Metodologie biochimiche

Cromatografia

La cromatografia è un insieme di tecniche che hanno lo scopo di separare una miscela nei suoi componenti, per permetterne il riconoscimento qualitativo e quantitativo. Queste tecniche sono basate sulla distribuzione differenziale dei vari componenti fra due fasi, fase fissa o stazionaria e fase mobile o eluente, che fluisce in continuo attraverso la fase fissa.

Possono essere di tipo analitico e preparativo, cambia la quantità di materiale di partenza e lo scopo per cui viene eseguita la separazione.

Il coefficiente di ripartizione definisce le proporzioni in cui un composto si distribuisce tra due fasi immiscibili, questo coefficiente è una costante ad una data temperatura ed equivale al rapporto tra la concentrazione della fase mobile e la concentrazione della fase stazionaria. In base a questo fisico della fase mobile possiamo classificare le tecniche cromatografiche in:

• Cromatografia liquida: La fase mobile è un liquido nel quale sono insolubili i componenti della miscela da

separare e la fase stazionaria deve essere insolubile nella fase mobile- Gas cromatografia: la fase mobile è un gas che funge da carrier per i componenti della miscela In base alla forma del letto cromatografico si differenziano: - Cromatografia su colonna: la fase stazionaria è contenuta all'interno di una colonna cilindrica che può riempire completamente oppure rivestire la superficie interna, rispettivamente colonna impaccata e tubulare - Cromatografia planare: la fase stazionaria è distribuita su una superficie piana, attaccata ad una matrice adatta e stratificata in strato sottile su una lastra di vetro, plastica o metallo Per queste tecniche vengono sfruttate le proprietà fisico chimiche delle sostanze, quali dimensioni, carica, solubilità e idrofobicità e la funzione biologica. In base ai principi chimico fisici che condizionano la distribuzione tra le due fasi, le tecniche cromatografiche si possono suddividere in: Ripartizione, adsorbimento,

scambio ionico, esclusione molecolare e affinità

Cromatografia su strato sottile

In questo tipo di tecnica si usano lastrine di vetro, plastica o metallo su cui si trova uno strato sottilissimo di fase stazionaria. Viene utilizzata principalmente per scopi analitici come la separazione e l'identificazione di molecole di piccole dimensioni come aminoacidi e piccoli peptidi.

Cromatografia su colonna

È molto diffusa e ha come supporto per le fasi stazionarie resine impaccate in colonne cromatografiche. Il tracciato completo che si ottiene per ciascuna sostanza eluita è detto picco cromatografico e ha la forma di una curva gaussiana. Quest'ultimo è identificato da:

• tempo di ritenzione: tempo impiegato da ciascuna sostanza per eluire dalla colonna fino all'istante in cui si registra il massimo del picco
• tempo morto: tempo di ritenzione di una sostanza non trattenuta dalla fase stazionaria, che ci impiega per uscire dalla colonna e arrivare al rilevatore

Tempo di ritenzione netto: tempo che ogni sostanza impiega ad uscire dalla colonna per le interazioni con la fase stazionaria

Volume di eluizione: volume di fase mobile richiesto per eluire l'analita dalla colonna

Volume morto: corrisponde al volume della colonna non occupato dalla fase stazionaria

La risoluzione del sistema cromatografico indica i gradi di separazione dei picchi, la capacità di separare completamente un'analita da composti molto simili ottenendo picchi separati estretti, questa risoluzione dipende da:

• Selettività: le bande devono essere più distante possibile
• Efficienza: capacità del sistema cromatografico di mantenere compatta la banda di eluizione di una sostanza lungo tutto il percorso della fase mobile, ottenendo picchi alti e stretti all'uscita della colonna. L'efficienza è determinata dal numero di piatti teorici, che è una misura del numero di trasferimenti che il soluto subisce tra la fase fissa e la fase mobile.

maggiore è il numero di piatti teorici maggiore è l'efficienza dellacolonna- capacità: indica la quantità di materiale che può essere separato nei suoi componenti senza causare una sovrapposizione di picchi Esclusione molecolare Tecnica che separa le molecole in base alle loro dimensioni, le fasistazionarie sono costituite da materiali porosi che hanno proprietà di setaccio e la fase mobile è un solvente. L'interazione avviene tra le proteine e la matrice polimerica, quest'ultima è fatta di microsfere con porosità controllata. Le proteine interagiscono con i pori delle microsfere mi vengono trattenute in base alla loro dimensione, se una proteina molto grande non interagisce con la matrice, esce con un volume di eluente pari al volume vuoto Applicazioni: purificazioni, determinazione massa molecolare ed issalazione Gel filtrazione (resa 80%, dopo ogni cromatografia la resina può essere riequilibrata e

In questa cromatografia la scelta del tampone da utilizzare per l'eluizione non è rilevante, deve avere una certa forza ionica per mantenere le molecole in soluzione perché non si formino aggregati. Molto importante la preparazione del campione che deve avere un volume abbastanza piccolo per evitare fenomeni di diffusione, ottimizzare il volume del campione su utilizzare il concentratore.

