Microbiologia e laboratorio

Cap 1: Generalità

Batteri

I batteri hanno avuto più tempo per evolversi rispetto agli eucarioti. Come simbionti di eucarioti superiori (piante, animali), ne garantiscono la sopravvivenza tramite produzione di vitamine e fattori di crescita. Solitamente, essi vivono a discapito dell’uomo. Per ogni individuo della specie umana il rapporto medio cellule batteriche: cellule umane è di 10:1 (10¹³:10¹² cellule/individuo). Il peso complessivo delle cellule batteriche è calcolato intorno ai 2-3 Kg (peso di un organo come il fegato). La presenza stabile di microrganismi è benefica per la nostra salute. Si pensa, ad esempio, che l’interazione dell’uomo con i microrganismi determini la corretta formazione dell’intestino. Tra l’altro pare che ci sia una correlazione tra tipo batterico e determinazione del peso corporeo dell’organismo che lo possiede nel suo intestino. Questo dipende dall’energia e dalle sostanze che utilizzano i batteri. I microrganismi sono responsabili di gran parte della produzione di O₂ sulla terra. La stessa fotosintesi delle piante è stata “presa in prestito” dai batteri che l’avevano inventata miliardi di anni prima. Non a caso, il cromosoma cloroplastidiale ricorda quello dei cianobatteri.

Esistono, però, anche batteri “nemici”, i patogeni, che sono la principale causa di morte per l’umanità. Due studiosi australiani hanno assegnato ad Helicobacter pylori la causa della malattia detta ulcera duodenale, che si sviluppa a livello del tratto dell’intestino appena in uscita dallo stomaco, collegato al duodeno tramite il piloro. Il batterio si lega al piloro e resiste al pH acido perché si ricopre di ammoniaca. Si immaginava, prima di questa scoperta, che, laddove c’era un eccesso di acidità prodotto da un individuo, questo non veniva neutralizzato dai succhi pancreatici, ma quel pH danneggiava la mucosa del duodeno, generando ulcera. Curando tali patologie con antiacidi (che facevano decrementare la sintesi di HCl nello stomaco) si notò che la sintomatologia peggiorava. Si scoprì, allora, l’esistenza di questo batterio che generava l’infiammazione. Ovviamente, trattando con antiacido si favoriva l’attività proliferativa del batterio. I due studiosi isolarono, quindi, il batterio e attuarono uno dei postulati di Koch, cioè associarono quel batterio a quella patologia. Si autosomministrarono il batterio, questo sviluppò un’ulcera che curarono con l’antibiotico specifico e vinsero il premio Nobel. Grazie a Pasteur si può sapere la connessione tra la malattia ed i microrganismi.

I postulati di Koch

• Il presunto agente responsabile della malattia in esame deve essere presente in tutti i casi riscontrati di quella malattia.
• Deve essere possibile isolare il microrganismo dall'ospite malato e farlo crescere in coltura pura.
• Ogni volta che una coltura pura del microrganismo viene inoculata in un ospite sano (ma suscettibile alla malattia), si riproduce la malattia.
• Il microrganismo deve poter essere isolato nuovamente dall'ospite infettato sperimentalmente.

Se positivi, abbiamo la prova della patogenicità del microrganismo e della sua influenza in un determinato quadro patologico.

Limitazioni

• Alcuni microrganismi commensali o normalmente presenti nell'ambiente danno patologia solo in determinati soggetti o situazioni.
• Spesso l'inoculazione, invece di portare a una patologia conclamata, provoca danni subclinici.
• Alcuni microrganismi (ad esempio il Mycobacterium leprae o i fitoplasmi) non sono coltivabili in vitro o non è possibile trovare un animale adatto all'inoculazione (perché il virus ha tropismo unico per l'uomo o perché gli altri animali sviluppano una diversa patologia rispetto all'uomo).

Il primo vaccino fu messo a punto osservando il fatto che, laddove c’erano forti epidemie di vaiolo (prodotto da un virus), le donne addette alla mungitura delle mucche, pur avendo formazioni simili al vaiolo, non si ammalavano mai di questa patologia. Fu, dunque, prelevato il pus presente nelle bolle delle mungitrici e fu somministrato a persone malate di vaiolo. Queste ultime o guarivano o non si ammalavano mai. Il vaccino è così detto perché deriva dal fatto che è stato utilizzato siero di vacca.

