processo si chiama regolazione genica: consiste nel mettere in atto dei processi che permettono che i geni si possano “accendere e spegnere” a seconda delle necessità cellulari del momento: il gene acceso può essere trascritto sul corrispondente RNA messaggero ecc. il gene spento è inattivato e non svolge questo processo.

I principali metodi di regolazione sono:

• Repressione
• Attivazione

A livello del sito promotore possono essere presenti altre regioni nucleotidiche specifiche che hanno affinità particolare che hanno affinità col repressore o con l’attivatore che sono proteine regolatrici che sono state sintetizzate dalla cellula appositamente per questo scopo. I siti di regolazione vengono detti anche siti operatori.

Il modo per risparmiare energia è quello di raggruppare geni contigui in “operoni”: sono regioni nucleotidiche in cui si possono distinguere due o più geni contigui la cui trascrizione avviene ad opera di un solo sito promotore che sta a monte del primo gene. Quando la DNA polimerasi si lega al promotore copia tutto il gruppo di geni fino a che non trova uno stop e viene trascritto tutto su un unico mRNA detto anche policistronico; al termine di questo processo ci saranno tante proteine quanti sono i geni copiati nel gruppo. Questa metodologia è un esempio di quel risparmio di energia di cui parlavamo precedentemente.

In un operone, naturalmente, i geni non sono raggruppati a caso ma generalmente sono raggruppati geni che devono essere sintetizzati insieme perché la cellula ha bisogno contemporaneamente di questi prodotti.

Esempio di operone: "Lac"

Un esempio di operone è l’operone “Lac”:

È stato trovato in diversi batteri, ad esempio Escherichia Coli: raggruppa tre geni:

• LacZ: codifica per una beta-galattosidasi.
• LacY: codifica per una permeasi.
• LacA: codifica per una acetilasi.

Sono necessari contemporaneamente per assumere lattosio dall’esterno e assimilarlo. Il sito operatore di questo operone è in grado di legare una proteina che è un Lac repressore, che impedisce alla RNA polimerasi di trascrivere i geni dell’operone quando la cellula sta crescendo e il lattosio non è presente nell’ambiente; non avrebbe senso produrre questi geni. Se nell’ambiente, come unica fonte di carbonio c’è il lattosio allora il repressore viene inattivato (dal lattosio stesso: è induttore della trascrizione).

Operone ribosomale

Un altro operone di fondamentale importanza è molto usato nelle tecniche di indagine genetica è l’operone ribosomale:

Contiene due geni:

• 16S
• 23S

Questi geni codificano per l’RNA ribosomale che andrà a costituire le subunità attive dei ribosomi; il 16S va a costituire la subunità 30S (minore) mentre il 23S la subunità 50S (maggiore). Sono di importanza vitale, senza la cellula non potrebbe sopravvivere poiché senza ribosomi la cellula muore. È conosciuto come orologio molecolare; avere un orologio molecolare permette di calcolare le distanze evolutive tra una specie e l’altra. Non è possibile, infatti paragonare evolutivamente due cellule senza questa caratteristica: bisogna trovare qualcosa che sia presente in tutte le cellule indipendentemente dall’antichità. I geni che codificano per l’RNA ribosomale sono quelli che si sono mantenuti in modo più fedele.

NB: il 16S si usa per valutare anche i rapporti filogenetici. I due geni che compongono l'operone non sono contigui: regione spaziatrice, anche essa può essere usata come regione target per identificare diversi microrganismi.

Caratteristiche del DNA

A questo punto vediamo alcune caratteristiche del DNA mediante le quali riusciamo a quantificare, visualizzare e caratterizzare il DNA estratto. Innanzitutto necessitiamo di un protocollo che ci permetta di estrarre il DNA; esistono ormai moltissimi protocolli differenti ma che hanno step comuni a tutti:

• Avere un certo numero di cellule da cui estrarre il DNA; la coltura cellulare dalla quale si parte può avere più o meno cellule in base alla quantità di DNA di cui abbiamo bisogno per le analisi successive. Quando si svolge questo protocollo si estrae tutto il DNA sia cromosomale che plasmidico (eventualmente).

Bisogna quindi far crescere il nostro organismo all’interno di un terreno idoneo alla sua crescita per poi estrarne il DNA, che non necessariamente è quello ottimale per la sua crescita; esistono alcuni organismi che producono strati extraparietali, può capitare che i terreni portino una bassissima resa in termini di estrazione del DNA dal momento che queste strutture extraparietali siano limitanti all’agente litico che serve.