Microbiologia e laboratorio

Il numero di cellule dopo N generazioni

NON È MAI ZERO, DEVE SEMPRE ESSERE ALMENO MAGGIORE O UGUALE AD 1, PERCHÉ SE FOSSE ZERO VORREBBE DIRE CREDERE ALLA GENERAZIONE SPONTANEA. C’è differenza nella rappresentazione: la curva logaritmica sarà una retta (perché la crescita è esponenziale); quella aritmetica incrementa ugualmente, ma non c’è una retta. In funzione del tempo di generazione può anche variare la pendenza della curva. È intuitivo pensare che, laddove un ceppo batterico duplica in sei ore avrà una certa pendenza, se duplica in due ore la pendenza sarà maggiore perché duplica in un tempo minore.

REGOLA: O NUMERO DI CELLULE DOPO N GENERAZIONI

Al tempo t0 il numero di cellule è dato da N0: nN= N X 20 dove:

• N: numero di cellule finali dopo n generazioni
• N0: numero di cellule al tempo t0
• n: numero di generazioni

Come si fa ad avere una stima del numero finale di cellule? Il numero iniziale lo conosciamo perché

Si moltiplica per il fattore di diluizione (10^-3) = 159 x 10³ = 1.59 x 10⁵ (numero di cellule presenti in 1 ml di campione originario). Di solito si prende come numero affidabile quello compreso tra 100 e 300.

ESERCIZIO 1:

Si coltivano in 100 ml di terreno di crescita 5000 cellule di un ceppo batterico prelevate da una coltura stazionaria. Il ceppo in esame ha le seguenti proprietà:

• Fase di latenza (a crescita zero): 100 minuti.
• Tempo di generazione in fase esponenziale: 25 minuti.

Calcolare il numero di cellule/ml dopo quattro generazioni esponenziali e il tempo impiegato in minuti per raggiungere tale valore (ignorare l'eventualità che alcune cellule muoiano durante tale periodo).

No. cellule/ml: ?

Tempo(min): ?

Dire che si coltivano in 100 ml 5000 cellule del ceppo batterico prelevato da una coltura stazionaria vuol dire che stiamo utilizzando cellule che sono un po' ferme perché si trovano in condizione di nutrienti limitati, dunque, laddove si preleva un

Po' di queste cellule e si inocula in un terreno fresco, bisogna considerare che, trovandosi nella fase stazionaria, dovranno prima adattarsi, per un certo tempo alla nuova condizione, poiché in questa fase della curva di crescita tutti i geni che servono per la produzione di enzimi per la crescita esponenziale sono spenti, quindi, serve più tempo per riadattarsi; le cellule entrano nella fase di latenza. L'esercizio ci dice che il tempo di generazione della fase esponenziale è di 25 minuti, ma ciò che dobbiamo trovare è il numero di cellula dopo 4 generazioni esponenziali. Allora, per conoscere questo numero, bisogna sapere il numero delle cellule al tempo t0, e questo corrisponde proprio a 5000 cellule per 100 ml. Nell'esercizio, però, viene chiesto di parametrare il numero di cellule all'unità di misura del ml (di solito, quando si vogliono confrontare cariche batteriche di tipologie differenti, il riferimento lo si

fasempre al ml, ecco perché bisognaconvertire); dunque, in 1 ml ci saranno50 cellule (5000/100); questo è N0. Aquesto punto abbiamo due opportunità:la prima è di applicare la formula N = N0x 2n - N = 50 x 24 – N = 50 x 16 = 800cellule/ml. Con la seconda opportunitàbisogna ricordare il concetto che unagenerazione corrisponde al raddoppiodel numero di cellule prese; ciò significache se devono passare 4 generazioni epartiamo da 50 cellule avremo, allaprima generazione 100 cellule, alla seconda 200, alla terza 400 ed alla quarta 800 cellule/ml. La secondadomanda dell’esercizio chiede il tempo impiegato per raggiungere questo numero di cellule. Il tempo di unagenerazione è di 25 minuti e, siccome le generazioni sono 4, il tempo si otterrà moltiplicando 4 x 25 = 100minuti. ATTENZIONE: se parla di tempo impiegato, intende dal momento in cui è stata effettuata quelladiluizione (cioè il passaggio dalla fase

stazionaria ai 100 ml), quindi non basterà considerare solo le 4 generazioni esponenziali, ma occorrerà anche aggiungere la fase di latenza, dunque, sommeremo ai 100 minuti che occorrono per le 4 generazioni, i 100 della fase di latenza e si raggiungeranno, così, 200 minuti.

