Metodologie di Citochimica

Metodologie di citochimica

Prof. Sara Ricciardi → sara.ricciardi@unimi.it

Prof. Chiara Rolando

Corso

• 2 lezioni a settimana:
• Martedì 14:30-16:30
• Venerdì 9:30-11:30

Ore: 36h frontali + 12h esercitazioni (Rolando)

Esame

Scritto: domande aperte (2h)

Analisi diagnostica

L'analisi diagnostica consiste nell'analisi di tessuti/cellule bioptiche per diagnosticare una malattia

• Strumenti = mezzi con cui viene svolta l'indagine; es: microscopio
• Tecniche = procedure con cui viene messa in atto l'indagine; es: colorazioni

Analisi morfologica

• Osservazione diretta di cellule vive → consente studio dinamico delle cellule
  • Stereomicroscopio, microscopio invertito, microscopio a contrasto di fase
  • Microscopio a fluorescenza per strutture auto-fluorescenti o trattate con sostanze speciali

Tessuto bioptico conservato in soluzioni fisiologiche (= soluzioni saline isotoniche contenenti ioni Mg e Ca)

Coloranti vitali: assorbiti da cellule viventi senza danni

• Osservazione di cellule morte → strutture preservate e stabili per anni
  • Potrebbero crearsi artefatti durante allestimento

1. Fissazione → arresto funzioni biologiche
2. Disidratazione
3. Inclusione in resina o paraffina
4. Taglio
5. Colorazione

Microscopia

Microscopi

• Ottico
• Fluorescenza
• Confocale
• Contrasto di fase
• Elettronico (TEM e SEM)

Compito del microscopio: ingrandire e risolvere

Limite o soglia di percezione umana = distanza minima per cui riusciamo a vedere un oggetto → 25µm; linea nera su fondo bianco: fino a 4µm

Limite o soglia di risoluzione umana = distanza minima per cui riusciamo a distinguere 2 oggetti → 100µm

All'aumentare del potere risolutivo → vedo strutture sempre più piccole

Schema ottico

Asse ottico = retta orizzontale che collega il centro dell'oggetto al centro della lente

Occhio = sistema ottico a focale variabile; immagine appare sulla retina

Lenti di ingrandimento → creano un'immagine retinica virtuale molto più grande dell'oggetto reale grazie a rifrazione dei raggi

• Lente semplice: mai superiore a 10× altrimenti aberrazioni
• Lente sferica di 1mm di diametro → ingrandimento fino a 350Å ma lente inutilizzabile perché:
  • Campo visivo strettissimo
  • Va tenuta vicinissimo all'occhio
  • Oggetto va tenuto a una distanza inferiore al suo diametro
  • Forti aberrazioni

In un microscopio composto → sempre 2 lenti semplici:

• Obbiettivo = lente convergente vicino all'oggetto
  • Molto potente
  • Fornisce un'immagine reale → immagine intermedia
• Oculare = lente convergente vicino all'occhio
  • Vede immagine intermedia e la ingrandisce
  • Forma immagine virtuale ingrandita

Ingrandimento totale = ingrandimento obbiettivo × ingrandimento oculare

Potere risolutivo aumenta più i punti che posso distinguere sono vicini

Limite risolutivo = distanza minima per cui riesco a distinguere 2 punti

Microscopio ottico

Parte superiore:

• Binoculare → 10x
• Obbiettivi → revolver con 4 obbiettivi: 4x, 10x, 40x, 100x

Stativo

Parte inferiore:

• Apparato di illuminazione
• Tavolo porta-vetrino

Utilizza radiazione ottica

Limite di risoluzione: 200-300mm

Equazione di Abbe:

0.61 • d = potere risolutivo = • λ = lunghezza d'onda • NA = apertura numerica

Radiazione ottica

1665: Newton divide la luce bianca nelle sue componenti monocromatiche per mezzo di un prisma trasparente

Luce bianca = somma di una serie di raggi ognuno con una propria lunghezza d'onda → spettro visibile

1850: Kirchof e Bunsen notano che ogni elemento chimico emette radiazioni con frequenze caratteristiche (già osservate e classificate da Fraunhofer nel 1814)

Radiazione elettromagnetica

• Radiazione = ogni forma di energia che si propaga mediante onde e/o particelle in moto; es: luce, suono, raggi cosmici, radioattività
• Radiazione elettromagnetica = oscillazione in accordo di fase di un campo elettrico (E) e uno magnetico (B) perpendicolari l'uno rispetto all'altro
• Oscillazione o onda = variazione periodica di una forma di energia, rappresentabile come un vettore

