Metodologie biochimiche

STRUTTURA E STABILITA’ DELLE PROTEINE

Le tecniche che verranno descritte nel corso saranno analitiche oppure preparative

E’ molto importante la descrizione del contesto in cui si opera, ossia in condizioni in cui le proteine si trovano nella loro forma nativa

E’ necessario conoscere e applicare le condizioni in cui le proteine manifestano una struttura corrispondente alla forma nativa, nella

quale possono espletare le loro funzioni

Questa implica che è fondamentale conoscere le condizioni in cui la struttura nativa e le funzioni di una proteina vengono preservate e le

condizioni in cui invece la struttura della proteina viene alterata

La struttura primaria di una proteina è la sequenza dei residui amminoacidi che compongono la catena polipeptidica, i quali sono legati

tra loro mediante dei legami peptidici (sono piuttosto forti, hanno un livello energetico elevato)

Un danno nella struttura terziaria/quaternaria di una proteina può dipendere da una serie di fattori

- temperatura

- pressione

- pH

- attività proteolitica

- ROS

- solventi organici

- urea/guanidina

Sono dei fenomeni che vanno a interferire con una serie di altre tipologie di legame che sono più deboli rispetto a quelle che tengono

insieme la struttura primaria

E’ importante mantenere la struttura nativa di una proteina perché l’energia che stabilizza la struttura terziaria/terziaria, ossia quella

da cui dipende il suo permanere in una condizione di folding nativo, è in realtà un piccolo margine di energia rispetto a tutte quelle che

sono in gioco

Con la freccia verde verso il basso sono indicati i contributi energetici entalpici legati

a legami di tipo debole → non considerati

Si considerano la termodinamica del folding/unfolding relativo alla formazione di

legami di tipo debole

Contributi fondamentali: effetto entalpico legato a interazioni di tipo elettrostatico,

effetto entropico legato a interazioni di tipo idrofobico

Le frecce rivolte verso il basso indicano che per effetto di questi contributi si ha un abbassamento del livello energetico del sistema

costituito dai residui amminoacidi che stanno formando interazioni tra loro e con il solvente

In rosso: contribuito entropico della catena polipeptidica che si ordina in una struttura foldata, ben ripiegata

Questo contributo (- ∆G) dà la misura della stabilità delle proteine foldate nella forma nativa

In condizioni fisiologiche, la ∆G raggiunge dei valori molto inferiori allo 0 → le proteine sono facili da denaturare (energia libera supera

l’energia dello stato basale al quale la proteina si trova)

interazioni elettrostatiche sono le interazioni che avvengono tra gruppi carichi positivamente e gruppi carichi negativamente

▸Le

∙ Le interazioni Van der Waals includono interazioni di tipo attrattivo e repulsivo, sono delle cariche parziali positive/negative che si

formano transitoriamente e possono dipendere da spostamenti della nube elettronica

Possono assumere una configurazione anti-parallela oppure testa-coda

Sono interazioni deboli di tipo elettrostatico, generalmente sono una moltitudine di interazioni che possono supportare delle interazioni

tra strutture macroscopiche (es: geco e superficie)

Interazioni essere estremamente deboli possono essere in realtà responsabili della stabilizzazione dell’intera struttura di una proteina

∙ I legami a idrogeno possono essere considerati come una tipologia di interazioni di Van der Waals

Formazione di interazioni tra dipoli transienti, cioè parziali cariche negative o positive (tra ossigeno e idrogeno nell’acqua)

Riguardano qualsiasi elemento con elettronegatività superiore all’H

∙ Gli effetti pi-greco sono delle interazioni non covalenti che si verificano tra gli anelli aromatici → alla loro formazione co-partecipano

degli elettroni di tipo pi-greco

l’impilamento degli anelli aromatici ha un’importanza enorme in biologia (struttura del DNA e dell’RNA, ma anche proteine)

idrofobico

▸Effetto

E’ un’interazione non entalpica (cioè legata alla formazione di un legame), ma che dipende essenzialmente da un effetto entropico legato

cioè a un ordine generato quando una molecola idrofobica si trova immersa in un solvente acquoso

Il trasferimento in acqua di un gruppo non polare è energeticamente sfavorito (∆G > 0) → la variazione di energia dipende dal

bilanciamento delle interazioni di tipo legame a idrogeno che si formano tra le molecole d’acqua che si trovano nel suo interno,

formazione di una gabbia ordinata formata da molecole di acqua (clatrato)

