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STUDIO DI FUNZIONE, DISTRIBUZIONE E MODIFICAZIONE DI UNA PROTEINA D'INTERESSE: FLIP, FRAP, FRET, microscopia multifotonica

TRASFEZIONE = introduzione DNA esogeno in una cellula

  1. trasfettare con il cDNA della proteina di interesse, clonato a valle di un promotore specifico, delle cellule in coltura
  2. proteine reporter (es: GFP) per seguire dinamicamente il processo

modifica del patrimonio molecolare di una cellula → sovraespressione o down-regolazione del materiale genetico → utile per studiare il ruolo di una proteina in meccanismi complessi

TRASFEZIONE STABILE = gene esogeno viene inserito nel genoma e viene espresso indefinitamente * più laboriosa

TRASFEZIONE TRANSIENTE = cellule in cui è penetrato il plasmide (3-40%) esprimono la proteina esogena * analisi in tempi brevi * per discriminare le cellule trasfettate → GFP co-trasfettata con cDNA di interesse: marcatore cellule trasfettate

METODI DI TRASFEZIONE:

  • chimici:
    • lipofectamine

lipidi cationici che legandosi al DNA ne facilitano l'ingresso per endocitosi / fusione con membrana → elevata efficienza → trasfettano anche linee cellulari resistenti ad altri metodi

fosfato di Ca (1977, S. Bacchetti e F. L. Graham) = mescolamento di:

  • soluzione tampone HEPES
  • soluzione di CaCl2
  • DNA da trasfettare
  • precipitato di Ca3(PO4)2 lega DNA → aggiunto al terreno di coltura permette ingresso del DNA nelle cellule

fisici:

  • elettroperazione = differenza di potenziale applicata ai lati della cuvetta contenente le cellule e il DNA da inserire → shock elettrico provoca buchi nelle membrane attraverso cui entra il materiale genetico → molto veloce → molte cellule → alta % di morte cellulare
  • microiniezione = inserimento del materiale esogeno direttamente nella cellula mediante un sottile ago → più frequente in clinica che in laboratorio → spesso usato per generare animali transgenici

trasduzione = trasportato da virus→ utilizzati adenovirus, retrovirus, lentivirus

Per discriminare le cellule in cui è avvenuta la trasfezione:

  • uso di vettori con markers di selezione: inserito un gene per la resistenza ad un antibiotico preceduto da un promotore costitutivo → aggiungendo l'antibiotico al terreno di coltura sopravvivranno solo le cellule in cui è avvenuta la trasfezione
  • uso di vettori con GFP: solo le cellule che presenteranno fluorescenza nel verde saranno quelle in cui è avvenuta trasfezione

IMMUNOFLUORESCENZA = sonda fluorescente legata ad anticorpi specifici che si legano selettivamente al proprio antigene

  • DIRETTA = Ab direttamente legati a fluorocromi
  • INDIRETTA = AbII coniugato a fluorocromo specifico per AbI

MICROSCOPIO A FLUORESCENZA

  • fonte di luce = oggetto stesso
  • necessario separare la luce che illumina dalla fluorescenza
  • microscopi a epifluorescenza = sorgente luminosa al di sopra del
elevata in profondità (su Z)• miglioramento del contrasto• possibilità di ottenere immagini tridimensionali del campione

verticale (lungo Z) → 3D

permette analisi time-lapse per eventi intracellulari dinamici

permette studi di co-localizzazione di antigeni

TECNICHE DI MICROSCOPIA CONFOCALE AVANZATA

  1. FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching)
  2. FLIP (Fluorescence Loss In Photobleaching)
  3. FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)
  4. BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer)

PHOTOBLEACHING= decomposizione irreversibile delle molecole fluorescenti nello stato eccitato mediante interazione con altre molecole prima dell'emissione

> fluoroforo in T1 (stato di tripletto) ha un tempo di vita lungo rispetto al singoletto

> più tempo per interagire con altre molecole

* interazione irreversibile → cromoforo perde capacità di luminescenza

FRAP= Fluorescence Recovery After Photobleaching

> bleaching per studiare caratteristiche dinamiche e morfologiche di ambienti cellulari

