Metodologie biochimiche

DI AFFINITA’:

• possibile interferenza da parte del tag sull’attività della proteina d’interesse e/o sui saggi da eseguire sul

materiale purificato (il tag può essere posizionato all’Nterm o al Cterm della proteina di interesse, può essere

ottimizzato, più tag possono essere inseriti contemporaneamente)

• capacità della tecnica cromatografica di permettere di mantenere la proteina attiva e funzionale oppure anche,

se necessario, di essere efficace in condizioni denaturanti (la proteina sarà rinaturata in seguito mediante una

procedura di rinaturazione ad hoc:refolding)

• tipologie di pH e condizioni (additivi, riducenti, detergenti etc..) che la tecnica cromatografica tollera e che sono

eventualmente necessarie per la proteina d’interesse

Controllo dell’esito di una cromatografia di affinità: Si effettua l’analisi delle frazioni fluite mediante tipicamente SDS-

PAGE per verificare la purezza e si stima la concentrazione con Abs UV, BCA etc…)

Negli ultimi anni sono stati sviluppati diversi tipi di resine che sfruttano:

1. cationi differenti (Ni2+ oppure Co2+)

2. chetanti immobilizzati su resina differenti (NTA, TED, etc…)

3. matrici di natura e porosità differenti

Tutto al fine di produrre un sistema che sopporti il più ampio range di tamponi, sali, detergenti, riducenti, additivi in

genere e che abbia la massima specificità, riducendo il più possibile le interferenze di altre proteine a bassa affinità che

possono ritrovarsi alla fine della procedura come impurezze. 53

Altro tag che viene particolarmente utilizzato è lo Strep-tag : il peptide strep si lega alla streptavidina immobilizzata in

colonna.

Per l’eluizione si sfrutta l’affinità della biotina per streptavidina, capace di spiazzare il peptide strep perché entrambi si

legano nella medesima regione di legame.

Recentemente per aumentare la purificazione si sta sviluppando l’idea di mettere un doppio tag da un solo lato o sui

due lati (TANDEM), dello stesso tipo oppure e più frequentemente di tipologie differenti, etc…

Perché usiamo questa cromatografia di affinità?

Perché è facile da fare

✓ Perché concentra il campione : permette di avere un volume molto piccolo che dà una elevata purezza

✓ Cromatografia per interazioni idrofobiche (HIC)

Si basa sul fatto che esistono nelle proteine delle regioni che sono idrofobiche che possono interagire tra loro.

La complessità delle proteine fa si che spesso nella loro struttura vi siano porzioni idrofiliche con altre più idrofobiche :

queste ultime sono in genere almeno parzialmente protette dall’organizzazione tridimensionale della molecola,

presente in ambiente acquoso.

Questo tipo di cromatografia sfrutta la presenza di porzioni idrofobiche esposte nella struttura terziaria delle proteine,

suscettibili di interazioni con altri gruppi idrofobici disposti su una matrice utilizzata come fase stazionaria

cromatografica.

Per avere successo, l’interazione idrofobica necessita di concentrazioni saline medio-alte nella fase mobile. Ovvero

l’analita si lega preferenzialmente alla fase stazionaria in presenza di forza ionica eleva (l’opposto dello scambio ionico).

Un gradiente a decrescere di forza ionica (concentrazione salina) è la modalità tipica con cui si effettua l’eluizione degli

analiti.

Quello che succede è che se carico all’interno di una colonna che ha una fase stazionaria delle catene idrofobiche, in

base alla concentrazione di Sali, a bassa concentrazione di Sali queste proteine passeranno in maniera tranquilla come

se non ci fosse niente (parte idrofobica schermata); quando invece aumento la concentrazione di Sali la parte idrofobica

sarà esposta e permetterà l’interazione con la fase stazionaria.

RIASSUMENDO

• È un tipo di cromatografia che separa le macromolecole sulla base della loro idrofobicità di superficie.

• I Sali ad alta concentrazione tendono a sottrarre molecole d’acqua d’idratazione, le proteine tendono così ad

interagire fra loro (“salting out”).

Nella HIC le regioni idrofobiche così esposte (meno “solvatate”) tendono ad interagire con una fase

stazionaria costituita da gruppi idrofobici.

• È una cromatografia che risulta vantaggioso applicare ad esempio dopo il frazionamento con ammonio

solfato.

• L’eluizione può essere effettuata :

Con forza ionica decrescente oppure per “spiazzamento”

o Con detergenti non ionici (Tween 20, Triton X-100)

o

• Potenziali svantaggi :

In alcuni casi le condizioni di eluizione possono provocare denaturazione.

o Non è predicibile (può applicarsi bene ad alcune proteina ma non ad altre senza poterlo assumere a

o priori in base alla sequenza proteica). 54

27-03 Cromatografia ad alta pressione (HPLC & Co.)

HPLC sta per High Permorfance Liquid Chromatography, cromatografia liquida.

Tra le caratteristiche della cromatografia la superficie di scambio tra fase stazionaria e fase mobile è la più

importante.

La risoluzione aumenta con lunghezza colonna e n° piatti teorici (unità fondamentali di volume minime) per unità di

lunghezza.

Maggiore sarà la superficie e minore sarà il volume del piatto teorico aumento del numero di piatti teorici nella

→

colonna.

