Laboratorio di microbiologia

Terreni di coltura

I terreni di coltura sono substrati nutritivi utilizzati per:

Mantenimento in coltura dei batteri

Dopo aver isolato un determinato ceppo, per poterlo mantenere in coltura, è possibile effettuare delle sottocolture, ovvero si trasferisce il ceppo isolato su un’altra piastra, ottenendo così una nuova coltura, una coltura pura del microrganismo di interesse. Il mantenimento in coltura è fondamentale se si vogliono condurre degli studi sul ceppo isolato oppure se si vuole far crescere tale ceppo in abbondanza, come ceppo puro, come unico ceppo sulla piastra, per poi congelarlo a -20°C, -80°C ed utilizzarlo per successivi studi.

Isolamento e conta

Dopo che in laboratorio giunge un campione biologico, è necessario prelevare un’aliquota del campione stesso e seminarlo su varie piastre di terreni solidi; in alternativa, se necessario, il campione viene posto in brodo di arricchimento. Fatto questo, il giorno dopo (dal momento che la maggior parte dei microrganismi ha un tempo di crescita pari a 24 ore) sulla piastra sarà possibile osservare una crescita variata, ovvero non si avrà un solo tipo di batterio, ma saranno cresciuti anche i cosiddetti commensali, i normali abitanti del nostro organismo, insieme ai patogeni, se presenti. Quindi la crescita su terreni di coltura è indispensabile per l’isolamento da campione e, a volte, anche per contare la carica batterica, di cui alcuni referti devono essere corredati, come l’urinocoltura. Ci sono dei range di valori al di sopra dei quali la coltura viene considerata positiva; al di sotto di questi valori, la coltura è negativa.

Determinazione della sensibilità dei microrganismi

Una volta che il microrganismo è stato isolato e identificato con le prove biochimiche opportune, è necessario fornire al paziente un antibiogramma, ovvero una specie di elenco che fornisce indicazioni circa le terapie più efficaci, quelle inefficaci e gli intermedi. È vero, però, che ci sono apparecchi in automazione che, oltre ad identificare il ceppo, forniscono l’antibiogramma, ma poiché si tratta di pannelli precostituiti e non preparati ogni anno, contengono un numero e una serie fissa di antibiotici che, in seguito a scoperte più recenti, potrebbero non essere più efficaci nei confronti di determinati microrganismi. Questo è dovuto al problema, in continua evoluzione, della resistenza dei batteri nei confronti degli antibiotici: quindi, un antibiotico efficace, ad esempio, un anno fa, non potrebbe essere più utilizzato nell’anno in corso proprio a causa di questo fenomeno. Saper realizzare un antibiogramma manuale serve a saper supportare il pannello della macchina quando questo espone una serie di R ed I (R = resistenze; I = intermedi). Per alimentare lo studio delle possibili sensibilità dei batteri si acquistano a parte o dischetti antibiotici o striscette per fare gli Etest, per incrementare la gamma degli antibiotici testati e che possono essere utili alla terapia, in quanto, tra quelli non inseriti nel pannello corredato con la macchina, è possibile che vi siano altri antibiotici di ultima generazione, introdotti da poco nel commercio, utili a fini terapeutici. Questo serve soprattutto per le infezioni cosiddette nosocomiali, cioè ospedaliere, dovute a ceppi molto resistenti a quasi tutte le molecole antibiotiche e quindi costituiscono un problema in quanto, quando al danno già presente si aggiunge una sovrinfezione nosocomiale, bisogna testare altre molecole che possano essere d’aiuto al medico per eradicare l’infezione. Quindi, il terreno di coltura e alcuni, in particolare, servono per eseguire l’antibiogramma. Il metodo classico, utilizzato a questo scopo, è quello di Kirby-Bauer, oppure esiste l’Etest, che è una sorta di Kirby-Bauer modificato.

Studio delle caratteristiche biochimiche

A seconda dei componenti che vengono introdotti nel terreno di coltura, sarà possibile evidenziare particolari caratteristiche del microrganismo. Ad esempio, è possibile capire se il microrganismo utilizza un carboidrato piuttosto che un altro e, in seguito all’utilizzo, produce degli acidi che vengono evidenziati attraverso la presenza di un indicatore che vira quando l’ambiente si acidifica.

