Metodologie biochimiche

Metodologie biochimiche

Cosa sono le metodologie biochimiche?

Le metodologie biochimiche comprendono tutte le tecniche impiegate nella ricerca biochimica per avvalorare o confutare sperimentalmente un’ipotesi scientifica.

Perché studiarle?

Comprendere le basi molecolari di processi fisiologici e patogenici.

• Disegnare e testare composti per comprendere il funzionamento delle macromolecole oppure sviluppare molecole di interesse diagnostico o terapeutico.
• Sviluppare enzimi di interesse biotecnologico/industriale.
• E molto altro ancora.

Lavoriamo principalmente in vitro!

Quali argomenti affronteremo?

1. Principi generali e tecniche per l’isolamento delle macromolecole
   • Fonti di estrazione / produzione di proteine per studi biochimici (tecnologie più attuali)
   • Solubilità e stabilità delle proteine (tamponi, sali, solventi, temperatura, etc.)
   • Salting in/out e metodi di separazione mediante precipitazione
   • Metodi di separazione mediante centrifugazione
   • Purificazione di proteine ricombinanti: metodi di estrazione, metodi di chiarificazione, tecniche cromatografiche
2. Tecniche di caratterizzazione delle macromolecole
   • Determinazione della purezza / identificazione / quantificazione di proteine: Elettroforesi di proteine mono e bidimensionale, Immunoblotting
   • Determinazione della concentrazione di un campione proteico, studi legati alla presenza di cromofori/cofattori: Spettrofotometria UV/VIS: cenni e applicazioni più comuni
   • Studi di aggregazione/dispersione e determinazione del peso molecolare: Dynamic Light Scattering, Esclusione dimensionale, Native Page
   • Studi di interazione proteina-proteina e proteina-ligando: Microcalorimetry, Quenching di Fluorescenza
   • Spettrometria di massa, X-Ray crystallography, EPR, NMR: cenni

L’esperimento: cos’è e come si progetta?

1. Stesura del protocollo
2. Strumentazione
3. Controlli positivi e negativi
4. Quaderno di laboratorio

Principi generali e tecniche per l'isolamento delle macromolecole

In un esperimento in cui vogliamo isolare delle macromolecole bisogna porsi delle questioni:

• Quanto materiale mi serve? (quantità). La quantità di proteina che occorre recuperare influenza la scelta del metodo di purificazione.
• Di che qualità? (qualità: quanto deve essere pura?). Il tipo di studio che si vuole eseguire detta i limiti di purezza che è necessario raggiungere (per studi strutturali serve una purezza studi di cinetica).
• Deve essere attiva o no? (nelle separazioni ci sono diversi agenti che possono denaturare la proteina. Questo dà due problemi fondamentali: un problema legato alla struttura stessa della proteina, mi serve che la proteina mantenga la sua struttura foldata, ripiegata correttamente).
• Che costi devo affrontare per produrlo? Con che riproducibilità? Il costo dei materiali (resine di affinità o scambiatrici ioniche) possono diventare fattori limitanti importanti soprattutto per purificazioni su grande scala.

Il bilancio va sempre tra qualità e quantità “adeguate allo scopo”, tempistiche contenute ed economicità del protocollo e riproducibilità. Ogni passaggio di purificazione è vero che aumenta qualità e quantità della proteina di interesse, ma è anche vero che ogni passaggio di purificazione fa perdere del materiale, quindi c'è un bilancio continuo tra quanto io voglio quella proteina purificata e quanto mi posso spingere avanti per non rischiare di averne troppo poca perché poi è inutile per i miei scopi.

Le proteine vengono prodotte per diversi scopi, tantissime per studi biochimici e non solo. L’estrazione è possibile farla in due modi:

• Estrazione da tessuti
• Produzione per via ricombinante (largamente preferita)

Proteine ricombinanti

Si usa definire proteina ricombinante ogni proteina ottenuta da trascrizione e traduzione di un frammento di DNA, codificante la proteina di interesse, clonato in vettori di espressione (elementi di DNA circolante), inseriti (trasformazione o trasfezione) all’interno di un organismo ospite che, dividendosi e con la sua proliferazione, produrrà questa proteina di interesse che poi potrà essere purificata.