Quest’effetto comporta la tendenza ad aggregare nel mezzo acquoso di molecole organiche di tipo idrofobico

Dal momento che il trasferimento in un solvente acquoso di una molecola idrofobica è energeticamente sfavorito, il fatto che due

molecole si accoppino e formino solo un buco nell’acqua anziché due è un evento energeticamente favorito → il numero di molecole di

acqua che si devono ordinare nell’intorno è minore, riduzione della superficie esposta al solvente, minore volume del clatrato

L’effetto idrofobico si verifica quando composti apolari tendono ad aggregare in un mezzo acquoso

Più in generale si parla di effetto solvofobico: caso di una molecola immersa in un solvente polare diverso dall’acqua

Non è dovuto all’interazione diretta tra il composto idrofobico e le molecole del solvente, ma a una forza “apparente” che dipende dal

grado di energia che viene impartito alle molecole di acqua, dall’effetto entropico

Cosa succede quando le proteine vengono poste in una soluzione acquosa in cui sono presenti dei sali?

Ci sono delle molecole che interagiscono con la superficie della proteina (picosecondi), in numero minore ci sono anche proteine che

interagiscono con le porzioni più interne (nanosecondi)

Gli effetti dei sali sulla proteina possono dipendere sia dalla concentrazione (forza ionica), che dal tipo di sale

I sali possono avere delle interazioni con i gruppi polari presenti sulla proteina

Queste informazioni derivano da studi di tipo empirico

La forza ionica di un sale dipende dalla sua concentrazione e dalla modalità con cui avviene la sua dissociazione in acqua

Bisogna considerare ½ della somma dei prodotti di ciascuna specie ionizzata moltiplicata per il numero di

cariche associate a quella specie

1 M di NaCl → dissociazione completa in soluzione 1 M Na + 1 M Cl → ½ (1 * 1 + 1 * 1 ) = 2/2 = 1

+ - 2 2

1 M di MgCl → dissociazione 1 M Mg + 2 M Cl → ½ (1 * 2 + 2 * 1 ) = 6/2 = 3

2+ - 2 2

2

L’effetto dipende anche dalle caratteristiche del sale

Esperimenti ricondotti dopo che vennero realizzati per la prima volta nel 1932

Ordinata → logaritmo della solubilità

quantità delle proteine in soluzione completa (mM)

Presa polvere di albumina di siero bovino, messa in soluzione che contiene

questi sali e si va a vedere in che misura la proteina si ritrova in soluzione e

non sul fondo della provetta (frazione insolubile)

Si parte della stessa quantità

Ascissa → radice quadrata della forza ionica

Utilizzati sali con una forza ionica via via maggiore, aumenta la

concentrazione dei sali da sinistra verso destra

In una parte del grafico sembra che le soluzioni si comportano tutte nello stesso modo, ossia quando la forza ionica è bassa

All’aumentare della forza ionica, aumenta anche la solubilità → successivamente, le soluzioni iniziano a comportarsi in modo peculiare

A forze ioniche piuttosto basse, la solubilità delle proteine può essere migliorata man mano aumenta la forza dei sali

Al di sotto di un certo valore, si può avere una riduzione più o meno drastica (Na SO ) oppure un aumento (NaCl) della solubilità

2 4

Basse concentrazioni di sali favoriscono sempre la solubilità della proteina

Alte concentrazioni hanno effetti diversi sulla solubilità della proteina a seconda del sale, alcuni possono favorire la solubilità e altri no

Alcuni sali possono aumentare la stabilità conformazionale della proteina, alcuni possono invece destabilizzarla e denaturarla

Bisogna conoscere i sali nei quali una proteina si può trovare in forma nativa e i sali in cui invece si può denaturare

• SALTING-IN → utilizza sali che producono la solubilizzazione della proteina

• SALTING-OUT → utilizza sali che fanno perdere le interazioni con le molecole di acqua, produce la precipitazione della proteina

Sale di tipo CAOTROPICO → agente che muove verso il disordine, non produce un’organizzazione ordinata delle molecole di H O

∘ 2

Sale di tipo COSMOTROPICO → agente che muove verso l’ordine, produce un’organizzazione ordinata delle molecole di H O intorno

∘ 2

allo ione

Questi due termini sono riferiti all’effetto del sale sulle molecole di acqua

basse concentrazioni di sale, la solubilità di molte proteine potrebbe essere bassa

