Metodologie di analisi

Analisi delle bande di DNA tramite elettroforesi

Le bande che migrano di più (quelle che si vedono in chiaro) rappresentano molecole di DNA plasmidico, sono infatti piccole e in forma CCC. La banda che si vede bella fluorescente, vicino al polo - è il DNA cromosomiale. In molte metodiche è necessario conoscere il peso molecolare del frammento o dei frammenti di DNA che abbiamo ottenuto, come si fa? Ci si basa sulla corsa elettroforetica utilizzando un MARKER: costituito da una miscela di molecole di DNA di peso molecolare noto. Il numero di molecole di peso molecolare diverso contenuto nella miscela dipende dal tipo di marker utilizzato. Può essere un marker: - 50 paia di basi - 100 paia di basi - 1 kilobase - ... È importante utilizzare un gel di agarosio con una concentrazione adatta, sia per quanto riguarda il campione sia per il marker. Se così non fosse, le bande vicine potrebbero unificarsi e io potrei non riuscire a risalire al peso molecolare. Il marker serve per fare una retta di taratura.se esso è fatto da una serie di molecole di DNA di peso noto, noi possiamo caricarlo contemporaneamente al campione ed effettuare la corsa elettroforetica in contemporanea. Al termine dell'acquisizione delle immagini noi dovremmo andare a verificare che tutte le bande del marker siano visibili (se il marker scelto contiene 10 molecole di DNA con peso molecolare diverso dovremo visualizzare 10 bande), ciascuna banda visualizzata dovrà essere correlata ad un certo peso molecolare. A questo punto è sufficiente misurare in cm la distanza di migrazione del campione di DNA (a partire dalla tasca di caricamento) ed estrapolare dalla retta di taratura il suo corrispondente peso molecolare. Ogni volta che fai la misurazione devi inserire il marker perché la distanza di migrazione della retta di taratura è in funzione della corsa elettroforetica. La retta di taratura. Nella striscia A c'è il marker. Per ognuna delle bande visibili del marker conosciamo

Il peso molecolare (grazie alla dittache produce il marker e ce lo indica quando lo acquistiamo) con un righello, posiziona lo 0 a livello della tasca di caricamento e poi calcola i cm dimigrazione che ogni banda del marker percorso. La migrazione maggiore la avrà la banda a peso molecolare più basso.

NEL GRAFICO si pone: In ascissa si pone la distanza di migrazione in cm. In ordinata il peso molecolare. La retta avrà pendenza negativa perché maggiore distanza = maggiore peso molecolare. Se dobbiamo calcolare il peso molecolare delle bande incognite basta misurare la distanza delle bande del campione in cm, riportarlo sulla retta di taratura e risalire al peso molecolare del campione.

In molti casi si valuta anche intensità e spessore delle bande di elettroforesi ottenute, significache lì si sono impaccate più molecole di DNA con lo stesso peso molecolare.

14 Amplificazione in vitro del DNA Tecnica su cui si basano tutte le altre metodiche di

biologia molecolare; ha rivoluzionato il modo di compiere le analisi biologiche, microbiologiche e mediche. Questa metodologia d'analisi la si deve ad uno scienziato Kary Mullis che la ideò nel 1983 e che per questo ottenne il Nobel per la chimica dieci anni dopo. La tecnica acquista il nome di PCR (Polymerase Chain Reaction) e si basa su un principio semplice ovvero il tentativo di far compiere in vitro ciò che la cellula è abituata a svolgere in vivo: la replicazione del DNA; l'unica grande differenza è che mentre la cellula deve replicare il suo intero genoma noi siamo in grado di amplificare zone discrete del DNA e non l'intero genoma batterico. Come avviene la replicazione del genoma nelle cellule batteriche: La cellula deve replicare in toto il suo genoma che si trova in forma CCC superavvolto: non può svolgerlo completamente perché non ha sufficiente spazio; ecco perché ci sono enzimi o proteine che svolgono la loro azione di

Aprire alcune parti della sequenza in cui avverrà la sintesi del nuovo DNA nelle cosiddette forcelle di replicazione a partire da un punto specifico che è l'origine della replicazione. Le forcelle vengono aperte da specifiche licasi o "binding proteins" che stabilizzano all'interno della forcella i singoli filamenti per permettere che avvenga la replicazione; quando si è compiuta la forcella si chiude e si apre quella vicina e così fino alla fine. La replicazione del DNA si dice semiconservativa in quanto vengono utilizzati entrambi i filamenti di DNA come stampo per la sintesi del filamento complementare in modo che le cellule figlie abbiano un corredo genetico sia composto da almeno un filamento della cellula madre e sia il più simile possibile a quello di essa. La cellula usa una DNA polimerasi per copiare la sequenza nucleotidica dal filamento a quello complementare; il punto è che agisce solo in direzione 5'-3':

Per copiare entrambi i filamenti deve utilizzare un metodo diverso per uno e l'altro. Quando il filamento è singolo, la cellula, grazie alle sue DNA polimerasi, deve sintetizzare dei "primer" (corti oligonucleotidi) che siano complementari ad una specifica sequenza nel punto in cui la DNA deve iniziare la copiatura del DNA.