In sostanza è una proteina esogena che viene espressa in un organismo che normalmente non la esprime o la esprime molto poco, e viene espressa attraverso un vettore che ne permette l’espressione in alta quantità. Un vettore di espressione presenta una resistenza perché deve poter essere selezionato l’ospite che ha internalizzato il vettore. C’è un sito di policlonaggio in cui posso inserire la proteina ed è importante che sia in frame con il promotore perché la proteina deve essere trascritta in modo corretto per essere attiva e completamente funzionante.

Quindi ci devono essere una resistenza per l’ospite, un promotore forte e il sito di policlonaggio in cui inserire la proteina. Gli ospiti possono essere:

• Procariotici
  • Batteri (E. coli) ma anche B. subtilis, L. lactis, C. glutamicum
• Eucariotici
  • Lievito (S. cerevisiae, S. pombae, P. pastoris)
  • Cellule di insetto (Baculovirus)
  • Cellule di mammifero in coltura (CHO etc.)
  • Animali transgenici
  • Piante transgeniche

I più usati sono i batteri, i lieviti e cellule dei mammiferi.

Procarioti

Prendiamo in considerazione E. coli. Il plasmide ricombinante è utilizzato per trasformare i batteri, questi vengono fatti crescere. Un primo screening è fatto su piastre di terreno solido dopodiché la produzione a livello più massiccio è fatta in terreni liquidi. Un vantaggio di questi plasmidi è che possono essere indotti con IPTG (questa induzione permette di far esprimere la proteina solo in determinati momenti e non costitutivamente).

Vantaggi dei procarioti

• Hanno un background genetico molto semplice.
• Si riproducono velocemente.
• Hanno costi bassi.
• Si possono raggiungere livelli di espressione molto elevati.
• Sono molto semplici da purificare.
• Buona stabilità.
• Forte capacità anti-inquinamento.
• Ampio range di applicazione.

Produzione per via ricombinante in procarioti

Vantaggi

• Sistemi di espressione molto semplici da manipolare (la trasfezione è fatta con cationi bivalenti o tramite elettroporazione).
• Produzione di proteine in grande quantità e a basso costo.
• Rischio di contaminazione virale nullo.

Problemi

È difficile ottenere proteine che mantengano la conformazione nativa delle proteine (i sistemi di folding dei batteri sono molto meno sofisticati che negli eucarioti). I batteri mancano di adeguate modificazioni post-traduzionali (glicosilazione, tagli proteolitici, fosforilazione, aggiunta di lipidi). Importante è anche l’antigenicità: molte proteine ricombinanti vengono usate per produrre vaccini o un anticorpo (per fare l’immunoblot). Molte volte le parti glicosilate della proteina sono le parti antigeniche cioè quelle che permettono il riconoscimento degli anticorpi e quindi se mancano di queste strutture potrebbero essere prodotti anticorpi non funzionanti.

Espressione in procarioti – E. coli

Vantaggi

• Numerosi vettori specifici (λ phage e pUC plasmid derivatives).
• Efficienza di trasformazione molto alta.
• Processo di fermentazione ben conosciuto.
• Semplice recupero di cellule e facile lisi.
• Espressione proteica controllabile (sistemi inducibili).

Svantaggi

• Cellule non naturalmente competenti.
• Le proteine ricombinanti ottenute non hanno le modifiche post-traduzionali.

In questa tabella è possibile osservare i ceppi di batteri che si sono sviluppati e che hanno determinate caratteristiche che ne permettono l’utilizzo. I più utilizzati sono BL21, Origami e Rosetta. Questo rientra nel discorso che riguarda la scelta corretta dell’ospite. Devo conoscere bene la proteina che voglio ottenere perché in base a questo posso scegliere il ceppo di batterio o il lievito o il sistema cellulare che mi permette l’espressione migliore della proteina.

