Metodologie biochimiche

FRET: una tecnica basata sul trasferimento di energia

La FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) è una tecnica che sfrutta la fluorescenza e si basa sul trasferimento di energia da una molecola eccitata a un'altra molecola vicina. I fenomeni di fluorescenza dipendono da processi di eccitazione con rilascio di energia, caratterizzati da una cinetica ben determinata.

Esistono diversi tipi di quenching (smorzamento) della fluorescenza. Il quenching di tipo statico si verifica quando molecole presenti nell'intorno impediscono la transizione della molecola allo stato eccitato. Il quenching di contatto o collisionale, invece, si verifica quando molecole vicine impediscono di rilevare il segnale di fluorescenza.

La FRET si basa su un particolare meccanismo di trasferimento dell'energia che avviene dopo l'assorbimento di radiazioni elettromagnetiche. I fenomeni di fluorescenza possono essere dovuti non solo al trasferimento diretto di radiazioni elettromagnetiche, ma anche all'effetto della vicinanza di due molecole di diversa natura (fluorofori), che può causare un fenomeno di trasferimento di energia e quindi di fluorescenza di risonanza.

energy transfer (FRET): Situazione in cui il contatto avviene con molecola che non produce smorzamento, ma che a suavolta è in grado di ricevere un quanto di energia e in seguito emettere un segnale di fluorescenza
Passaggio di energia da un donatore che è stato eccitato a un accettore secondario che si eccita epoi ritorna al livello energetico basale con emissione di fluorescenza
Entrambe le molecole devono essere due fluorocromi
Lo spettro di emissione del donatore deve essere parzialmente sovrapposto con lo spettro di eccitazione dell'accettore
Avviene un progressivo spostamento verso lunghezze d'onde maggiori, energie minori
Affinché si verifichi FRET è indispensabile la vicinanza delle due molecole, altrimenti avviene la perdita del primo segnale
Tecnica che può essere utilizzata per studiare la vicinanza di due proteine, la loro interazione (possibile marcare porzioni di proteina che possono entrare in contatto tra loro), cambiamenti conformazionali.

dosaggi di attività enzimatiche, interazioni DNA-DNAA seconda che si verifichi o no la fluorescenza, è possibile dire se due molecole erano in rapporti spaziali che consentivano fenomeni di FRET DICROISMO CIRCOLARE

Dallo spettro del visibile:

• aumento della lunghezza d'onda → infrarosso, microonde, radio
• diminuzione della lunghezza d'onda → ultravioletto, raggi X, raggi gamma

La luce dell'ultravioletto ha lunghezze d'onda paragonabili alle cellule e alle molecole biologiche

Con i raggi X si raggiungono le dimensioni atomiche

Che cosa oscilla in un'onda elettromagnetica? Il campo elettromagnetico

L'onda si propaga in una direzione, i campi elettrici e magnetici sono perpendicolari l'uno all'altro e oscillano su due piani diversi

Si trovano perpendicolari entrambi rispetto alla propagazione dell'onda

Onda trasversale: la propagazione dell'onda è trasversale rispetto alla grandezza che oscilla

La direzione

del campo elettrico indica la polarizzazione dell'onda

Polarizzazione → direzione del campo elettrico dell'onda stessa

Luce non polarizzata≫ Le sorgenti creano tantissime onde, ciascuna con direzioni diverse in cui il campo elettrico ha sempre una direzione diversa

Luce polarizzata≫ Il campo elettrico di tutte le onde luminose è orientato sempre nella stessa direzione tutta la luce generata ha direzione di propagazione dell'onda nello stesso piano

Nel caso di polarizzazione lineare, l'onda si propaga lungo la direzione z e il campo elettrico oscilla sempre nella stessa direzione, sempre nello stesso piano

La luce può anche essere circolarmente polarizzata, il campo elettrico si muove circolarmente (varia il verso, può essere destra o sinistra)

Il campo elettrico gira intorno a un'ellisse nel caso della luce polarizzata ellitticamente

È possibile creare luce linearmente polarizzata tramite la composizione di due luci

circolarmente polarizzata main verso opposto. Le due frecce corrispondono a due raggi di luce polarizzata circolarmente sinistra e destra. Se queste due luci vengono composte, la composizione di due raggi luminosi è la somma dei campi elettrici. Come risultato si ottiene un'onda che ha come direzione la freccia rosa. La composizione delle due luci rimane sempre sulla stessa linea, la risultante resta sempre sullo stesso piano. Luce linearmente polarizzata. La luce viene fatta incidere su un campione e avviene un assorbimento selettivo → le due componenti polarizzate circolarmente sinistra e destra non vengono assorbite in uguale misura: la luce polarizzata circolarmente dx viene assorbita di più rispetto alla sinistra. Inizialmente si hanno due raggi luminosi circolarmente polarizzati di uguale intensità ma con verso opposto. Attraverso il campione, la luce destra viene assorbita maggiormente. Una volta che la luce risultante esce dal campione, il campo elettrico della.

luce destra è inferiore rispetto al campo elettrico della luce sinistra (rimangono entrambe circolarmente polarizzate)

In uscita dal campione, la composizione delle due luci polarizzate darà origine a un campo elettrico che non sarà più polarizzato linearmente, ma ellitticamente

Perché le due luci sinistra e destra vengono assorbite in maniera diversa?