Per quanto riguarda il filamento 5'-3', non si pone alcun problema: la DNA polimerasi si mette all'inizio della forcella e replica in direzione complementare del filamento; per quanto riguarda il filamento antiparallelo, 3'-5', la DNA polimerasi dovrà sintetizzare più primer in quanto la copiatura va in direzione opposta allo scorrimento della forcella: si formano i cosiddetti "frammenti di Okazaki" che verranno successivamente uniti da una DNA ligasi.

Per effettuare ciò in vitro bisogna avere una DNA polimerasi che abbia gli stessi requisiti di quella che si trova all'interno.

Il processo di replicazione del DNA avviene all'interno della cellula e presenta diverse caratteristiche:

• L'enzima DNA polimerasi agisce in direzione 5' - 3'.
• La replicazione inizia con un tratto a doppio filamento e richiede l'accoppiamento di primer ai filamenti stampo da replicare.
• Se si desidera replicare una zona specifica, questa deve essere delimitata da due filamenti, uno di inizio e uno di stop.
• I nucleotidi trifosfato (dNTP: desossinucleotidi trifosfato) sono i "mattoni" utilizzati dalla polimerasi per sintetizzare il nuovo filamento. La cellula li produce all'occorrenza, ma noi dobbiamo averli disponibili (uno per ogni base azotata).
• È necessario utilizzare uno strumento chiamato termociclatore per impostare i cicli termici che aprono e richiudono i filamenti del DNA tramite denaturazione.

È importante ricordare che possiamo amplificare solo regioni discrete di DNA e che la DNA polimerasi utilizzata è termostabile, nota come Taq polimerasi (il nome deriva dal genere e dalla specie del microrganismo da cui è stata isolata: Thermus aquaticus).

è unarcheobatterio che è stato isolato da sorgenti termali e che ha l’optimum di temperatura intorno ai 72-75°C ed è stabile anche a 100°C, caratteristica molto rara, la polimerasi umana non ha questa caratteristica. Le DNA polimerasi non termostabili riescono lo stesso ma in modo molto meno efficiente, più lungo e complesso).

Va prestata attenzione anche alla coppia di primer che vengono utilizzati; ci sono ditte che li producono ma siamo noi a dover “disegnare” i primer che vogliamo utilizzare negli esperimenti e la loro direzione (5’-3’). 16 La lunghezza di un primer varia a seconda del tipo di esperimento e dalla regione da amplificare (circa 15-30 paia di basi); devono essere complementari alla regione a cui si devono attaccare in modo che la DNA polimerasi trovi in doppio filamento iniziale da cui partire con la replicazione; a volte può capitare che non si riesca a costruire un primer che contenga tutte le 20-30 paia.

di basi complementari al filamento a cui si deve appaiare, qualche nucleotide può cambiare l'importante è che l'appaiamento sia del 100% in prossimità della direzione 3' dove si lega la DNA polimerasi. Come vengono disegnati i primer? È importante saperlo perché, se sono disegnati in modo scorretto o non si legano correttamente per qualsiasi motivo si otterranno delle amplificazioni sbagliate. Esempio: NB: il primer forward è quello che si colloca all'inizio della sequenza da replicare e il primer reverse è quello che si colloca al termine della sequenza. Quando si hanno tutti i componenti si possono inserire contemporaneamente in una provetta; per quanto riguarda il DNA non è necessario che sia la sequenza da amplificare, lo si può collocare intero e, se i primer, sono corretti, la trovano: è un processo altamente specifico. Si aggiungono appunto i primer, i nucleotidi, la Taq polimerasi tutto

nelle giuste proporzioni(ci sono protocolli) e tutto ciò viene collocato nel termociclatore. A questo punto vengono svolti dei cicli di temperatura al cui termine si può ottenere un’amplificazione della sequenza target; ogni ciclo termico si compone di tre fasi:

• denaturazione
• appaiamento 17
• allungamento

Quando si colloca la miscela nel termociclatore la prima temperatura che va impostata è quella di denaturazione in modo che il filamento si denaturi e si separi in modo che si abbiano entrambi i due filamenti che possano funzionare da stampo. In presenza dei due primer si imposta un secondo valore di temperatura (di appaiamento) per far associare i due primer con le proprie sequenze complementari su ogni filamento: questa temperatura va al di sotto del valore calcolato della temperatura media di denaturazione termica del DNA: T° appaiamento = Tm(primer)-3°C. IL valore del Tm del primer varia a seconda del valore delle basi nucleotidiche: Tm =4(G+C) + 2(A+T)​. L'appaiamento dei primer consente alla DNA polimerasi di legarsi al DNA e di agire nella fase di allungamento o sintesi che avverrà in modo ottimale se portiamo la temperatura all'interno della provetta alla temperatura ottimale di azione della DNA polimerasi (circa 72°C). Ogni fase dura pochissimi minuti/secondi. Quando si svolge un'amplificazione significa che si vogliono ottenere numerose copie, perciò si svolgono più cicli di amplificazione (generalmente 25-30 cicli continui). Il primo ciclo non è specifico nel delimitare la regione amplificata ma lo sarà dal secondo ciclo in poi. 18. La Taq polimerasi può svolgere la sua amplificazione anche al di là della regione che noi desideriamo in quanto questa ancora non è definita da primer; quando inizia il secondo ciclo e i primer nella miscela iniziale vanno a legarsi nei siti opportuni rispetto al primo ciclo, si avrà.