Metodologie biochimiche

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sostanza si distribuisce tra due fasi immiscibili, solitamente una stazionaria e una mobile,

determina la ripartizione del soluto.

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Determina l’efficienza della separazione dei componenti di una miscela.

Se questo valore è alto, vuol dire che l’affinità è alta per la fase stazionaria. Se è basso, vuol

dire che l’affinità è bassa per la fase stazionaria. Se è 1, sta bene sia in fase liquida che in fase

stazionaria. Le molecole attraversano la colonna. È un equilibrio.

Negli strati della colonna, se K è 1, metà parte resta nella fase mobile e metà nella fase

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stazionaria.

• K < 1 → Bassa affinità con la fase stazionaria ma alta per la fase mobile.

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• K = 1 → Uguale affinità per le due fasi.

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• K > 1 → Alta affinità con la fase stazionaria ma bassa per la fase mobile.

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Piano piano si inizia ad avere uno spostamento di quello nel liquido e si inizia a ridistribuire

nella fase stazionaria instaurando un equilibrio dinamico.

Si instaura l’equilibrio, ma si inizia ad avere un altro spostamento che poi provocherà un

altro equilibrio grazie ad una redistribuzione. Le redistribuzioni possono essere approssimate

a colonne. Le molecole si separano grazie a differenze nella loro K .

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Le molecole entrano in colonna nello stesso modo, man

mano che si procede le curve delle due molecole si

separano.

Se K rimane fisso nel tempo si dice che la separazione è

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isocratica, le interazioni rimangono invariate nel tempo.

Se K è variabile nel tempo si dice che la separazione è

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in gradiente, le interazioni si modificano nel tempo.

La selettività è la capacità di eluire due molecole diverse con tempi di ritenzione il più

possibile diversi. Dipende dai valori del coefficiente di ripartizione K delle sostanze da

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separare e dalle caratteristiche chimico fisiche della fase stazionaria e mobile.

Ex. pH e idrofobicità.

L'efficienza è la capacità di eluire molecole identiche con tempi molto simili. Dipende dalle

caratteristiche delle molecole separate e da quelle della colonna.

Il fattore di ritenzione (K’) indica la capacità di un soluto di essere trattenuto dalla colonna

cromatografica e dipende dal coefficiente di ripartizione (K ). I valori di K’ devono essere

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elevati ma non troppo.

Lo scopo di una separazione cromatografica è quella di massimizzare le capacità separative

della colonna rispetto a ciò che si vuole separare. Si deve fare in modo che i picchi siano

separati tra loro. Le molecole devono esser separate tra loro nel minor tempo possibile e

contemporaneamente anche una elevata sensibilità. Per avere una buona separazione,

occorre testare diverse condizioni per ottimizzare la separazione cromatografica.

Il metanolo determina l’interazione della biomolecola con la fase stazionaria. Occorre molto

tempo, quindi si potrebbe aumentare la concentrazione del metanolo nella separazione

successivi. Il tempo è minore, ma la separazione cromatografica non c’è, i picchi non sono

separati tra loro.

Quindi la composizione della fase mobile può essere separata nel tempo.

La separazione inizia con il metanolo è al 20% e poi termina con la concentrazione del

metanolo all’80% o al 100%, la concentrazione ha un gradiente lineare, aumenta

costantemente nel tempo. Cambiano nel tempo le K delle molecole.

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La cromatografia è costituita anche da una fase solida, costituita da sferette di silice o silice

monolitica.

Le sferette hanno tutte la stessa natura, occupano un volume e ne lasciano libero un altro.

La parte mobile passa negli spazi vuoti lasciati dalle sferette. L’analita che non interagisce lo

si vedrà quando il flusso è arrivato in fondo, la molecola impiegherà una certa quantità di

tempo (tempo morto della colonna). Questo tempo morto sarà il tempo che ci impiega

l’analita che non interagisce con le sferette a passare tutto il volume. Il tempo morto

coincide con il volume morto della colonna, cioè il volume lasciato vuoto dalle sferette.

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L’efficienza della colonna dipende dalle caratteristiche intrinseche della colonna.

Le dimensioni delle particelle che compongono il supporto inerte della fase stazionaria

influiscono. Le sfere possono essere di grandi o piccole dimensioni. Le dimensioni fanno

variare il volume morto. Le molecole quando vanno in fase mobile e poi vanno in fase

stazionaria, prima che la molecola dalla fase stazionaria torni alla fase mobile, si ha la

diffusione.

Il supporto inerte sono le particelle. Queste vengono attivate con la fase stazionaria.

Vengono ricoperte con le molecole che instaurano relazioni con le molecole che si stanno

separando. Il supporto solido può essere di particelle o monolitico. Entrambe possono avere

una certa porosità. Il monolitico può essere poroso, quindi si ha una grande superficie che

può attaccare la fase stazionaria e quindi accogliere molte più molecole. Le dimensioni dei

pori sono variabili. Se devono essere separate proteine devono essere grandi, se si devono

separare metaboliti devono essere piccoli.

Le colonne hanno diverse caratteristiche fisiche. Queste si contraddistinguono a seconda del

diametro interno e del materiale dal quale sono costituite. Le open e le nanobore sono

utilizzate per fare la proteomica.