Test di sterilità

Ad esempio, quando si opera nella ricerca e si hanno a disposizione dei reagenti che bisogna utilizzare e che sono stati conservati in camera fredda per molto tempo, con tappi realizzati con garze e non a chiusura ermetica, è possibile verificare se un reagente, conservato in queste condizioni, si è contaminato. Per far questo, si preleva un’aliquota della sostanza e la si semina su un terreno agarizzato; si mette quindi ad incubare per 24 ore in camera calda. Il giorno dopo, se sono cresciute delle colonie, significa che il reagente si è contaminato e che non lo si può utilizzare a scopo di ricerca nelle condizioni in cui si trova. Potrebbe essere utilizzabile, ad esempio, se filtrato con dei filtri a maglie molto piccole per eliminare i batteri contaminanti oppure lo si scarta e se ne prepara uno nuovo.

Componenti dei terreni di coltura

Dal momento che i terreni di coltura sono impiegati per numerosi scopi ed essendo substrati nutrienti, devono essere fatti in maniera tale da garantire la sopravvivenza e la moltiplicazione di ciò che si semina, ovvero dei microrganismi, che devono poter soddisfare le loro esigenze nutrizionali e necessitano di fonti di azoto, carbonio, idrogeno, zolfo, fosforo, sodio, potassio, magnesio, ferro e manganese. Quindi, vi sono alcuni terreni di base e, poiché esistono dei batteri cosiddetti esigenti o fastidious, è necessario fornire a questi ultimi dei nutrienti aggiuntivi, in assenza dei quali non potrebbero crescere. Quindi, la riuscita del lavoro dipende dal tipo di terreno che si utilizza, poiché bisogna conoscere a monte le esigenze dei batteri, per garantire loro una crescita considerevole. Ad esempio, se è noto che un dato microrganismo non cresce su un terreno senza sangue, è inutile seminarlo su tale terreno, a meno che questo non abbia dei componenti che sostituiscono il sangue come arricchimento.

Scelta dei terreni di coltura

Innanzitutto, quando si semina un campione, non si sceglie un solo tipo di piastra, ma si scelgono sempre un terreno ricco, nutriente, contenente sangue e, a seconda della provenienza del campione, se ci aspetta, ad esempio, un batterio Gram - o un Gram +, si scelgono, uno per tipo, dei terreni selettivi (ad esempio, terreno selettivo per Gram +, terreno selettivo per Gram -, terreno specifico per i miceti, ecc.). Quindi, prima ancora di effettuare l’esame batterioscopico o osservare la colorazione di Gram, bisogna assicurare una batteria di nutrienti che consentano la crescita batterica.

Componenti principali dei terreni di coltura

• Peptoni: sono idrolizzati di proteine e si possono ottenere con diverse tecniche, come quelle di idrolisi enzimatica, ad esempio, che sono le più indicate, oppure quelle di idrolisi acida, che si realizzano utilizzando degli acidi forti, come acido cloridrico o acido solforico. Il maggior impiego dell’idrolisi enzimatica rispetto a quella acida è dovuto al fatto che gli enzimi tagliano le proteine in punti precisi e preservano l’efficacia di vitamine e amminoacidi; viceversa, l’idrolisi acida scinde tutti i legami proteici e, molto spesso, denatura gli amminoacidi e le vitamine.
• Carboidrati: vengono inseriti con opportuni criteri, proprio per vedere se il ceppo che è stato seminato utilizza o meno un determinato carboidrato.
• Indicatori di pH: indicano che quel carboidrato che è stato inserito nel terreno è stato utilizzato dal batterio mediante il viraggio di colore. Infatti, quando viene utilizzato un carboidrato, si formano degli acidi e quindi l’indicatore presente vira.
• Sali
• Agenti selettivi: servono a selezionare le specie microbiche (ad es., terreno per Gram +, terreno per Gram -), in quanto impediscono la crescita di categorie specifiche di batteri.
• Agenti solidificanti: il più conosciuto e universalmente utilizzato è l’agar (o agar-agar alla francese), che è un estratto da alghe e che ha il solo scopo di rendere solido il terreno, non ha proprietà nutritive. Infatti, quando si ha disposizione in laboratorio una polvere disidratata di un terreno liquido, quindi di un brodo, e non si ha la formulazione disidratata di terreno agarizzato, si aggiunge una percentuale di agar alla polverina di brodo e si realizza così un terreno solido. L’agar ha quindi proprietà solidificante, gelificante.
• Arricchimenti: l’arricchimento per eccellenza è il sangue, anche se non è l’unico ad essere utilizzato. È, infatti, possibile, utilizzare il siero, il tuorlo d’uovo, il latte. Tra i terreni contenenti fecola o tuorlo d’uovo ce n’è uno che è impiegato per la crescita dei micobatteri, associati alla tubercolosi (Mycobacterium tuberculosis), malattia che nel nostro paese non è mai stata ereditata ma che, con l’immigrazione clandestina e i bacilli portati dalle tribù rom, è sempre presente e non in casi sporadici.
• Substrati enzimatici cromogenici e fluorogenici: sostanze che, aggiunte al terreno di coltura, fanno crescere le colonie di un determinato colore (substrati cromogenici), oppure è possibile apprezzarne la fluorescenza alla luce della lampada di Wood, che è una lampada a fluorescenza (substrati fluorogenici). Vi sono, quindi, terreni cromogenici e fluorogenici che, fino a qualche anno fa erano proibitivi a causa dei costi, ma ora si sono più o meno equiparati a quelli non cromogenici e non fluorogenici, quindi sono più abbordabili. Questi tipi di terreni vengono utilizzati per lo più non nei grandi centri (come può essere, ad esempio, un ospedale pediatrico o un policlinico, quindi nei grandi ospedali), ma nei piccoli laboratori privati o nei piccoli ospedali, che non dispongono di laboratori di microbiologia super attrezzati con macchinari e non hanno, quindi, la possibilità di fare l’identificazione in automazione; hanno, dunque, bisogno di terreni che possano quanto più possibile essere d’aiuto nella strada per l’identificazione, data la possibilità di impiegare mezzi manuali.