• BL21: esprime la RNA polimerasi del fago 17 a seguito di induzione con IPTG. È difettivo delle proteasi Ion e ompT (questo serve perché quando è prodotta la proteina esogena all’interno del batterio, questi batteri ingegnerizzati in questo modo, hanno una ridotta capacità di degradare proteine esogene e quindi la proteina esogena sarà più facilmente mantenuta ed espressa da questi batteri.
• Origami: ha mutazioni sui geni trxB e gor. Facilita la formazione dei ponti disolfuro citoplasmatici (se abbiamo una proteina che si basa molto sulla formazione di ponti disolfuro e quindi la sua struttura è molto regolata dall’ambiente riducente o ossidante, essendo che in questo ceppo si facilita la formazione dei ponti disolfuro e quindi la proteina che ha queste caratteristiche viene più facilmente espressa in un ceppo di questo tipo).
• Rosetta: sovraesprime i tRNA per i codoni rari. Facilita l’espressione di proteine eucariotiche.

Eucarioti

Vantaggi rispetto ai sistemi procariotici

Gli eucarioti hanno il vantaggio di avere il macchinario per fare le modifiche post traduzionali che servono alla proteina e quindi favoriscono:

• Formazione corretta dei ponti disolfuro
• Folding corretto
• Taglio proteolitico da precursore
• Glicosilazione
• Modficazione di amminoacidi (fosforilazione, acetilazione, miristilazione etc.)

Produzione per via ricombinante in eucarioti – Saccharomyces cerevisiae

Vantaggi

• Moderata espressione del prodotto
• Facile ricombinazione
• Processo di fermentazione ben conosciuto
• Le proteine ricombinanti hanno le modifiche secondarie (es. glicosilazione)
• Semplice recupero di cellule e facile lisi

Svantaggi

• Efficienza trasformazione medio-bassa
• Limitata varietà di vettori disponibili
• Iperglicosilazione
• Degradazione proteolitica/instabilità proteica

Cellule animali

Il sistema migliore sono le cellule umane che possono essere trasformate in due modi:

• Primo modo (a sinistra): il plasmide è internalizzato con lipidi, si formano complessi DNA-lipidi che poi vengono inseriti per endocitosi all’interno della cellula. Questo è il funzionamento tipico delle lipofectamine. Le lipofectamine sono lipidi più o meno tossici, si formano questi complessi che si mettono sopra le cellule nel terreno di coltura, e questi vanno a fondersi con le membrane delle cellule facendo entrare all’interno il plasmide che esprime la proteina. Generalmente questa modalità ha efficienza di trascrizione molto bassa (ci sono linee cellulari che sono più propense ad essere transfettate).
• Recentemente si è sviluppata la traduzione con vettore lentivirale (a destra) che fa aumentare di molto l’efficienza di trascrizione. Si parte da una linea cellulare in cui vengono espressi tutti i componenti della struttura virale (non la parte infettiva ma la parte che permette l’aggancio alla cellula e quindi il trasferimento del materiale genetico). Queste cellule vengono trasformate con il plasmide di interesse. Man mano che queste cellule crescono, producono particelle virali e le rilasciano nel terreno di coltura. Si prende poi il terreno di coltura che contiene le particelle virali e si trasferisce sulle cellule che si vogliono trasdurre. A quel punto i virus infetteranno la cellula, si fonderanno e rilasceranno all’interno il DNA che deve essere espresso.

Tra i due metodi c’è differenza nel livello di trasfezione, espressione. Nelle cellule animali abbiamo una trasfezione transiente e una trasfezione stabile. Una trasfezione transiente (più veloce) si esegue con le lipofectamine. Si transfettano le cellule, si verifica che sovraesprimino la proteina e queste la sovraespressione la manterranno per un numero limitato di generazioni. Siccome il DNA non si integra all’interno del genoma, man mano con le generazioni cellulari viene perso e quindi con il passare del tempo ci saranno cellule che non esprimono più la proteina. Nella trasfezione stabile (che richiede passaggi in più) in questo caso si fa una selezione con un antibiotico: il DNA si va ad integrare con il genoma e bisogna selezionare le cellule che esprimono assieme alla proteina la resistenza a quel determinato antibiotico. Processo molto lungo che richiede più settimane dopodiché vengono separati i singoli cloni. Non si possono staccare i singoli cloni e metterli insieme per velocizzare il processo perché quei cloni possono essere diversi: potrebbero aver integrato solo l’antibiotico e non la proteina di interesse, potrebbero avere solo le proteine di interesse e delle resistenze, potrebbero avere dei falsi positivi. Quindi quello che si fa è che bisogna separare i singoli cloni, la singola cellula e in ogni pozzetto viene seminata ogni singola cellula. A questo punto si espande il clone arrivando ad avere una quantità di cellule notevole. A questo punto bisognerà rianalizzare i cloni per vedere se sovraesprimono la proteina di interesse e a quel punto sarà possibile fare gli stock. Il processo passa da tre-quattro giorni ad un mese e mezzo. (questa è una differenza sostanziale rispetto ai batteri nei quali in tre giorni si può ottenere una proteina, in questo caso più di un mese).