• Biofilm – si è visto che i batteri, invece di crescere come singole cellule separate, possono articolarsi in un’organizzazione semicoloniale, cioè possono produrre degli esopolisaccaridi che formano film (pellicole) all’interno dei quali vengono avvolti ed in queste protezioni assumono caratteristiche come resistenza agli antibiotici, a disinfettanti o possono riuscire a stare senza nutrienti perché via via mangiano i polisaccaridi del film.
• Microbiota – insieme dei microrganismi che colonizzano l’intestino, ma anche altri distretti.

I procarioti differiscono dagli eucarioti in molti caratteri, comprese la dimensione e la mancanza di un sistema di membrane interne. Tutti i procarioti sono unicellulari, però, tra questi vi sono anche degli eucarioti (muffe, funghi e lieviti). I lieviti sono unicellulari, ma eucarioti.

I procarioti si dividono in:

• Archea: in questo gruppo sono collegati batteri con caratteristiche estremofile.
• Bacteria: in base alla colorazione di Gram, si dividono in Gram + e Gram -.

Forma e organizzazione:

• Cocci (s., cocco) – sfere
• Diplococci (s., diplococco) – coppie
• Streptococci – catenelle
• Staphylococci – raggruppamenti a grappolo
• Tetradi – 4 cocci in quadrato
• Sarcinae – configurazione cubica di cocci

Colorazioni

Colorazione di Gram

La colorazione di Gram è una procedura di colorazione differenziale più generalmente usata che divide i batteri in due gruppi sulla base di differenze nella struttura della parete cellulare. Prima dell’avvento della microscopia a contrasto di fase, che consente di vedere i batteri anche senza pre-colorarli, c’era la necessità di colorare il campione.

1. Sviluppando queste tecniche di colorazione, il microbiologo Gram utilizzò una colorazione di Cristal-violetto che somministrò alle cellule isolate, e tale colorazione, indipendentemente dal batterio, colora di viola le cellule e poi, verranno classificati in Gram- e Gram+.
2. Poiché il Cristal-violetto è una molecola piccola e può entrare ed uscire dalle cellule, si usa il mordenzante (iodio). Questa è una molecola che entra nella cellula, si lega al Cristal-violetto e rende stabile quella colorazione perché fa incrementare la grandezza della molecola di Cristal-violetto che, essendo più grande, tende ora a rimanere nella cellula.
3. Questo a meno che non si effettua la decolorazione con l’utilizzo di alcool etilico, come etanolo; l’alcool restringe i pori dello strato di peptidoglicano ed il complesso iodio-colorante viene trattenuto. In questo step osservò che alcune cellule rimanevano colorate di viola (Gram +) ed in altre, tale colorazione scompariva (Gram -) dopo trattamento con alcol.
4. Per visualizzare i Gram - si può effettuare una contro colorazione con la Safranina rossa. Essa colora di rosso i soli Gram- e quindi, in un campo microscopico ottico, riusciamo a contraddistinguere i due tipi di Gram. Ciò è spiegato da una differenza di tipo strutturale dell’involucro che riveste quella cellula batterica. Infatti, la colorazione formatasi tra il Cristal violetto e la soluzione iodata, dato che i Gram- hanno un involucro molto sottile, fuoriesce; nei Gram + invece, l’involucro più spesso blocca la fuoriuscita del colorante e quindi il viola resta intrappolato all’interno della cellula. I Gram + sono molto sensibili alla penicillina.

Colorazione Acid-Fast

Particolarmente utile per colorare i membri del genere Mycobacterium, il cui alto contenuto lipidico della parete è responsabile delle caratteristiche di colorazione. I micobatteri, per la particolare struttura e composizione della parete cellulare, hanno la capacità di trattenere la colorazione della fucsina basica (colorante rosso) anche quando trattati con decoloranti come l'alcool o gli acidi minerali.

Colorazione batterica

Una caratteristica importante dei batteri è quella di avere un involucro intorno ad essi, detto capsula, costituita da esopolisaccaridi. Batteri privi di capsula o capsulati possono essere patogeni o non patogeni. Quindi, la presenza della capsula potrebbe determinare la patogenicità del batterio. La tecnica della colorazione negativa consente rapidamente di capire se un batterio possiede o meno la capsula. Essa è basata sull'utilizzo di inchiostro nero che va a colorare il background. La capsula di non è interessata al contatto dell'inchiostro, per cui rimane bianca in campo scuro.

