Metodologie biochimiche

METODOLOGIE BIOCHIMICHE

- Unità di misure delle concentrazioni: mole, molarità, ecc.

- Acidità e basicità, pH, soluzioni tampone

- Nozioni basi di chimica organica: gruppi di sostanze organiche, gruppi

funzionali

- Nozioni basi di biochimica strutturale: molecole di interesse biologico e

macromolecole biologiche: struttura proprietà e funzioni

Lez. 1b

ExPASy (Expert Protein Analysis System) server per analisi di sequenze proteiche

da cui si possono ricavare molte informazioni

Nuove discipline approccio olistico: approccio che tende a guardare nell’insieme un



determinato aspetto degli organismi genomica, trascrittomica, proteomica,



metabolomica. Queste discipline vengono chiamate anche “omics”. Anche

epigenomics: microbiomics:

come le molecole modificano l’attività genica; studio dei

genomi complessivi di tutti i microrganismi.

Scelta del metodo analitico: diverse scelte bisogna considerare parametri quali



precisione, accuratezza e limite di rilevamento dei vari metodi analitici; presenza nel

campione di altri componenti che possono interferire con l’analisi; costo potenziale del

metodo; possibili pericoli e rischi; metodo di riferimento riportato in letteratura o

preferenza personale.

Come si esprime la CONCENTRAZIONE

- Peso [massa] per unità di volume (p/v o w/v; [m]/v);

- se la sostanza è un solido in una massa solida si usa Peso [massa] per unità di

peso [massa] (p/p; [m]/[m];

- se si tratta di un liquido in una soluzione si usa volume per unità di volume

(v/v);

- percentuale in peso o in volume:

10% p/v= 10g in 100 mL di soluzione

10% v/v = 10mL in 100 mL di soluzione (questa è ad esempio la misura della

gradazione alcolica delle bevande alcoliche)

- molarità M = mol/L o i suoi sottomultipli mM = mmol/L; μM = μmol/L

 

-6

1μM = 0,001 mM = 10 M

1mM = 0,001 M

Molto spesso i biochimici hanno a che fare con concentrazioni molto diluite,

come gli enzimi o i loro substrati, vengono definiti da concentrazioni

micromolari (μM) o millimolari (mM)

- massa molecolare (u.m.a., Da, kDa, g/mol) vs massa molecolare relativa

(M , adimensionale)

r

- Parti per milione (ppm) e parti per miliardo (ppb):

Significa il n° di parti presenti in una miscela, rispetto a un milione o miliardo di

parti della stessa miscela espressi nella stessa unità di misura. Quindi:

1 ppm = 1 mg/kg

1 ppb = 1 mg/t = 1μg/kg

Per soluzioni acquose, se la densità è circa 1 kg/L o circa 1 mg/mL (nel caso di

soluzioni diluite!):

1 ppm = 1 mg/L

1 ppb = 1 μg/L

Queste unità di misura si usano particolarmente nelle sostanze inquinanti aeree

disperse, in queste:

3aria

1m = 1kg 3aria

1ppm = 1mg/m

3aria

1ppb = 1μg/m

Preparazione di soluzioni

Se noi abbiamo delle sstanze solide, la domanda di solito è quanti grammi devo

pesare per preparare un volume noto di una soluzione avente un cerca

concentrazione?

L’equazione da usare è:

quantità da pesare = (concentrazione) x (volume) x (peso molecolare)

grammi (g) = M (moli/L) x L x g/mole

(se dobbiamo preparare una soluzione diluita potremmo avere a che fare con

milligrammi) milligrammi (mg) = mM (millimoli/L) x L x mg/millimole

(se devo preparare un volume molto basso) milligrammi (mg) = M (millimoli/mL) x mL

x mg/millimole

Un altro sistema per preparare le soluzioni è quello di avere già delle soluzioni

“stock” o “madri” hanno una concentrazione maggiore di quella che si deve

utilizzare, è quindi necessario diluirla come effettuare le diluizioni:



C x V = C x V = quantità di materia (moli, grammi)

iniz iniz fin fin

Di solito l’incognita è il volume iniziale, cioè quel numero che risponde alla domanda

quanti mL (o L) di una soluzione 5M di NaCl devo utilizzare per preparare 1L di una

soluzione 1M?

FATTORE DI DILUIZIONE = F = C /C = V /V è sempre un numero



d iniz fin fin iniz

maggiore di 1

La FORZA IONICA: dipende dalla concentrazione, ma è qualcosa di differente è



definita come la sommatoria di tutte le contrazione di tutti gli ioni presenti in una

soluzione, ciascuna moltiplicata per la carica dello ione elevata al quadrato, il tutto

diviso 2.