> recovery = molecole fluorescenti circostanti che diffondono nella zona

bleaching, è una tecnica utilizzata per studiare la diffusione delle proteine di membrana. Il processo prevede diversi passaggi: 1. Prima applicazione: osservazione della diffusione delle proteine di membrana per determinare il tipo di movimento e il coefficiente di motilità. Questo viene fatto utilizzando un doppio strato fosfolipidico marcato in modo fluorescente. 2. Illuminazione con il laser della zona target per eseguire il photobleaching. Questo processo consiste nell'indebolire o eliminare la fluorescenza delle proteine nella zona di interesse. 3. Spegnimento del laser per avviare il processo di recovery della fluorescenza. Durante questo periodo, le proteine fluorescenti iniziano a diffondersi nuovamente nella zona precedentemente photobleachata. 4. Osservazione della curva di recovery per determinare la velocità di recovery, che è correlata alla velocità di diffusione delle proteine fluorescenti. Inoltre, l'intensità della fluorescenza finale viene confrontata con quella iniziale per calcolare la differenza, che rappresenta la frazione immobile della proteina che non può diffondere liberamente. Altre tecniche correlate includono FLIP (Fluorescence Loss In Photobleaching) e FRET (Förster Resonance Energy Transfer). FLIP è simile a FRAP, ma il laser rimane acceso per monitorare la diminuzione della fluorescenza in una regione adiacente a quella del photobleaching. FRET, invece, viene utilizzato per monitorare i cambiamenti conformazionali e studiare le interazioni tra molecole biologiche, sfruttando il trasferimento di energia risonante.

trasferimento risonante di energia = trasferimento non radiativo di energia da un fluoroforo eccitato ad un altro nelle vicinanze

trasferimento di energia mediante interazioni dipolo-dipolo a lungo raggio

fluoroforo eccitato = dipolo oscillante

fluoroforo accettore = dipolo con una frequenza di risonanza simile al primo

fluoroforo donatore irradiato con λ del suo picco di assorbimento → emette fluorescenza

se spettro di emissione del donatore = spettro di assorbimento dell'accettore → NO fluorescenza MA trasferimento energia risonante all'accettore → emette fluorescenza es: CFP e YFP

spettri di emissione dei due fluorofori NON devono essere sovrapponibili

spettro di emissione e di assorbimento del donatore NON devono essere sovrapponibili per evitare auto-trasferimento

E assorbita da donatore → E trasferita → E emessa da accettore

modalità osservazione FRET:

  1. luce emessa alla λ max di emissione
dell'accettore → studio statico: distanza tra molecole in esame non cambia ↳ dipende da efficienza del processo che dipende da distanza tra donatore e accettore → 10-80 Å * misurando la variazione di efficienza è possibile quantificare lo spostamento * misurando l'efficienza a una distanza fissa è possibile quantificare la distanza → informazioni strutturali sulle macromolecole • E = efficienza • R = distanza tra le molecole • Ro = distanza critica di Förster = distanza alla quale l'efficienza E della FRET è del 50%: 20-60 Å 6R0 = metà dell'energia del donatore trasferita all'accettore, metà dissipata * per studio macromolecole: 20-90 Å 2) misurazione emivita del fluorocromo donatore in presenza e in assenza dell'accettore → studio dinamico: distanza tra le molecole variabile es: protein folding BRET > molto simile a FRET > donatore fuso con luciferasi daRenilla → attivata da celenterazina (substrato bioluminogenico naturale)> accettore fuso con proteina fluorescente> NO interazione tra molecole → solo luciferasi> SI interazione → proteina fluorescente> distanza <100Å MICROSCOPIA A SUPERRISOLUZIONE> Premio Nobel per la Chimica 2014> superamento del limite di diffrazione = limite entro il quale le nanostrutture molecolari possono essere distinte l'una dall'altra Esempi:> SIM = Microscopia a Illuminazione Strutturata → risoluzione ×2> STORM = Microscopia a Ricostruzione Ottica Stocastica → risoluzione x10 Tecniche basate su:> riduzione fisica della risoluzione:• STED (Stimulated Emission Depletion)• SSIM (Saturated Structured Illumination Microscopy)> modulazione spazio-temporale (ON-OFF) dei fluorofori:• PALM (Photo Activated Localization Microscopy)• FPALM (Fluorescent Photo Activation Localization Microscopy)• STORM (Stochastic OpticalReconstruction Microscopy)STED> utilizzo di fluorocromi inattivabili mediante λ specifiche ≠ da λ di eccitazione> illuminazione laser a 2 sorgenti focalizzate, pulsante e sincronizzate:• primo impulso: eccitazione fluorofori nel punto focale → immagine limitata dadiffrazione: spot di dimensioni finite• secondo impulso: STED: λ diversa dal precedente che diseccita i fluorocromi → profilod'insensità a simmetria radiale e nullo al centro (a ciambella)> riduzione della regione eccitata> risoluzione laterale: 20nm> risoluzione dipende solo da:• apparato sperimentale• potenza
Dettagli
Publisher
nalul
A.A. 2021-2022
54 pagine
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SSD Scienze biologiche BIO/06 Anatomia comparata e citologia
I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher nalul di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Metodologie di citochimica e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Università degli Studi di Milano o del prof Ricciardi Sara.