Il cuore del sistema è la colonna, dove avviene la separazione.

Si inizia con un sistema mosso da una pompa all’interno della colonna dove avviene il

coefficiente di distribuzione (K ) e le molecole vengono separate. Queste escono dalla

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colonna passando per un detector che genera il segnale, cioè l’altezza dl picco.

All’uscita del detector il tubicino va in un bidone di raccolta o, in caso di una cromatografia

preparativa, in un separatore che raccoglie ciò che sta uscendo. Tutto è integrato con un

sistema di controllo e raccolta dati.

Esistono varie pompe a seconda della cromatografia che si sta facendo.

La pompa peristaltica è un rotore che comprime una gomma roteando.

La compressione è mobile. La pressione raggiunta è minima.

Il tubo che esce dalla pompa è collegato alla colonna cromatografica a bassa pressione.

Per le medie e alte pressioni servono altre pompe, cioè quelle a pistone. Pompe binarie che

sono costituite da un albero a camme (cerchietto che si muove che muove il pistone).

Il pistone aspira quando va indietro e comprime quando va avanti. Torna indietro grazie alla

molla di ritorno. Quando va in avanti, incontra una valvola di non ritorno che non permette

al liquido di tornare indietro. 40

Nella cromatografia in gradiente, generalmente ci sono due pompe, A e B.

Entrambe le pompe confluiscono in un mixer. Queste possono roteare a diverse velocità.

Queste due pompe sono immerse in due solventi diversi (ex. acqua e metanolo).

Poi c’è il detector, che solitamente è una cella di flusso (spettrofotometro), cioè un piccolo

fotometro dove entra la fase mobile da una parte ed esce dall’altra.

La fase mobile entra ed esce con il campione uscito dalla colonna.

La cella ha due finestre in quarzo attraversate dal raggio luminoso.

In fondo c’è il detector che misura la lunghezza d’onda.

Nei detector HPLC il raggio incidente è a 280 nm. Il detector legge in assoluto e calcolaΔ

(delta) costantemente. Calcola le variazioni di trasmittanza. Questa lunghezza d’onda è

trasparente ai tamponi usati, il segnale generato non dipende dal tampone.

Per monitorare contemporaneamente varie lunghezze

d’onda, è stato sviluppato un detector che sfrutta il

fatto che è possibile abbinare un reticolo.

Questo è il Diode Array.

Alla cella di flusso si inviano più lunghezze d’onda,

tutto lo spettro luminoso. Tutto lo spettro viene

generato e passa nella cella di flusso. Esce e il raggio

viene scomposto a diverse lunghezze d’onda.

Ci sono foto-duplicatori. C’è una matrice di sensori, ognuno è sensibile ad una lunghezza

d’onda. Se nella cella di flusso, per esempio, passa qualcosa che assorbe il giallo ma c’è nello

stesso momento una molecola che assorbe ultravioletto, la luce che verrà trasmessa sarà

ultravioletto senza un po’ di segnale. Si possono monitorare varie lunghezze d’onda.

Si ottiene un cromatogramma multidimensionale che dipende da quante lunghezze d’onda

può assorbire il sensore. Si ha un cromatogramma diverso per ogni lunghezza d’onda.

Solitamente si acquista questo detector per praticità e comodità.

Permette anche di monitorare anticorpi fluorescenti.

Le valvole possono deviare i flussi e possono essere da 6, 12 o 16 porte. Cambiano le

interconnessioni tra i diversi punti della valvola.

Il campione è a pressione ambientale e si mette nel sistema grazie alle valvole che collegano

i vari punti in maniera casuale.

I collegamenti vengono fatti con il sample loop, cioè un tubo

con un volume caricabile definito. Può avere diverse

lunghezze e diversi diametri. Il campione entra nel tubo con

una siringa. Il flusso va verso uno scarico.

Il tubo determina il caricamento massimo del campione.

Contemporaneamente qui la pressione è alta.

Si inizia la corsa cromatografica, il campione deve transitare nella colonna.

Vengono cambiate le interconnessioni della valvola, le gira a destra o a sinistra.

La valvola gira con una leva o a motore se automatica. Il loop passa da pressione ambientale

a pressione di esercizio. La valvola si muove e i campioni iniziano ad andare all’indietro.

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Il campione transita e poi va in colonna. Così viene svolta l’iniezione del campione in HPLC.

L’utilizzo di queste valvole consente anche di utilizzare varie colonne contemporaneamente.

All'esterno della pompa ci sono le sostanze. Se le sostanze sono due la pompa è binaria.

Si può lavorare anche con quattro soluzioni, prima due e poi altre due.

Il flusso nelle valvole è generato da un mixer.

L’uscita della colonna è collegata al detector. Dopo di questo il campione può andare nel

bidone o in un sistema di raccolta, chiamato raccoglitore di frazione. Questo può essere

abbinato a dei sistemi di cromatografia a media pressione che servono per le preparative di

proteine ricombinanti (purificate tramite cromatografia).

Il software quando arriva il picco manda il liquido che passa in un c