È importante perché dalla forza ionica dipendono le interazioni di tipo ionico 

un’elevata forza ionica sfavorisce le interazioni ioniche e favorisce le interazioni

idrofobiche (importante nei processi di purificazione delle proteine e per l’effettuazione

di esperimenti in campo isochimico, esempio la funzionalità degli enzimi può essere

influenzata dalla forza ionica). La forza ionica non è la stessa cosa della

concentrazione perché dipende dalla carica degli ioni e dagli ioni stessi, non dalle

molecole.

Esempio: calcolare la forza ionica di una soluzione 1M di NaCl (sale ionico che si

+ -

dissocia completamente in acqua a dare Na e Cl , entrambi ioni con una carica singola

+ -

e che hanno una concentrazione pari a quella del sale, quindi 1M Na e 1M Cl )

in questo caso corrisponde alla concentrazione, ma



non è sempre così

Se analizziamo un sale come l’ammonio solfato (NH ) SO , questo si scinde

4 2 4

4+ 42-

completamente in H O a dare ione ammonio 2NH e ione solfato SO , ma il rapporto

2

stechiometrico tra ione ammonio e sale è 2, quindi 

vuol dire che a parità di concentrazione un sale come l’ammonio solfato fornisce



una forza ionica molto maggiore rispetto all’NaCl

Differenza tra attività e concentrazione attività e coefficienti di attività



Quando abbiamo a che fare con soluzioni diluite la differenza tra attività e

concentrazione è trascurabile dal pdv pratico. Però, in alcuni casi, come ad esempio

negli acidi concentrati (acidi deboli) c’è una gamma (coefficiente di attività) che

può discostarsi da 1 e quindi l’attività, che è la concentrazione attiva della sostanza

in soluzione, non corrisponde proprio alla sua concentrazione, perché c’è il coefficiente

di attività che è sempre minore di 1 e a volte può essere significativamente minore di

1.

Lez. 2a

pH e SOLUZIONI TAMPONE

ionizzazione dell’acqua e pH

Il pH indica il grado di acidità di una soluzione, la definizione deriva dall’equilibrio

acido base dove si ha che in acqua un donatore di protoni cede il suo protone

all’acqua (si dissocia) e diventa una base coniugata. Questo equilibrio è regolato dalla

costante di equilibrio (costante di dissociazione).

Soluzione tampone una soluzione tampone ha la capacità di “tamponare” le



variazioni di pH di una soluzione in seguito all’aggiunta di un acido o di una base forte.

Una soluzione tampone è composta da:

- Un acido debole in presenza di un suo sale con una base forte

- (oppure) Una base debole in presenza di un suo sale con un acido forte -

Esempio 1: CH COOH e CH COONa (acido acetico e acetato di sodio) [HA] e [A ]



3 3

Esempio 2: NH OH e NH Cl (idrossido di ammonio e cloruro di ammonio) [A] e



4 4

+

[H A]

Equazione di Henderson-Hasselbalch

Si ottiene rimaneggiando l’equazione della costante di dissociazione, definendo il pH e

il Pk .

a

Quindi  per un tampone basato su un acido debole. La base

coniugata è la forma ionizzata, mentre la forma acido debole è quella non

ionizzata.

per un tampone formato dall’acido coniugato di una

base debole. la forma non ionizzata è la base coniugata, mentre l’acido

indissocciato è forma ionizzata.

acidi e basi di uso comune come soluzioni tampone: sul valore di pK si basa

 a

la capacità tamponante del tampone; in alcuni casi c’è più di un valore perché hanno

più di 1 protone dissociabile. Più la pK è bassa più la sostanza è acida e viceversa.

a

Il valore di pK è così importante perché se guardiamo il grafico che ci mostra la

a +

variazione del pH in funzione degli ioni H aggiunti alla soluzione, vediamo che

l’intorno della zona del pK è quello dove la curva risulta meno pendente e ciò vuol dire

a

che nella zona del punto intermedio (del valore di pK ), è massima la capacità

a

tamponante della soluzione in questo caso all’aggiunta di una quantità pari di acido



(se andiamo verso sx) o di base (se andiamo verso dx), si ha una minore variazione di

pH e vuol dire che quando scegliamo un tampone dobbiamo sceglierne uno tale per

cui il pH desiderato sia più vicino possibile al valore di pK del tampone stesso.

a

Se, ad esempio, vogliamo un tampone con pH=4,9 possiamo selezionare un

acido debole con pK più vicino possibile a tale valore. Il valore di 4,9 si

a -

ottiene poi cambiando il rapporto tra [CH COOH] e [CH COO ], perché 4,9 è

3 3

un pochino più basico di 4,74, quindi bisogna che cambi il rapporto tra le

concentrazioni. In questo caso, il valore di 4,74 indica che il suo intervallo di pH in

cui è efficacie è compreso circa tra 4,2/4,3 e 5,2/5,3.