▴A

Si trovano esposti dei residui polari e possono interagire mediante interazioni di tipo elettrostatico (legami a idrogeno con molecole di

acqua), ma ci sono anche dei residui di tipo idrofobico che tendono a formare un unico buco dell’acqua

Per effetto idrofobico si ha una bassa solubilità perché le proteine tendono a interagire tra loro e formare dei corpi di interazione che

possono precipitare

Quando si aggiunge un sale a bassa concentrazione (entro 0.1 M), si verifica un salting-in → per effetto delle interazioni tra i gruppi

ionici della proteina e i controioni della soluzione, le proteine tendono a essere maggiormente solubili

concentrazioni di sale maggiori di 0.1 M si possono verificare due scenari:

▴A

- il sale ha un comportamento cosmotropico

interagisce con il solvente e sottrae alle molecole proteiche i controioni che consentono il loro mantenimento in soluzione

avviene un salting-out, perdita della solubilità (metodologia biochimica per produrre la precipitazione della proteina di interesse per

concentrarla)

- il sale ha un comportamento caotropico

avvengono delle interazioni dirette tra il sale e la proteina, la proteina resta in soluzione ma perde la sua struttura nativa (unfolding)

Ipotesi del raggio atomico

I vari ioni differiscono per il loro raggio atomico → ha a che fare con la densità di carica con la quale le

proteine possono interagire

Sono riportati i raggi dell’atomo e dello ione corrispondente

Litio, sodio e fluoro possono essere considerati come piccoli, gli altri possono essere più o meno grandi

Si ricerca il motivo per il quale gli ioni piccoli possono agire con effetto cosmotropico, mentre quelli più

grandi (>120 pm) hanno un effetto caotropico

Produzione di gusci di idratazione intorno agli ioni

Gli ioni piccoli producono un primo strato e un secondo più esterno, al di fuori ci sono delle molecole libere

Gli ioni con più piccolo diametro hanno un guscio di idratazione complessivamente maggiore, al quale contribuisce soprattutto il guscio

secondario → strati ordinati di molecole di acqua per uno spazio maggiore rispetto a uno ione più grande

Variazioni di entropia associate alle idratazioni degli ioni

Asse x → variazioni di raggio ionico

Asse y → variazioni di entropia

Se le molecole di acqua producono un ordine intorno allo ione, significa che

avviene una variazione di entropia positiva

Man mano che aumenta il raggio, tende a diminuire e a cambiare di segno

Si disordina la struttura che ha l’acqua in assenza dello ione

Ioni cosmotropici producono una variazione di energia positiva, quelli caotropici producono una variazione negativa

L’andamento è simile sia per gli ioni positivi che per i negativi

Osservazione: a parità di raggio, uno ione negativo è più cosmotropico rispetto a uno positivo

Intorno a uno ione piccolo che presenta una carica negativa (F ) sono rivolte le cariche

-

parzialmente positive dell’idrogeno dell’acqua → un idrogeno è rivolto verso l’esterno e uno

verso lo ione

La carica positiva del litio (Li ) attrae l’ossigeno, che è ingombrante, mentre i due idrogeni sono

+

esposti verso l’esterno → a questa geometria si collega il fatto che uno ione positivo sia più

caotropico, mentre uno negativo sia più cosmotropico

Per gli ioni carichi positivamente le molecole di acqua tendono a essere destabilizzate e a disporsi in una fascia più esterna

Nel caso di ioni carichi positivamente e con grande raggio vengono favorite delle interazioni delle molecole di acqua che ordinate

escludono lo ione e formano un “buco nell’acqua” → ioni con effetto maggiormente idrofobico (no interazioni dirette tra l’acqua e lo ione,

ma effetto sull’intorno)

Utilizzo pratico

Hofmeister ha studiato sistematicamente come si comportano le proteine in soluzione con diversi sali

Utilizzando delle soluzioni saline concentrate più di 0.1 M ha verificato quali producevano solubilizzazione della proteina e quali no

∙ Salting in

Sali che producono la denaturazione della proteina, che resta in soluzione e non precipita (caotropici)

Formazione di interazioni dirette tra il sale e la proteina

Nel caso degli ioni carichi negativamente, man mano che aumenta il raggio ionico, si ha un maggiore disordine nelle interazioni tra gli

ioni e le molecole d’acqua → effetto idrofobico: lo ione lascia un buco, interazione degli ioni con le proteine che vanno a interferire con i

legami deboli della proteina che sostengono la struttura proteica

∙ Salting out

Sali compatibili con la precipitazione della proteina in forma nativa (cosmotropici)