Vettore campo:

• Direzione vettore → direzione campo
• Punta freccia → verso campo
• Lunghezza segmento → intensità campo

Direzione di propagazione o raggio = linea geometrica lungo la quale si trasmette l'energia dell'oscillazione

Velocità di propagazione della radiazione ottica nel vuoto: c = 300 mila km/s (valore max)

• Dipende dal mezzo attraversato = / • λ = lunghezza d'onda → spazio percorso dalla radiazione durante un'oscillazione completa
• c → spazio percorso in 1s
• f = frequenza → numero di oscillazioni al secondo

Piano di vibrazione V = piano in cui giacciono E e la direzione di propagazione

Piano di polarizzazione = piano perpendicolare a V

Spettro radiazioni elettromagnetiche

• 3000-1 m → onde radio lunghe, medie, corte, ultra corte
• 1m-1mm → microonde
  • Onde radio e microonde prodotte da correnti alternate in circuiti oscillanti o da corpi caldi
• 1 mm - 800 nm → infrarosso
  • Radiazione termica prodotta dai corpi caldi
• 800-400 nm → radiazione ottica
  • Prodotta da transizioni elettroniche
• 400-10 nm → UV
  • Prodotta da varie sorgenti ad alta temperatura con forti effetti chimici

Colori = rappresentazioni psichiche di una determinata lunghezza d'onda:

• Viola: 400-450 nm
• Blu: 450-500 nm
• Verde: 500-580 nm
• Giallo: 580-600 nm
• Arancione: 600-650 nm
• Rosso: 650-800 nm

Sorgenti bianche = emettono spettro continuo che occupa tutto lo spettro ottico; es: sole, nubi, fiamme, corpi incandescenti

Rifrazione

Direzione di propagazione:

• Retta se mezzo è:
  • Omogeneo → stesse proprietà in tutti i punti
  • Isotropo → stesse proprietà in tutte le direzioni
  • Stessa velocità di propagazione in tutte le direzioni = / • n = indice di rifrazione del mezzo → sempre >1
  • c = velocità della luce nel vuoto
  • v = velocità della luce nel mezzo → sempre < c

Passaggio da un mezzo ad un altro divide raggio in 2:

• Raggio riflesso → angolo di riflessione = angolo di incidenza
• Raggio rifratto → angolo di rifrazione ≠ angolo di incidenza

Legge di Snell (1621):

sin • θ₁ = angolo di incidenza₁

sin • θ₂ = angolo di rifrazione

• V₁ = velocità nel mezzo 1
• V₂ = velocità nel mezzo 2
• n₁ = indice di rifrazione mezzo 1
• n₂ = indice di rifrazione mezzo 2

n₂/n₁ = indice di rifrazione relativo

Se mezzo 1 è il vuoto/aria → n₂/n₁ = indice di rifrazione assoluto

• Se n₂ > n₁ → θ₂ < θ₁ → raggio rifratto si avvicina alla normale
• Se n₂ < n₁ → θ₂ > θ₁ → raggio rifratto si allontana dalla normale

Angolo limite = θ₁ per cui θ₂ è 90° → raggio rifratto parallelo alla superficie di separazione

• Se θ₁ > angolo limite → riflessione totale; es: specchi e fibre ottiche

Dispersione

Divisione di un raggio incidente nelle sue componenti; es: prisma divide raggio bianco

• Ogni raggio viene rifatto in una direzione diversa a seconda di λ
• n dipende da λ

Diffrazione

Proprietà delle onde di aggirare un ostacolo e propagarsi anche dietro di esso

Principio di Huygens-Fresnel: ogni punto di un fronte d'onda si comporta a sua volta come sorgente secondaria di onde sferiche con la stessa frequenza della primaria

• Forma finale del fronte d'onda originario = sovrapposizione dei singoli fronti d'onda secondari

Interferenza

Risultato della combinazione di più onde

• Distruttiva → punti di minimo: zone di buio = onde fuori fase: intensità = 0
• Costruttiva → punti di max: zone di luce = onde in fase: intensità = doppio dell'intensità delle onde che hanno interferito

Esistono zone intermedie con interferenze né totalmente costruttive né totalmente distruttive

Figura di diffrazione

• Max centrale: ampio e intensamente luminoso
• Max secondari: laterali, più stretti e meno luminosi
• Max alternati a minimi
• Frange = variazioni discontinue dell'intensità luminosa

