Metodologie biochimiche

SPETTROMETRIA DI MASSA (MS)

Tecnica che consente di determinare con precisione la massa molecolare di una molecola sfruttando il fatto che la traiettoria e la velocità di particelle cariche o ioni vengono modificate da un campo magnetico o elettrico in base al rapporto massa-carica (m/z) della particella stessa.

Si convertono le molecole del campione in ioni gassosi che vengono poi separati in uno spettrometro di massa in base al loro rapporto massa-carica e quindi rilevati in tempi e posti diversi.

Lo spettro di massa riporta l'abbondanza (relativa) degli ioni per ogni valore di m/z. Ci dice che durante l'esperimento sono stati prodotti determinati ioni aventi valori m/z.

Mediante analisi opportune otteniamo il valore della massa molecolare.

Effetto campo elettromagnetico su particelle cariche in funzione della loro massa → possono essere variate nella traiettoria oppure possono subire una diversa accelerazione. In entrambi i casi l'effetto del campo elettromagnetico.

è maggioretanto più piccola è la particella.

Spettrometri di massa:

• Camera di ionizzazione- per la produzione di ioni
• Sistema in cui vengono accelerati gli ioni- fino ad una velocità specifica in un campo elettromagnetico analizzatore di massa- Separazione degli ioni in un rilevati- I diversi ioni separati vengono in tempi diversi a seconda del loro rapporto m/z

Solitamente la sorgente di ioni, l’analizzatore di massa e il rilevatore sono dei sistemi che lavorano sono alto vuoto, perché se andiamo a misurare le velocità e le traiettorie degli ioni se questi interagiscono con gas presenti verranno deviati. Gli ioni non devono incontrare ostacoli.

Produzione degli ioni (camera di ionizzazione): ci sono diversi sistemi impattoelettronico, ionizzazione chimica diretta, bombardamento con atomi veloci, ESI e MALDI (queste ultime due sono quelle di interesse per la biochimica. Effettuano una produzione soft degli ioni dove non c’è una

(frammentazione eccessiva)Analizzatore di massa: sono collegati alla camera di ionizzazione, infatti la produzione degli ioni mediante i primi tre sistemi utilizzano degli analizzatori a settore elettromagnetico, mentre la ESI utilizza gli analizzatori a quadrupolo e a trappola ionica, mentre la MALDI è accoppiata con l'analizzatore Time of flight (TOF)

Rilevatori: gli ioni vengono rilevati mediante l'emissione di elettroni secondari che vengono amplificati in dinodi di conversione o moltiplicatore elettronico; vengono generate correnti che vengono rilevate e convertite in segnali calibrati opportunamente. Non si usa un fotomoltiplicatore nello spettrometro di massa, ma questo rilevatore si basa sullo stesso principio anche se costruito in modo differente

Produzione degli ioni- Ionizzazione per impatto elettronico si fa colpire il campione da un fascio di elettroni che hanno energia altissima. Questo impatto spara fuori gli elettroni dalla molecola e si ottiene lo ione

molecolare o precursore (che però è instabile). Va incontro ad una serie di frammentazioni successive che danno origine a ioni secondari che vengono rilevati. L'analisi degli ioni prodotto ci dà la ricomposizione della molecola iniziale. È un rilevatore di massa per la gas-cromatografia (tecnica che serve per separare piccole molecole).

Esempio, bombardare con elettroni ad alta energia la molecola di buctano questo darebbe uno ione precursore instabile che si può frammentare in modi diversi in modo da generare una serie di ioni e ioni radicalici ognuno con un diverso rapporto m/z. nello spettro di massa vedo un'abbondanza relativa (nel senso fatto 100 lo ione più abbondante, la quantità di tutti gli altri viene espressa relativamente all'abbondanza di questo).

Si sa che se una sostanza dà origine ad un certo pattern di frammentazione vuol dire che ha dei PM particolari si deduce il PM sulla base dei rapporti m/z degli ioni prodotti.