Metodi di preparazione di un tampone: -

Un tampone è sempre costituito da un acido debole HA e dalla sua base coniugata A

+

oppure da una base debole B e dal suo acido coniugato B . In pratica può essere

preparato in vari modi:

- Si può partire da una soluzione pura dell’acido debole (esempio acido acetico) e

titolare con NaOH (vuol dire che una parte di questo acido viene man mano

salificato a dare acetato di sodio che costituirà la forma indissociata base

debole fino a quando il rapporto dà un pH identico a quello che si vuole

ottenere).

- Posso partire da una soluzione di base debole (esempio idrossido d’ammonio) e

titolare con HCl, in modo da salificare quella parte di base debole necessaria a

far sì che il pH arrivi al valore giusto.

- Se si ha a disposizione una soluzione di acido debole e del suo sale, si possono

mescolare le due soluzioni in modo tale da arrivare al pH desiderato.

- Si procede nello stesso modo se si ha a disposizione una soluzione di base

debole e il suo sale con l’acido forte.

In realtà non si mescola in modo da arrivare esattamente al pH desiderato, ma

si mescola per far sì che si arrivi a circa il pH desiderato e poi il pH finale viene

aggiustato titolando con una componente forte (acido o base a seconde del

tampone che stiamo utilizzando) fino ad arrivare al pH finale corretto.

“Aggiustamento” finale del pH di una soluzione tampone: avviene con l’utilizzo

di un “piaccametro” o “pHmetro”.

Caratteristiche/proprietà che deve avere un tampone utilizzabile nella

ricerca biologica:

- Deve avere una adeguata capacità tamponante nell’intervallo di pH desiderato;

- Deve essere commercialmente disponibile ad un elevato grado di purezza;

- Deve avere un’elevata solubilità in acqua;

- Deve essere chimicamente stabile (non deve essere soggetto a idrolisi o a

degradazione enzimatica);

- Il valore di pH del tampone non deve essere influenzabile da variabili ambientali

o di lavoro (temperatura, concentrazione, forza ionica, composizione del

mezzo). Un tampone molto usato che è il tris ha un pK influenzabile dalla

temperatura;

- Non deve formare complessi insolubili con cationi, importante perché ci sono

alcuni sali che precipitano se vengono messi in presenza con cationi bivalenti

(esempio tampone fosfato messo con Mg, Ca, ecc.);

- Non dovrebbe presentare assorbimento nella regione dell’UV/Vis;

- Non deve essere tossico o nocivo.

Lez. 2b

TECNICHE ELETTROCHIMICHE: si basano sulla misurazione di una differenza di

potenziale o di una corrente elettrica (parametri elettrici), generati grazie a delle

reazioni di ossidoriduzione.

Applicazione di queste tecniche per due scopi specifici: la misura del pH (tramite il

pHmetro) e la misura della concentrazione di ossigeno (tramite l’ossimetro o

ossigrafo).

Cosa sono le reazioni di ossidoriduzione sono reazioni chimiche in cui sono



coinvolte due semi coppie redox. Ognuna di queste è formata da due forme: una

-

forma è l’accettore di e (agisce da ossidante) e una forma è il donatore (agisce da

riducente). Ogni semi coppia redox è definita dal pdv elettrochimico, termodinamico

da un potenziale di ossidoriduzione (potenziale redox, E) = tendenza di un donatore

di elettroni a ridurre il suo accettore coniugato. Per convenzione le semi coppie redox

Ossidante + ne - 

vengono scritte sempre verso la direzione della riduzione quindi

Riducente. 0

È importante definire il potenziale redox in condizioni standard E in cui le

 

due concentrazioni delle forme della semi coppia sono uguali 1M e a 25°C. Di solito si

0 0’

utilizzano i dati tabulati a pH = 7 e in questo caso E diventa E .

Una reazione redox quando due semi coppie reagiscono e trasferiscono gli elettroni

dall’una all’altra. Affinché ciò avvenga una delle due semi coppie deve trovarsi nella

sua forma ridotta e l’altra nella sua forma ossidata la prima deve fungere da



donatore (riducente, che si ossida) e la seconda è l’accettore (ossidante, che si

riduce). Cambiano i numeri di ossidazione.