Colorazione delle endospore

Si tratta di una tecnica di doppia colorazione nella quale l’endospora batterica è di un colore mentre la cellula vegetativa di un altro.

Colorazione dei flagelli

In questa tecnica viene applicato un mordenzante per aumentare lo spessore dei flagelli.

Capitolo 2: La cellula batterica

Struttura

All'esterno è presente la capsula che potrà esserci o meno, a differenza della parete che è sempre presente. In realtà, la parete è caratteristica di quasi tutti i batteri, tranne i micoplasmi. Ancora più all'interno c'è una membrana citoplasmatica che racchiude il citoplasma; in esso non è presente un vero e proprio nucleo, bensì un nucleoide, cioè la zona del citoplasma in cui è contenuto il cromosoma, ma non è delimitata da membrane od involucri. I batteri hanno un solo cromosoma (aploide) quasi sempre circolare, localizzato generalmente al centro della cellula, ma non è una regola.

Da quante coppie di nucleotidi può essere formato il cromosoma di una cellula batterica?

È estremamente variabile, ed è legata soprattutto alle caratteristiche del cromosoma. Va da 1 Mbp (1 mega base, cioè 1 milione di coppie di nucleotidi), tipico dei micoplasmi, fino a 10 Mbp (10 milioni di coppie), come gli streptomicei, estremamente autonomi.

Nota Bene: Sappiamo che il gene è un tratto di DNA che codifica per una proteina. Da esso dovrà scaturire, attraverso il processo di trascrizione e traduzione quello che alla fine sarà la proteina. Quindi avere un genoma più corto, significa avere meno geni e, quindi avere una necessità di produrre proteine inferiore.

Ma quanti sono i geni in una cellula batterica? Mettiamoci nelle condizioni di Escherichia coli: se 1 gene ha una lunghezza media di 1 kb (chilobase, mille coppie di nucleotidi) e se il cromosoma di Escherichia coli è di 4/5 Mbp, ci saranno 5000 geni. Partendo dall'esterno, è costituita da fimbrie e flagello. Il flagello è utile per il movimento; le fimbrie (formate dai geni fim) consentono l'adesione dei batteri sia patogeni che i probiotici (batteri che aiutano a mantenere lo stato di salute). Tra gli organelli troviamo i ribosomi, la cui composizione è un po' diversa dagli eucarioti. I vacuoli, detti vacuoli gassosi, contengono aria e si allargano o restringono consentendo ai batteri acquatici di galleggiare in modo più o meno profondo in funzione della quantità di luce ottimale per compiere fotosintesi.

Membrana delle cellule procariotiche

È definita universale in quanto è necessaria in tutti gli organismi viventi, separa la cellula dall’ambiente esterno, rappresentando una barriera selettivamente penetrabile: alcune molecole possono passare dentro e fuori la cellula; i sistemi di trasporto aiutano il movimento delle molecole. Rappresenta, inoltre, luogo di processi metabolici cruciali ed è implicata nella rivelazione e risposta a prodotti chimici dell’ambiente con l’aiuto di speciali recettori localizzati sulla membrana.

Mitocondri e batteri

Considerando una cellula eucariotica con all’interno un mitocondrio, per effettuare la respirazione cellulare, nella membrana interna dei mitocondri ci sono varie proteine fondamentali per la produzione di ATP. Poiché i batteri fanno respirazione, la struttura equivalente alla membrana interna mitocondriale è proprio la membrana citoplasmatica dei batteri. Da ciò capiamo che i mitocondri in passato erano batteri.

Struttura molecolare

Le membrane sono formate da un doppio strato fosfolipidico dove, la porzione lipidica è interna e si dispongono una di fronte all’altra, proprio per minimizzare il contatto con l’acqua (regione idrofoba); mentre la regione esterna (idrofila) è costituita dalla molecola di glicerolo (alcol trivalente con tre C) a cui si legano gli acidi grassi. Due dei carboni del glicerolo formano legami di tipo estere con due molecole di acido grasso, il terzo carbonio forma un legame, attraverso il fosfato, con molecole che possono variare a seconda del tipo di batterio, ad esempio se si dovesse legare la serina, avremmo la fosfatidilserina.