Cromatografia a scambio ionico si basa sull'attrazione che si verifica tra molecole cariche di segno opposto, questa tecnica base delle cariche presenti su una molecola in grado di interagire con lo scambiatore di ioni. La fase stazionaria è costituita da resine scambiatrici di ioni impaccate in colonne cromatografiche. Lo scambiatore visione è costituito da una matrice che porta legati covalentemente dei gruppi in grado di ionizzarsi in un ione fisso e in un contro-ione che può essere scambiato con qualsiasi altro ione dello stesso segno presente in soluzione.

gliscambiatori possono essere anionici, portano cariche positive escambiano anioni, e cationici, portano cariche negative escambiano cationi.

La reazione di scambio ionico è un processo reversibile che, per la legge di azione delle masse, raggiungerà un equilibrio la cui posizione dipende dalle quantità relative di contro-ioni presenti sulloscambiatore e nella soluzione.

Prima di eseguire questa cromatografia, la resina impaccata in colonna deve essere equilibrata con un tampone scelto a seconda delle caratteristiche del campione.

Volta caricato il campione sulla resina, quest'ultima viene abbondantemente lavata con lo stesso tampone in cui è stata equilibrata. In questa fase le molecole cariche di segno opposto alla carica dello scambiatore si legano alla resina, mentre le molecole neutre o con la stessa carica dello scambiatore vengono eluite.

L'eluizione si può operare variando il pH o la forza ionica, o entrambi; e può essere a gradiente.

continuo o discontinuo.

La cromatografia a scambio ionico è molto utilizzata nei processi di purificazione di proteine, perché permette di separare proteine che hanno una differenza di carica molto piccola, ha una resa del 50%. Alla fine della cromatografia la resina deve essere rigenerata prima di riutilizzarla utilizzando combinazioni di pH estremi concentrazioni di sali molto alte.

Cromatografia di affinità

Sfrutta le interazioni altamente specifiche che si possono instaurare tra le molecole biologiche, la selettività è altissima ed è basata sulla conoscenza approfondita della struttura e delle proprietà di legame della molecola che si vuole purificare. Le matrici utilizzate sono particelle sferiche, uniformi e solitamente costituite da derivati del destrano, dell'agarosio, da poliacrilammide e cellulosa. Queste matrici sono inerti e quindi è necessario attivarle introducendo gruppi reattivi che serviranno per immobilizzare il ligando.

che è di solito legato ad un braccio separatore per renderlo più accessibile alla molecola. È possibile scegliere come ligando una molecola che abbia specificità assoluta di legame per una singola molecola, oppure una molecola che abbia una selettività per un determinato gruppo chimico. Il tampone usato per equilibrare la resina di affinità deve favorire la massima interazione tra ligando e molecola da separare, l'eluzione prevede l'uso di un eluente specifico, con l'aggiunta del ligando libero, o aspecifico, cambiando pH o la forza ionica. Cromatografia di adsorbimento si basa sulla capacità di alcuni materiali solidi di legare con interazioni deboli (adsorbire) le molecole sulla superficie, può essere il gas-solido o liquido-solido a seconda della natura della fase mobile. Sfrutta le interazioni intermolecolari tra sostanze idrofobiche o tra sostanze polari ed è utilizzata per separare sostanze neutre polari o non polari.di natura organica o inorganica Cromatografia di ripartizione Durante l'eluizione, le molecole si ripartiscono dinamicamente tra le due fasi secondo la diversa solubilità di ognuna. Questa cromatografia è chiamata in fase normale, la fase stazionaria è più popolare della fase mobile, fase inversa se la stazionaria è meno popolare della fase mobile. Tecniche elettroforetiche L'elettroforesi descrive la migrazione di particelle cariche all'interno di un mezzo fluido sotto l'azione di un campo elettrico. Indica una serie di tecniche per separare molecole cariche in un campo elettrico, ai fini di un'analisi qualitativa e quantitativa. Il campo elettrico è generato applicando una differenza di potenziale tramite due elettrodi posti ad una distanza, questo campo induce la mobilità di una molecola di carica q verso l'elettrodo di carica opposta, e la forza che agisce su questa molecola è data dal prodotto E*q; A

questa forza ti oppone una resistenza, detta forza frizionale, che dipende dalle dimensioni dellamolecola, dalla forma, dalla viscosità del mezzo in cui si effettual'analisi e dalle dimensioni dei pori del supporto utilizzato. Quindi la velocità della migrazione elettroforetica di una molecola carica in un campo elettrico è data dalla relazione: v = Eq/f dove f è il coefficiente frizionale. La mobilità elettroforetica è definita come la velocità della molecola carica sull'intensità del campo elettrico, quindi lo spostamento fisico delle molecole, e si calcola in base alla mobilità di riferimento (Rf). La separazione in elettroforesi può essere effettuata in base: all