Per la reazione scritta come sopra (verso direzione della riduzione di B) il potenziale

redox della semi coppia B deve essere maggiore del potenziale redox della semi

coppia A, perché il potenziale redox può essere visto come una tendenza della semi

coppia a rimanere nella sua forma ridotta, quindi la semi coppia B tende di più a

rimanere nella sua forma ridotta che non la semi coppia A. Mettendo insieme A e B, B

che ha una tendenza a ridursi maggiore rispetto ad A, viene ridotta dalla forma ridotta

di A (E > E ). In generale, in una reazione redox gli elettroni passano sempre

B A

dalla semi coppia a potenziale MINORE verso la coppia a potenziale

MAGGIORE.

EQUAZIONE DI NERNST definisce il potenziale di ogni singola semi cella. Il



potenziale reale è definito come E’ (se siamo a pH 7) ed è uguale a:

F = 96480 C (carica di una mole di

elettroni)

n = n° di elettroni scambiati durante la

reazione redox

Relazione tra ΔE e ΔG:

Tutto questo viene sfruttato grazie al fatto che con le reazioni redox possono essere

costruiti due tipi di dispositivi che sono le celle elettrochimiche, a loro volta

suddivise in due categorie: cella galvanica e cella elettrolitica.

Cella galvanica cella in cui l’energia chimica di una reazione redox spontanea



viene sfruttata per generare energia elettrica. Comunemente una serie di celle

galvaniche messe in serie viene definita pila (la prima fu la pila di Volta). Esempio di

ottimazione della pila di Volta una pila Daniel è una cella galvanica basata sulla

 

reazione redox fra lo zinco e il rame. Le due semi coppie sono zinco/zinco ossidato e

rame/rame ossidato. Funziona sfruttando il fatto che spontaneamente, lo zinco

funziona da donatore di elettroni (si ossida) e il rame funziona da accettore (si riduce).

Se colleghiamo due celle contenenti in una un filamento di zinco e nell’altra un

filamento di rame, immersi in una soluzione con una concentrazione di un sale dello

stesso ione, si forma un flusso di elettroni (dallo zinco al rame). Uno dei due elettrodi si

chiama anodo (elettrodo negativo), mentre l’altro si chiama catodo (elettrodo

positivo). All’anodo avviene sempre una reazione di ossidazione (da zinco metallico

passiamo a zinco ossidato), mentre al catodo sempre una reazione di riduzione (il

rame ossidato prende gli elettroni lasciati dallo zinco e diventa rame metallico).

Cella elettrolitica è una cella galvanica che funziona all’opposto: utilizzo di



energia elettrica per far avvenire una reazione redox che non è spontanea. Abbiamo

un generatore di tensione collegato ai due elettrodi, che si chiamano sempre anodo e

catodo, ma in questo caso il catodo è caricato negativamente perché adesso si

scaricano i cationi (vuol dire che il catione positivo migra verso il catodo negativo e

acquista gli elettroni, cioè avviene riduzione al catodo) e al contrario all’anodo

(positivo) si scaricano gli anioni (nell’esempio l’anione cloruro negativo va verso

l’anodo positivo, cede i suoi elettroni e avviene così la reazione di ossidazione).

Come viene applicato tutto ciò per scopi analitici di laboratorio? Viene applicato in due

gruppi di tecniche principali:

- Potenziometria: usa celle galvaniche, in esso si misura il potenziale tra gli

elettrodi della cella quando l’intensità di corrente all’interno della cella è I=0.

- Voltammetria: usa celle elettrolitiche. Qui c’è un’ulteriore suddivisione: si può

misurare la corrente che passa applicando un potenziale costante

(amperometria), o si può misurare la corrente che passa quando il potenziale

varia ma in modo controllato attraverso un potenziostato, si parla di

polarogradia/voltammetria.

Noi ci concentreremo su: la misura del pH (tecnica di tipo potenziometrico), il pHmetro

misura il potenziale di una cella galvanica quando la corrente è 0;

il consumo di O , la concentrazione di ossigeno (che però visto che varia nel tempo

2

viene misurato il suo consumo), viene misurato tramite una tecnica amperometrica,

cioè andando a misurare la corrente che passa in una cella elettrolitica sottoposta ad

un potenziale esterno costante.

Lez. 2c01

pHmetro: si basa su una tecnica potenziometrica, si usa una cella galvanica in cui

si misura il potenziale tra gli elettrodi quando la I=0 (corrente = 0).

Misurare il potenziale