Diffrazione e interferenza si verificano solo quando le fenditure sono dell'ordine di λ (nm)

Modello di Airy

Figura di diffrazione da un'apertura circolare:

• Disco di Airy → funzione di λ e diametro della fessura; interferenza costruttiva
• Anelli concentrici di intensità decrescente

Profilo fotometrico: gaussiana

Sorgenti puntiformi:

• Distanza tra i centri << dimensione della singola macchia di diffrazione → unico disco di Airy
• Distanza tra i centri = diametro disco di Airy → 2 macchie di diffrazione

Criterio di Rayleigh: 2 sorgenti puntiformi sono distinguibili se la loro separazione angolare è > o = al raggio del disco di Airy

Lenti convergenti o positive

Superfici sferiche o piane centrate su un asse comune che fanno convergere in un punto unico un fascio di raggi paralleli

• Asse comune può essere piegato mediante specchi
• "Successione di infiniti prismi in cui l'angolo fra le facce decresce dai lati verso il centro

Fuoco (F) = punto di convergenza che giace sull'asse

Distanza focale = distanza lente-fuoco

Spessore maggiore al centro

Tipi:

• Biconvesse
• Piano-convesse
• Menisco-convesse

Apertura numerica (NA)

Max angolo sfruttabile dal sistema ottico per ricevere o emettere luce

• Direttamente correlata con il potere risolutivo
• Più è alto migliore è l'ottica → aumentabile:
  • Cambiando il mezzo es: olio invece che aria → aumenta n * il più possibile vicino a n vetro
  • Diminuendo la distanza di lavoro → aumenta α = sin • n = indice di rifrazione del mezzo; es: n aria = 1; n olio = 1,4
• α = angolo del cono di luce che colpisce obbiettivo
  • Limite teorico: 180°
  • Limite pratico: 143°

Formazione dell'immagine

3 elementi necessari:

1. Fonte di illuminazione
2. Campione da esaminare
3. Sistema di lenti

Illuminazione

• Illuminazione critica:
  • Alone luminoso della lampada a gas a fuoco sui campioni
  • Problema: creazione dell'immagine del filamento della lampadina sullo stesso piano dell'immagine del campione → illuminazione irregolare: riflessi e ombre
• Illuminazione Köhler:
  • Campione illuminato da immagine sfuocata della fonte di luce → illuminazione uniforme
  • Introduzione della lente-collettore = focalizza immagine della sorgente in corrispondenza del piano sociale anteriore del condensatore
  • Richiede:
    • Lente collettrice (o collettore) → focalizza luce sul piano del diaframma del condensatore
    • Diaframma di campo → adiacente al collettore, regola il diametro del fascio di luce emesso
    • Diaframma del condensatore → regola la divergenza del cono d'illuminazione e può limitare la NA dell'obiettivo
    • Lente del condensatore → raccoglie luce proveniente dal collettore e crea un fascio uniforme che investe il campione
  • Diaframmi:
    • Impediscono a luce diffusa/aberrata di raggiungere i piani immagine
    • Assicurano illuminazione adeguata e uniforme del campione
  • Ottimale per:
    • Campioni in campo chiaro
    • Campioni in campo scuro
    • Microscopia a contrasto di fase
  • Assicura:
    • Illuminazione ottimale
    • Alta risoluzione
    • Ottimale contrasto
  • 2 gruppi di piani focali coniugati alternati:
    • Piani di campo → formazione immagine: messo a fuoco l'oggetto o una sua immagine
    • Piani di apertura → illuminazione: messa a fuoco la sorgente o una sua immagine
  • 2 percorsi ottici interconnessi ma distinti
    • Intervenendo sui diagrammi si può regolare in modo indipendente:
    • NA
    • Luminosità campo visivo
    • Uniformità campo visivo
    • Ampiezza campo visivo
  • Configurazione in luce trasmessa:
    • Sorgente a monte del campione
    • Luce attraversa campione per tutto il suo spessore
    • Subisce rifrazione e diffrazione
    • Luce raccolta dall'obbiettivo a valle
    • NON adatta a:
      • Campioni opachi alla luce; es: ceramiche, metalli, circuiti integrati,...
      • Oggetti grandi / spessi
  • Configurazione in luce riflessa:
    • Percorso di illuminazione e formazione dell'immagine condividono la lente-obiettivo (anche condensatore)
    • Punto di raccordo: beam-splitter = dispositivo ottico in grado di dividere un raggio di luce in 2 parti
    • Diaframma di apertura lungo il percorso di imaging (tra obiettivo e rivelatore)
    • Piano coniugato tra sorgente e diaframma di campo
    • Qui diaframma di apertura
    • Coniugato con il piano focale posteriore dell'obiettivo