Espressione in eucarioti: colture di cellule animali

Vantaggi

• Esatta glicosilazione
• Possibilità di transfezioni stabili e transienti
• Alcune linee crescono in sospensione (SPO)
• Alcune linee carcinoma derivate (HeLa cells) crescono molto rapidamente

Svantaggi

• Alcune linee crescono come monostrato aderente
• Colture cellulari che richiedono scrupolosa manualità
• Tempo di duplicazione molto lungo (5-25h)
• Colture cellulari suscettibili a contaminazioni
• Colture cellulari suscettibili a stress ambientali (conc. CO₂, umidità, etc.)

Sistema di induzione nei procarioti

Molto importante nei procarioti è il sistema di induzione. Alcune proteine possono essere tossiche per l’ospite: quando transfetto all’interno di un ospite una proteina che per l’ospite è tossica la resa e la purificazione non si ottengono perché se la proteina viene espressa diventa tossica per l’ospite che muore. È stato progettato un sistema basato sui repressori che esistono nei batteri e questo fa sì che la proteina, anche se il plasmide è all’interno della cellula, non viene espressa fino a quando non gli diamo un induttore. In questo caso il sistema funziona con l’IPTG che mima il lattosio che c’è sull’operone lac. I batteri hanno all’interno del genoma una regione D3 (?) dove c’è l’operone lattosio che controlla l’espressione del gene per la T7 RNA polimerasi. Finché non c’è l’IPTG non viene prodotta l’RNA polimerasi che serve per esprimere la mia proteina dal vettore, perché nel vettore la proteina è sotto il controllo dell’operone lac e sotto il controllo della T7 RNA polimerasi. Quindi fino a quando non ho l’IPTG presente, non si attiva la trascrizione dell’RNA pol che serve per trascrivere la proteina e nemmeno la trascrizione della proteina stessa.

Strategia della purificazione

1. Clonaggio del cDNA codificante per la proteina di interesse in un vettore di espressione opportuno (che dipende dal tipo di ospite che prendiamo in considerazione).
2. Scelta della cellula ospite per l’espressione.
3. Verifica dell’espressione della proteina di interesse.
4. Verifica della funzionalità della proteina di interesse.
5. Produzione su larga scala della proteina
6. Purificazione e caratterizzazione

Questi, in particolare, sono i passaggi che vengono utilizzati dall'industria.

Come potrebbe essere più facile purificare una proteina dopo averla espressa in un ospite?

Come riconoscere la proteina se non abbiamo a disposizione un anticorpo specifico o la stessa non ha un’attività rilevabile

Proteine di fusione

È possibile mettere insieme alla proteina un tag. Quando esprimiamo una proteina possiamo attaccare si può attaccare in frame una parte più o meno piccola che può servire sia per la purificazione sia per il riconoscimento. Questo si fa attraverso le proteine di fusione o chimeriche. Una proteina di fusione non è altro che una proteina ibrida che ha una parte TAG che può essere sia messa al N che C terminale. Ha vantaggi nel migliorare l’espressione della proteina, può migliorarne la solubilità, può facilitarne il rilevamento e la purificazione. Questo tag può essere di due tipi principali:

• Peptide
• Proteina

Principali tag peptidici

His-tag è una sequenza da 6 a 10 residui di istidina che vengono attaccati alla proteina di interesse. L’his-tag permette una purificazione e identificazione più facile della proteina, specialmente se non ha un anticorpo o un’attività enzimatica. Questa serie di istidine si può facilmente purificare attraverso una cromatografia di affinità. Se purifichiamo una proteina, tutto l’omogenato prodotto dai batteri, lo facciamo passare attraverso una colonna in cui c’è una matrice in cui sono immobilizzati ioni metallici,