Come sappiamo, nelle membrane degli eucarioti c'è il colesterolo, utile a dare alla membrana un certo grado di rigidità. Il colesterolo è utile solo se si trova nelle quantità ideali per svolgere la sua funzione, serve a "risolvere" lo shock osmotico che le cellule subiscono, quindi, ha un'attività osmoregolativa (lisi osmotica). Le cellule batteriche, per affrontare gli shock osmotici, adottano come strategia il possesso della parete cellulare. Il colesterolo, o altri steroli come gli opanoidi, sarebbero del tutto insufficienti ad affrontare gli shock osmotici se non ci fosse la parete. I batteri vivono in ambienti ipersalini o iposalini, per cui liserebbero se non avessero la parete cellulare. I batteri hanno, quindi, opanoidi che sono strutturalmente simili agli steroli ma funzionalmente un po' diversi. (Colesterolo nelle cellule eucariotiche, opanoidi nelle batteriche).

In alternativa alla membrana costituita da un doppio strato fosfolipidico, abbiamo membrane monostratificate: Nell'ambito dei batteri, si distinguono eubatteri ed archeobatteri. L'elemento che principalmente li distingue è legato alla membrana citoplasmatica. Il mattone della membrana citoplasmatica negli eubatteri prevede la presenza di legami esteri tra il glicerolo e la catena di acidi grassi. Negli archeobatteri, invece del D-glicerolo c'è L-glicerolo (l'isomero ottico dell'altro), ma il vero carattere distintivo è il fatto che il legame è di tipo etere, in quanto il secondo carbonio (quello della molecola idrofobica) non è più legato con un –COOH, ma il legame è C-O-C (etere). Questo non ci consente di identificare come acido grasso la componente idrofobica della membrana degli archeobatteri, bensì come catene isopreniche. Tutto sommato, anche questa componente è idrofobica, per cui non ci aspettiamo differenze nell'organizzazione della membrana. In effetti catene chiamate fitanile (a), che si legano al C del glicerolo, consentono, comunque, di formare una struttura di membrana a doppio strato lipidico.

Gli archeobatteri, però, vivono in ambienti ipertermofili (70 fino a 105°C). Se avessero un doppio strato lipidico, a tali temperature, salterebbero completamente le strutture membranali (ci sono interazioni idrofobiche molteplici, ma deboli, dunque, non si tratta di legami covalenti). Gli archeobatteri sono riusciti ad evolvere, dunque, una membrana a singolo strato in cui non vi è discontinuità tra uno strato e l'altro. Ci sono alcuni batteri che, a seconda della temperatura a cui si trovano, possono modificare la composizione della membrana: a 0°C potrebbe essere utile una membrana più fluida; ad alte temperature un po' più rigida. La permeabilità è bassa quando parliamo di mostrati (massimo grado di ordine). Parliamo, in particolare, di molecole idrofobiche totalmente sature (sature= quando i C sono tutti uniti da singoli legami; saturare vuol dire aggiungere tutti gli H possibili, per cui il legame che i C possono ancora fare è uno solo, perché gli altri potenziali legami sono tutti occupati).

Tale tipo di membrana (monostrato) è tipico dei microrganismi che vivono ad elevate temperature ed hanno una bassa permeabilità. Quindi, possiamo dire che la permeabilità e la temperatura, nei procarioti, sono inversamente proporzionali. Nel caso delle membrane a singolo strato, se scende la temperatura, aumenta la permeabilità, il che vuol dire che quella membrana è più disordinata e questo è determinato dalla presenza di legami insaturi. Se passiamo al doppio strato, la permeabilità aumenta molto al diminuire della temperatura a cui quel batterio vive, tipico dei mesofili o termofili moderati. Quindi, nella figura, partiamo da archeobatteri con legami etere (che sono più ordinati), monostrato e legami saturi. Poi passiamo ad un batterio con doppio strato, ma ancora con legami etere. Infine, gli eubatteri con doppio strato e legami esteri. Gli eubatteri hanno legami parzialmente insaturi e poi totalmente insaturi. Questo permette alla stessa cellula o a cellule diverse di modificare lo stato di saturazione della membrana in funzione della temperatura.

Se E. coli vive nel nostro organismo a 37°C, allora avrà legami esteri saturi. Se, invece, si trova a 5°C, incrementerà il grado di saturazione degli acidi grassi perché, altrimenti, la membrana sarebbe troppo rigida e poco permeabile agli scambi. Affinché ciò avvenga, esistono enzimi detti saturasi.