L'assorbimento dipende dalla chiralità delle molecole che hanno assorbito la luce → fenomeno fisico che permette di studiare le molecole in analisi

Se le molecole hanno un certo tipo di chiralità, la luce destra e sinistra verranno assorbite in maniera diversa, l'interazione della luce circolarmente polarizzata è funzione della chiralità delle molecole

A seconda dell'ellitticità finale ottenuta in seguito all'assorbimento, si ottengono delle informazioni riguardo alla chiralità delle molecole

Fenomeno di dicroismo circolare → osservato

quando molecole otticamente attive (sostanze chirali) assorbono diversamente la luce polarizzata circolare destra o sinistra. La luce risultante è ellitticamente polarizzata. Caso limite: una componente viene completamente assorbita, resta solo una componente. Entra luce linearmente polarizzata, a seguito dell'assorbimento completo di una componente alla fine si ottiene una luce circolarmente polarizzata. Più forte è l'assorbimento differenziale di una delle due componenti, più "grassa" sarà l'ellisse della radiazione emergente. Da quanto è ellittica la luce finale si ottengono informazioni sulla chiralità delle molecole che hanno assorbito. L'ellitticità (Ɵ) è unità di misura del dicroismo circolare → Ɵ = arco tangente di b/a (semi-assi). Si misura in gradi in quanto è un angolo. 1. Somma luce circolarmente polarizzata sinistra e destra uguali → luce linearmente polarizzata. 2. Se una

delle due luci circolarmente polarizzate è più piccola in seguito all'assorbimento → ellissi allungata

Più una delle due luci è piccola, più si ottiene un'ellisse una forma diversa (più simile a cerchio)

Se una delle luci viene completamente assorbita → luce circolarmente polarizzata

L'assorbimento di un campione dipende da:

• concentrazione delle molecole che assorbono (più concentrate, più luce assorbita)
• spessore del cammino ottico

Per normalizzare questi aspetti, si definisce l'ellitticità molare → [Ɵ] = Ɵ/(c*d)

ellitticità misurata/concentrazione * spessore di cammino ottico, si misura in deg M cm^-1

In alcune applicazioni si definisce l'ellitticità molare media per residuo → divisione anche per il numero di residui della proteina che sta assorbendo la radiazione

Utile quando l'assorbimento è dettato dal numero di amminoacidi presenti nella

catena polipeptidica, consente confronto tra proteinediverse

L'ellitticità molare viene riporta anche come deg cm / dmoli²deg M cm^-1 -1M = L (dm ) /moli → Ɵ = dm * deg / moli * cm → usato fattore 1000 per trasformare dm in cm → fattore 0.1 per avere decimoli^-1

A quali lunghezze d'onda si osservano i segnali di dicroismo circolare delle proteine?

Studio di catene laterali aromatiche: 260-280 nm (near UV)

Studio di legami peptidici:190-220 nm (far UV) → più utilizzato, regione con fortissimo segnale di dicroismo circolare

A seconda dell'assorbimento del backbone, si possono ricavare informazioni sulla struttura secondaria della proteinadi dicroismo circolare (FAR UV)

SpettroMisura del valore di dicroismo cellulare in funzione della lunghezza d'onda della luce incidente (asse x)

A seconda della lunghezza d'onda linearmente polarizzata incidente, si ottiene in uscita dal campione in seguito all'assorbimento

unadiversa luce ellitticamente polarizzata e che quindi ha certo valore di ellitticitàMisura nel far UV: regione con una lunghezza d’onda tra i 190 e i 250 nmRegione in cui assorbe il legame peptidicoLo strumento parte con una luce a 190 nm linearmente polarizzata e viene fatta attraverso il campioneIn uscita si ottiene una luce ellitticamente polarizzata, il valore di ellitticità viene messo sul graficoCreazione di un profilo che è lo spettro del dicroismo circolare nella regione di interesse considerataA seconda della struttura del backbone, si ottengono dei profili diversiSe α-eliche → altissima ellitticità positiva a basse lunghezze d’onda∘ verso valori negativi doppia gobba intorno a 280 nm (208 nm prima gobba)Se β-sheet → picco positivo più basso (190 nm), unico picco negativo a 215 nm∘ Se random coil → picco molto positivo a 190-200 nm, piccolo segnale positivo a 215 nm∘ segnale minimo a 195 nmSi

ottengono dei profili diversi a seconda delle strutture secondarie presenti

Assorbimento nell’intervallo tra 180 nm e 260 nm e misura dei valori di ellitticità

In base allo spettro, la mioglobina ha una struttura maggiormente a α-eliche

Studio della struttura secondaria media della proteina

Una volta che si ottiene uno spettro, si è in grado di capire quanto di ciascuna componente dialfa/beta/random coil è presente nella proteina?

Esistono degli algoritmi di deconvoluzione che dati gli spettri base delle strutture e dato ilprofilo misurato, cercano di ricostruire il profilo misurato in base alle componenti note →danno come risultato % di α/β/random coil

Sono parzialmente affidabiliintrinsecamente disordinate

Proteine

Acquisiscono una struttura ben definita tipicamente quando interagiscono con i loro partner

Da sole hanno delle strutture transienti, altamente variabili

Tipico spettro di proteina intrinsecamente disordinata è soprattutto

o assenti) e positivo a lunghezze d'onda più elevate (dove le strutture ordinate sono presenti).