Tipologie di terreni di coltura

I terreni di coltura permettono lo sviluppo batterico dopo un periodo di incubazione che, in linea di massima, va dalle 24 alle 48 ore (48 ore quando, ad esempio, il giorno dopo le colonie sono molto piccole e quindi hanno bisogno di un po’ di tempo in più per ingrandirsi; naturalmente altri batteri hanno bisogno di più tempo, 3-4 giorni, una settimana; i micobatteri ed altre specie hanno bisogno addirittura di 8 settimane per crescere e manifestarsi poiché hanno tempi di moltiplicazione lunghissimi) in genere a 37°C (quasi tutti tranne alcuni che richiedono temperature leggermente superiori, intorno ai 40°C, o addirittura inferiori a 37°C) in termostato. Possono essere:

• Liquidi: ovvero i brodi di arricchimento, in cui può essere aggiunto del sangue;
• Solidi: laddove c’è una giusta percentuale di agar che li renda solidi;
• Arricchiti: quando hanno dei nutrienti in più rispetto ai modelli base;
• Selettivi: quando contengono agenti selettivi, come i sali, aggiunti in opportune concentrazioni, o gli antibiotici (ad esempio, se si vogliono selezionare i batteri Gram -, bisognerà aggiungere degli antibiotici che impediscano la crescita dei batteri Gram +, e viceversa);
• Differenziali: molti terreni sono sia selettivi che differenziali in quanto permettono, grazie alla presenza, soprattutto di un carboidrato, di capire se è stato utilizzato e quindi di avere la minima idea sulle caratteristiche glutiniche del microrganismo che è cresciuto. Il terreno viene definito differenziale perché permette di scoprire, mediante cambiamento di colore che è avvenuto intorno ad una colonia nel mezzo, che è avvenuta una determinata reazione, oppure che la colonia cresce con quel particolare colore perché ha assunto il colorante che è inserito come componente nel terreno (anche i coloranti, ad esempio, possono svolgere l’azione di agenti selettivi). In alcuni terreni sono presenti questi coloranti, come il MacConkey Agar, che è un terreno comunemente utilizzato in laboratorio e contiene il cristalvioletto, che è utilizzato come colorante nella colorazione di Gram, oppure in quello dei micobatteri, che si chiama Lowenstein-Jensen, in cui è presente il verde malachite.

Terreni arricchiti

Sono costituiti da una base nutriente, che può essere ad esempio, un terreno che si chiama Columbia, alla quale possono essere aggiunti dei nutrienti in eccesso, poiché permettono la crescita di batteri esigenti o fastidious. Il nutriente, l’arricchimento per eccellenza è il sangue defibrinato sterile di montone o di coniglio. In laboratorio si utilizza preferenzialmente il sangue di montone, in quanto si tratta di un animale di taglia più grossa. Infatti, alle ditte e alle case che producono sangue defibrinato non conviene allevare conigli perché sono animali più piccoli, da essi si ricava poco sangue; d’altronde, sono pochi i batteri esigenti che pretendono il sangue di coniglio. Alcuni batteri hanno preferenze per la specie di animale da cui deriva il sangue, quindi alcuni possono prediligere il sangue di coniglio, altri quello di montone, altri cambiano le loro caratteristiche emolitiche su sangue di animali di diversa specie. In altri casi è anche possibile utilizzare il sangue di cavallo, ma è più costoso.