Ioni che determinano molte interazioni con il solvente, poche interazioni con le proteine

Lasciano la proteina priva di sospensioni nel solvente e per questo motivo la proteina precipita

Nel caso degli ioni di carica positiva, aumentando il raggio ionico avviene salting out (andamento opposto rispetto agli ioni con carica

negativa)

Bisogna considerare la natura della proteina → le interazioni dipendono anche dalle cariche presenti sulla proteina, il potenziale

elettrostatico di una proteina determina l’effetto del sale

La distribuzione delle cariche positive e negative di una proteina (potenziali di carica) dipende dalla sua struttura e dal suo stato di

ionizzazione, quindi dal pH della soluzione in cui si trova

Lo stato di carica della proteina (numero di cariche nette che possiede) dipende dalla sua composizione amminoacidica, in particolare

dalla presenza di residui carichi (acido aspartico, acido glutammico, arginina, lisina) ed è influenzato dal pH, ovvero dalla

concentrazione degli ioni H → lo stato di protonazione di residui carichi è legato alla presenza di ioni H in soluzione

+ +

Al punto isoelettrico (valore di pH al quale si ottiene la carica netta della proteina =0), il numero di residui protonati e non protonati si

bilancia

La stessa proteina ha un potenziale elettrostatico di superficie diverso a seconda del pH della soluzione in cui si trova (prevalenza di

cariche positive piuttosto che negative)

Esistono diverse serie di Hofmeister: anioniche o cationiche, dipendono dalla proteina/valore di pH/ecc…

Ci sono dei punti fissi che restano costanti indipendentemente dal tipo di proteina, carica, pH, … al quale si sta lavorando

Queste sostanze si comportano allo stesso modo con tutte le proteine:

- guanidinio cloruro (6 M)

sale caotropico

provoca la denaturazione delle proteine, le quali restano però solubili

molto utile quando si devono applicare delle condizioni di denaturazione, es: studi di stabilità della proteina

utilizzata anche l’urea (8M)

- tetrametilammonio e ammonio solfato

sali cosmotropici

stabiliscono interazioni con il solvente sottraendolo alle interazioni con la proteina → perdita di solubilità

avviene la sottrazione di molecole di acqua che formano il mantello di idratazione, il sale non interagisce con la proteina

non avviene la denaturazione delle proteine, ma formazione di precipitati visibili macroscopicamente oppure di floculati

questi sali possono essere utilizzati per fare una precipitazione controllata delle proteine di interesse, è utile per la concentrazione del

campione proteico (applicazione comune in tecniche di tipo preparativo)

Ciascuna proteina può precipitare a una particolare concentrazione di ammonio solfato stabilita in modo empirico

Si ha una soluzione che contiene diverse proteine che precipitano a concentrazioni diverse di ammonio solfato → utilizzate

concentrazioni diverse del sale per far precipitare le diverse proteine

Di solito si svolge nei primi passaggi di un processo di purificazione, permette l’arricchimento

(non purificazione) della proteina di interesse in alcune delle frazioni di precipitazione

A bassa concentrazione di ammonio solfato avviene la precipitazione della proteina 1 e in

soluzione restano le proteine 2 e 3 (possibile che parte della proteina 1 sia ancora presente in

soluzione)

Possibile precipitare proteina 1 e proteina 3 → concentrazione che permette di separare la proteina 2, che resta in soluzione

Per arricchire ciascuna delle tre proteine:

1) Precipitazione della proteina 1, messo via pellet

2) In soluzione si hanno le proteine 2 e 3, aggiunta di una quantità di ammonio solfato che promuove la precipitazione della proteina 3

e separazione del pellet

3) In soluzione si ha la proteina 2, aggiunta di una concentrazione adeguata di ammonio solfato per farla precipitare

4) Procedere utilizzando metodi di purificazione specifici per ciascuna proteina

Si parla di percentuale di saturazione di ammonio solfato, non di concentrazione

Estrazione della proteina da un estratto cellulare, frazionamento per concentrare il campione e realizzare un primo arricchimento

Nel pellet, insieme alla proteina di interesse vi è la presenza anche di molto sale (60-70%) che deve essere rimosso

▸De-salting

Processo di allontanamento dei sali, passaggio preliminare per l’applicazione di tecniche di tipo preparativo

Procedimento di dialisi

La soluzione viene inserita all’interno di un tubo semipermeabile chiuso alle estremità che consente il

passaggio delle molecole a