Questo sistema è adatto per piccole molecole organiche, non proteine. - Ionizzazione chimica stessa cosa, ma invece di essere bombardati direttamente dagli elettroni vengono bombardati da un gas (di solito metano) che viene a sua volta ionizzato da un bombardamento primario degli elettroni. Lo scopo è quello di far impattare la mia sostanza con una sostanza ad energia minore. Vengono prodotti degli ioni radicalici derivanti dal metano che hanno energia minore. Questi vanno poi incontro a dei rimaneggiamenti e quando questi ioni radicalici vanno ad impattare contro la mia molecola, la sua energia sarà minore, questo darà origine a un pattern di frammentazione della molecola inferiore, rendono più facile andando a leggere lo spettro. È un sistema troppo energetico per le proteine. - Bombardamento con atomi veloci la differenza è lo strumento un po' più complesso. Vengono generati ioni di un gas esempio xenon attraverso bombardamento elettronico.

Questi ioni vengono utilizzati per accelerare altre molecole di gas, le quali acquisiranno una certa energia cinetica che va a impattare contro il campione miscelato con una matrice liquida poco volatile come il glicerolo. In questo caso si generano ioni che non tendono a frammentarsi, quindi frammentazione minore. Si può utilizzare per molecole un po' più complesse, ma ha comunque energia elevata per i nostri scopi.

Ionizzazione per ElettroSpray (ESI) avviene a pressione ambiente. Il campione è in soluzione miscelato ad un solvente molto volatile come il metanolo. Questo campione viene mandato in un capillare di vetro molto sottile in cui è presente una differenza di potenziale che può arrivare fino a 5000 V.

La forma del capillare è fatta in modo tale da nebulizzare il campione in piccole goccioline che contengono forme multicarica delle molecole. Le molecole NON vengono frammentate. Si ha poi evaporazione del solvente aiutata dalla presenza

di volo”. Questo è sottoposto a una elevaata differenza dipotenziale, non sono molecole ma ioni mono o bicarica. La luce laser genera degli ioni.Essendo carichi negativamente vanno verso il polo di carica opposta.Analizzatori di massa- [ESI] Analizzatore quadrupolare: fatto da 4 barre metalliche cilindricheaccoppiate fra di loro. Due sono sottoposte ad una corrente alternata (RF) e duead una corrente continua (DC) e sono accoppiate diagonalmente. Gli ionimulticarica della proteina, che arrivano dalla sorgente di ioni, iniziano amuoversi all’interno del quadrupolo con percorsi elicoidali particolari cheportano a collidere contro le barre e vengono eliminati. Alcuni di questiassumono traiettorie particolari che li fanno uscire dalla parte opposta delquadrupolo. Selezionando l’intensità della corrente e la frequenze della correntealternata (alternata a radiofrequenza) si può selezionare il particolare rapportom/z che sfugge da questa “trappola quadrupolare”.

determinato rapporto m/z che cade su rilevatore e viene rilevato in successione. Si ottiene uno spettro che dice l'abbondanza relativa degli ioni con diverso rapporto m/z rispetto al più abbondante. Anche qui si ha deconvoluzione dello spettro.

[MALDI-TOF] tempo di volo generatore del raggio laser, che ha una precisa lunghezza d'onda, se ne possono utilizzare diverse. Il laser colpisce uno dei pozzetti in cui c'è la miscela campione + matrice e questo viene sparato fuori dal pozzetto come ioni (ioni della matrice e ioni del campione). Gli ioni del campione vengono accelerati attraverso il tubo di volo e la misurazione viene effettuata misurando il tempo impiegato dagli ioni per raggiungere il rilevatore. Il tubo di volo è sottoposto a un intenso campo elettrico intorno ai 20000 V. Si può utilizzare questo sistema solo con il MALDI perché dobbiamo calcolare con la massima precisione il tempo impiegato da ciascuno ione per arrivare al rilevatore.