Aberrazioni

Sistema ottico ideale:

• Ortosopico = forma immagine geometricamente simile all'oggetto
• Stigmatico = ogni punto dell'oggetto ha un corrispondente unico nell'immagine

Fuoco localizzato in un punto che deve cadere sullo schermo

Sistema ottico reale:

• Presenta aberrazioni

Dispersione del fuoco = raggi luminosi si disperdono in uno spazio 3D → punti di fuoco anche fuori dall'asse ottico

Tipi di aberrazioni

1. Cromatica:
   • Longitudinale / assiale
   • Trasversale / laterale
2. Sferica
3. Coma
4. Astigmatismo
5. Curvatura di campo
6. Distorsione:
   • A cuscino
   • A barile

Aberrazione cromatica

Assiale

Alterazione della distanza dell'immagine

• L’immagine è al contrario!

Lente convergente scompone luce bianca nelle sue componenti → diversi punti di fuoco a seconda di λ

• Più è piccola λ → più F è vicino alla lente; es: luce blu → fuoco più corto; luce rossa → fuoco più lungo

Si presenta come alone attorno all'oggetto osservato: blu da una parte e rosso dall'altra

• Blu e rosso perché sono gli estremi dello spettro visibile

Correzione: combinazione di più lenti che si correggono a vicenda → obbiettivi acromatici; es: doppietto acromatico

Laterale

Alterazione della grandezza dell'immagine

Dovuta a dispersione dell'indice di rifrazione (come per a. c. assiale)

Radiazioni con varie λ cadono tutte sul piano di fuoco ma a differenti distanze sopra o sotto F

Alone attorno all'oggetto osservato

Aberrazione sferica

Tipica di tutti i sistemi con lenti sferiche

Raggi distanti dall'asse → focalizzati più vicino alla lente

Sfocatura più o meno importante

Correzione: lenti asferiche = curvatura non costante per far convergere tutti i raggi in un solo punto

• Accoppiamento di una lente concava e una convessa
• Complesse e costose
• Critica la posizione del campione → indicazione della dimensione del vetrino da utilizzare riportata sull'obiettivo

• Oggetti piccoli → minor aberrazione

Es: imaging cerebrale in vivo: spine dendritiche e bottoni sinaptici: ~1µm

Ottica adattiva che modula intensità/fase dei raggi luminosi su più segmenti della pupilla in parallelo per determinare l'aberrazione

Aberrazione coma

"Coma" da aspetto a cometa che assume l'immagine

• Solo quando i raggi incidenti sono molto inclinati rispetto all'asse ottico
• F raggi esterni ≠ F raggi parassiali → spostamento e allargamento del punto immagine
• Difficile da correggere

Aberrazione astigmatismo

Dovuta a lente NON perfettamente sferica

F raggi che passano per un piano ≠ F raggi che passano per il piano perpendicolare a questo

Immagine allungata in un senso e nell'altro

• Effetto più evidente più ci si allontana dall'asse ottico

Cerchio di confusione = punto in cui la composizione dell'immagine dà il disco di Airy rotondo

Correzione: uso di lenti perfettamente sferiche

Curvatura di campo

Raggi luminosi provenienti da un oggetto piano vengono messi a fuoco su una superficie curva (superficie di Petzval)

Immagine può essere messa a fuoco su molti piani

• Campione nitido o al centro o ai bordi
• Correzione: uso della manopola micrometrica
• Impossibile correggerla del tutto

Distorsione

Ingrandimento NON omogeneo

• A cuscino = ingrandimento minore al centro → immagine con bordi piegati all'interno
• A barile = ingrandimento maggiore al centro → immagine dilatata verso i bordi

Microscopia speciale

Soluzioni tecniche che sfruttano fenomeni ottici particolari e che si adattano a categorie speciali di oggetti

Tecniche avanzate di microscopia

• Campo chiaro
• Campo scuro
• Contrasto interferenziate (ICR)
• Contrasto in polarizzazione
  • Riconoscere i vari costituenti del campione
• Epifluorescenza → preparati naturalmente fluorescenti/legati a fluorocromi
  • Fluorocromi = legati selettivamente a strutture cellulari