L’HPLC riduce le particelle per aumentare la superficie di scambio (n° di sfere in un certo volume aumenta se si

riducono le dimensioni delle sfere) à aumento della pressione necessaria per far passare la fase mobile attraverso la

fase stazionaria.

HPLC non è una metodo di separazione nuovo, ma solo un sistema più sofisticato per ottenere prestazioni più elevate.

Il vantaggio principale è che facendo una corsa in HPLC è dell’ordine dei minuti. Questo permette di analizzare molti

campioni consecutivamente in una giornata.

Comunemente, si pensa che la pressione alla quale funziona un cromatografo (ad esempio un “HPLC”) sia una

proprietà intrinseca dello strumento. SBAGLIATO!

La “pressione di esercizio”, alla quale lavora un cromatografo, è causata dalla colonna (senza colonna un cromatografo

pompa liquido a pressione ambiente!). L’impaccamento della colonna offre una resistenza più o meno grande al

passaggio dell’eluente, che viene vinta applicando un’opportuna “forza” (pressione) dalle pompe.

E’ quindi più corretto parlare di “contropressione” generata da una colonna. Ogni colonna genera una contropressione

sua particolare, che può anche variare durante la vita della colonna stessa.

La pressione va quindi associata alla colonna o a componenti che possano generare contropressione (filtri…), non al

cromatografo.

Contropressione generata da una colonna cromatografica :

η viscosità della fase mobile

v velocità lineare della fase mobile

L lunghezza della colonna

d diametro medio delle particelle di resina

p

θ costante strutturale adimensionale

I sistemi cromatografici si suddividono proprio in funzione delle pressioni di esercizio :

LPLC < MPLC < HPLC

La cromatografia liquida su colonna si divide in diversi tipi a seconda della pressione generata all’interno del

dispositivo durante il processo di separazione.

Cromatografia liquida a bassa pressione (LPLC: low pressure liquid chromatography): le pressioni sono

❖ inferiori ai 5 bar (1 bar = 0.1 MPa) poiché la resistenza opposta dalla fase stazionaria (per la sua natura fisica)

al flusso della fase mobile è minima.

Cromatografia liquida a media pressione (MPLC: medium pressure liquid chromatography): si generano

❖ pressioni tra 6 e 50 bar.

Cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC: high pressure liquid chromatography): si lavora con pressioni

❖ superiori ai 50 bar.

Nella pratica le differenze tra MPLC ed HPLC sono insignificanti e vengono adoperate le stesse apparecchiature e

procedure.

Entrambe le tecniche forniscono un eccellente grado di risoluzione, per cui si preferisce definirle con il termine di

cromatografia liquida ad alta risoluzione. 55

FPLC (= Fast Protein Liquid Chromatography) preferita per le proteine tipo di cromatografia specifica per fare una

→

purificazione di proteine, più rapida. Il vantaggio è che siccome molte volte in HPLC le condizioni sono denaturanti, per

avere una proteina attiva e correttamente foldata è preferibile utilizzare una FPLC.

FPLC differisce dalla cromatografia HPLC sopra descritta in quanto le resine della colonna sono materiali polimerici a

base di destrano o materiali polimerici sintetici (Superdex, Superose, Sephacryl ecc.), che sono, per il loro carattere

idrofilo e alta porosità particolarmente utili per la separazione dei biopolimeri.

Questi hanno una dimensione leggermente maggiore e una minore resistenza alla pressione rispetto al mezzo HPLC a

base di silice.

Tuttavia, i mezzi FPLC sono adatti per un flusso di fluido a pressioni nel range di 0,2-1 MPa, e l'efficienza di FPLC

oddisfa anche la maggior parte dei requisiti delle applicazioni di purificazione delle proteine.

Le colonne FPLC sono spesso realizzate in vetro borosilicato resistente alla pressione o in plastica resistente alla

pressione. Le parti metalliche esposte sono anche evitate nelle pompe e nei sistemi di tubazioni o sostituite con

Titanio.

Sia l'HPLC che l'FPLC offrono una migliore efficienza e sensibilità oltre a requisiti di tempo inferiori rispetto alle

convenzionali applicazioni cromatografiche.

Sistemi di rilevazione

La rivelazione può basarsi su diverse tecniche biochimiche; tuttavia quella che di gran lunga è prediletta su tutte le

altre è l’Assorbimento nella zona dell’ultravioletto, (anche se si possono tenere in considerazione come opzioni

possibili spettroscopia a fluorescenza, variazioni dell’indice di rifrazione, attività specifica, emissione di radioattività

etc).

Gli strumenti di rivelazione ad assorbimento montati su cromatografi per proteine (sempre a valle della colonna)

lavorano quasi sempre a lunghezze d’onda discrete che cadono nell’intervallo 190 – 220 nm o/e 260 – 280 nm.

E’ molto utile leggere anche la CONDUTTIVITÀ delle soluzioni in uscita dalla colonna (a valle); a tal fine oggigiorno i

sistemi cromatografici montano un rivelatore di conducibilità/ resistività.

Ciò permette di rendersi immediatamente conto della variazione di forza ionica delle soluzioni che fluiscono

attraverso la colonna (importantissimo nel caso di gradienti salini; vedi dopo scambiatori ionici).

Caratteristiche che un sistema di rivelazione deve idealmente possedere:

✓ Selettivo

✓ Non distruttivo

✓ Piccoli volumi