Il sangue defibrinato sterile di montone o di coniglio viene aggiunto all’agar (inteso come agar base, ossia un terreno nutriente che funge da base a cui aggiungere poi il sangue, come può essere un Columbia oppure un TSA, non come agente solidificante) fuso e raffreddato a 50°C in bagnomaria termostatato. In genere il sangue viene aggiunto in percentuale variabile, dal 5 al 10%, più spesso in percentuale del 5%, visti il consumo e il costo. Il sangue è defibrinato in quanto privo dei fattori che ne favorirebbero la coagulazione, sterile per evitare la crescita di contaminanti.

Quando i terreni vengono preparati, vengono sterilizzati in autoclave, in cui vengono raggiunte temperature di 121°C. Se il sangue venisse aggiunto a questa temperatura, si denaturerebbero le proteine e quei componenti termolabili in esso presenti. Per essere sterilizzati, i terreni vengono posti in grosse beute (1-2 L). Si tende, tuttavia, ad utilizzare piastre acquistate già pronte, poiché bisogna garantire la standardizzazione del metodo, in quanto, è vero che quando si preparano le piastre in laboratorio si devono rispettare determinati criteri di altezza dello strato e quindi si dovrebbe pipettare con la giusta aliquota in ogni piastra il terreno liquido, però questo si può fare in un piccolo laboratorio, che non ha un’utenza particolarmente elevata. Nei laboratori che servono una vasta utenza, per una risposta che sia garante della standardizzazione, è necessario utilizzare tali piastre già confezionate.

I terreni vengono quindi preparati in laboratorio per le sottocolture o per altri lavori di tipo sperimentale o per emergenze dell’ultimo momento, come un agar sangue, o qualche altro tipo di terreno. Quando si piastra il terreno dalla beuta in piastra Petri, bisognerebbe farlo sotto cappa, a flusso laminare. Nel momento in cui bisogna piastrare il terreno su un numero molto elevato di piastre Petri, è importante disporre di un becco Bunsen acceso in modo che, dopo aver aliquotato il terreno liquido in piastra, prima di chiudere con il coperchio, è possibile passare sulla piastra la fiamma del becco bunsen, così da eliminare eventuali batteri ambientali presenti sul terreno liquido. Il terreno si lascia solidificare sul bancone con il coperchio chiuso; poi, per sicurezza, con il coperchio scostato per evitare la condensa che si forma durante la solidificazione, viene lasciato asciugare sotto cappa a flusso laminare e vengono prelevati dei campioni di piastre per ogni loggio di terreno preparato e vengono incubati per 24 ore in camera calda, così il giorno dopo, è possibile osservare se sono cresciuti dei batteri: se sono presenti i batteri, quel terreno non potrà essere utilizzato, viceversa in caso contrario.

Terreni di arricchimento e selettivi

Servono ad isolare una specie patogena da materiale polimicrobico. Contengono sostanze facilitanti la crescita di specie ricercate ed anche sostanze che non ostacolano lo sviluppo della specie in questione e impediscono quello di altre, contenute nel materiale biologico. Quindi questi terreni devono essere sì, ricchi di nutrienti, ma devono possedere qualche componente che selezioni la specie che si vuole far crescere. Quindi possono esserci terreni ricchi, al sangue, con aggiunta di antibiotici, che li rendono selettivi.

Terreni differenziali

Contengono dei rivelatori di attività biochimiche caratteristiche; i più usati sono quelli per le prove di fermentazione dei carboidrati. Il modello primordiale prevede che il batterio venga coltivato in provetta con terreno liquido in presenza dell’1% del carboidrato insieme ad un indicatore che cambia colore se viene prodotto acido. Siccome in seguito all’utilizzo di un carboidrato viene sempre prodotto acido, l’indicatore cambia colore, vira, e ciò è osservabile dal cambiamento di colore del mezzo. Questo non si fa solo sui terreni liquidi, in genere non si fa più per la stragrande maggioranza dei casi con terreni liquidi. Su questi terreni c’è sempre un carboidrato (nel MacConkey, ad esempio, c’è il lattosio). A seconda dei batteri che vengono seminati, ci saranno quelli che utilizzano il lattosio e quelli che non lo utilizzano, ci si accorgerà di questo in base alle reazioni. Il MacConkey, terre