ESERCIZIO 2

Un campione di 0.1 ml di una coltura batterica, diluita per 7 volte con coefficiente di diluizione 1:10, contiene 8 cellule. Determinare quante cellule per millilitro contiene la coltura batterica originaria.

In questo esercizio viene fatta una diluizione seriale. Questo campione diluito 7 volte (F.D. 10 ) contiene 87 cellule; verrebbe da dire subito che le cellule della coltura iniziale sono 8 x 10 (numero x fattore di diluizione)

Però, dobbiamo sempre considerare cellule per ml, e qui abbiamo piastrato 100 microlitri (un decimo di ml), dunque, bisogna moltiplicare ulteriormente per 10 (perché 8 x 10 sono le cellule in 0,1 ml). Il risultato, quindi, sarà 8 x 10

1. Coltiviamo in 100 ml di terreno di crescita 4 x 10³ cellule di un ceppo batterico prelevate da una coltura stazionaria.
2. Il ceppo in esame ha le seguenti proprietà:
• Fase di latenza (a crescita zero): 80 minuti.
• Tempo di generazione in fase esponenziale: 30 minuti.
• Numero di cellule a fine fase esponenziale: 1.5 x 10⁹.
3. a) Dopo quanti minuti vi sono 640 cellule/ml?
4. b) Dopo quante generazioni esponenziali si raggiunge tale valore?
5. c) Le informazioni 1, 2 e 3 sono tutte necessarie per tali calcoli? Se no, quale (o quali) delle tre è (o sono) inutile/i?
6. Per rispondere alla prima domanda, come prima cosa dobbiamo valutare il numero di cellule al tempo t0: in 100 ml di terreno ci sono 4000 cellule, dopo quanti minuti ve ne saranno 640 per ml? Per prima cosa convertiamo 4000 cellule/100 ml in 40 cellule/ml = N0. Anche in questo caso abbiamo due opportunità: una è vedere il numero di generazioni, dunque, applicare il log, poiché conosciamo il numero

iniziale (40) e finale (640) = n = log(N)-log(N0)/log2. Come seconda opportunità possiamo calcolare il numero di cellule per ogni generazione: 40 alt0, 80 alla prima generazione, 160 alla seconda, 320 alla terza, 640 alla quarta. Questo è proprio il numeroche cerchiamo. Ciò vuol dire che sono state necessarie 4 generazioni per passare da 40 cellule di partenza a640 finali; e quanto tempo sarà trascorso? Se una generazione impiega 30 minuti, per 4 generazioni il temponecessario sarà 120 minuti (30 x 40) + 80 della fase di latenza = 200 minuti.

PARAGRAFO 4: RELAZIONE TRA PARAMETRI E CRESCITASappiamo che, affinché i batteri possano crescere, èfondamentale la quantità di nutrienti e, anche se inutrienti crescono in realtà la velocità di crescita ad uncerto punto si ferma in quanto c’è una fase limitanterappresentata dai trasportatori che non potrannoconsentire un ingresso sempre crescente. Ciò

La resa, cioè la quantità di nutriente che diventa biomassa, è un parametro importante nella crescita dei batteri. Questo valore viene espresso in percentuale.

I possibili rapporti tra la crescita dei batteri e i vari parametri fisico-chimici sono:

1. Temperatura di crescita: è collegata ad un eccesso di gelificazione delle membrane. Ogni specie batterica ha un range di temperatura ottimale, in cui le reazioni hanno la massima efficienza, un minimo, in cui l'efficienza delle reazioni è molto scarsa, e un massimo teorico, in cui le proteine denaturano, perdono le interazioni interne e la membrana collassa. In base a questo, i batteri possono essere divisi in:
• Psicrofili: crescono a temperature comprese tra -5 e circa 12/13°C. Sono batteri "amici" del freddo. Un esempio è Listeria monocytogenes, che può contaminare i cibi anche quando sono conservati a basse temperature.

di formaggi) e causa lalisteriosi.

Mesofili: hanno come optimum laT° dei mammiferi, quindi, intorno a 37°C, ma hanno un range da 10 a 48°C. Oltre la T° ottimale viè una drastica diminuzione della velocità di crescita, ecco perché anche la febbre è una buonadifesa.

Termofili: optimum 60°C – range: 42-68°C

Ipertermofili blandi: optimum 88°C – range: 65-97°C

Ipertermofili estremi: optimum 106°C – range: 90-113°C

Gli ipertermofili sono batteri dotati di membrane a singolo strato. Insieme ai termofili sono di grandeinteresse medico poiché a 37°C non sono capaci di replicarsi, dunque, sono innocui per l’uomo; l’interesse èdi tipo industriale perché molti degli enzimi che producono, per definizione, attivi alle alte temperature.Inoltre, dal Thermophilus acquaticus è stata estratta