Laboratorio di microbiologia

DISINFETTANTI

1. Agenti che danneggiano la membrana

a) Surfattanti (Disinfettanti attivi sulla superficie) - Detergenti cationici

(composti d’ammonio quaternari,es.il cloruro di benzalconio). - Detergenti

anionici (sali biliari).

b) Composti fenolici ( fenolo, cresolo, difenolici, esaclorofene, clorexidina).

c) Alcoli (etanolo, alcol isopropilico, eugenolo)

2. Agenti che denaturano le proteine:

a) Acidi (benzoico, citrico, lattico, propionico)

b) Alcali (idrato di sodio, di potassio, carbonato di sodio, idrato di calce, latte

di calce)

3. Agenti che modificano i gruppi funzionali delle proteine o gli acidi nucleici:

a) Metalli pesanti (Mercurio: cloruro mercurico, metaphen, mertiolato,

mercurocromo. Argento : Sali d’argento inorganico, nitrato d’argento,

sulfadiazina.)

b) Agenti ossidanti (perossido d’idrogeno,ozono, permanganato di potassio,

alogeni, Iodio (tintura di iodio, iodofori, betadine), Cloro (ipocloriti di

calcio,sodio, cloramine).

c) Coloranti (Arancio d’acridina, Brilliant green, Verde malachite,

Cristalvioletto).

d) Agenti alchilanti (Formaldeide, Ossido di etilene,Gluteraldeide)

TERRENI DI COLTURA

In campo microbiologico è di primaria importanza coltivare i microrganismi in

condizioni controllate. Ciò è reso possibile grazie alla disponibilità di adeguati terreni

(substrati) di coltura, nei quali I microrganismo deve trovare le condizioni idonee al

proprio sviluppo.

Tutti i microrganismi esigono per la crescita I fonti di energia, di carbonio, azoto,

fosforo….essenziali per la crescita, nonche un idoneo pH. .

Le esigenze nutrizionali variano moltissimo da un gruppo microbico all’altro, l’esatta

composizione di un terreno di coltura dipende dal tipo di microrganismo che si

desidera coltivare.

Sulla base delle esigenze nutrizionali I in particolare quelle di carbonio, I

microorganismi possono essere suddivisi nei seguenti gruppi nutrizionali:

TERRENI DI COLTURA

Sono le soluzioni di nutrienti usate per far crescere i microrganismi e contengono i

nutrienti necessari per la crescita dei microrganismi. (soluzione perché i nutrienti si

sciolgono nell’acqua)

I terreni vengono classificati in base allo stato fisico, composizione e nutrizione.

I microrganismi che vivono in natura vivono in popolazioni miste ossia in comunità,

costituite da un’ampia varietà di differenti tipi di microbi. Quando questi crescono su

un terreno di laboratorio vengono chiamati colture. Il terreno di coltura deve avere i

principi nutritivi essenziali per lo sviluppo di una coltura microbica e deve fornire

condizioni ambientali adatte alla crescita, vale a dire condizioni ottimali di pH,

pressione osmotica e ossigeno atmosferico

COLTURA PURA: è costituita da una popolazione di cellule derivate tutte da un’unica

cellula madre. Si può realizzare a partire da una coltura mista, prelevando da un’unica

colonia e facendo una striscia si ottiene la coltura pura.

COLTURA MISTA: la popolazione microbica presentenel nostro ambiente è grande e

complessa. Molte differenti specie microbiche abitano normalmente in varie parti del

nostro corpo.

in base allo stato fisico il terreno può essere liquido(beker, fermentatori) o

solido(piastra, tubi)

PREPARAZIONE DEI TERRENI: i terreni possono essere acquistati già pronti oppure la

preparazione può avvenire in laboratorio con polveri che si trovano in commercio.

(autoclave può raggiungere 121° a 1 atm e il terreno di coltura deve essere lasciato

per 15 minuti a rendere il materiale sterile. Inoltre se contiene agar viene versato nella

piastra petri che a temperatura ambiente potrà solidificarsi)

- TERRENI SOLIDI: i terreni liquidi possono essere solidificati attraverso aggiunta

di AGAR, che ha le seguenti proprietà:

1. non è metabolizzabile da gran parte dei batteri

2. non manifesta alcuna tossicità

3. forma una massa solida con umidità ottimale

4. resta solido alle temperature fisiologico

5. non è alterato dalle alte temperature di sterilizzazione

6. resta liquido sino a 46°

è un polisaccaride estratto da alghe rosse, forma gel termo-reversibili. I gel

sono solidi con agar 2%, semisolidi con agar 0,3%

le caratteristiche visive dell’avvenuto accrescimento in terreno solido sono le

colonie. Una colonia è un insieme di microrganismi nati da un’unica cellula

madre, che ha dato inizio alla divisione o riproduzione cellulare. Le colonie

raggiungono un diametro che generalmente varia tra 1 e 10 mm. Una colonia

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batterica è formata da circa 10 -10 cellule, che derivano da circa 20-25

generazioni (divisioni) a partire da una cellula iniziale.

- TERRENI LIQUIDI: il terreno rimane liquido. In caso di organismi aerobi obbligati

richiedono che il substrato sia in recipienti poco profondi, che sia agitato o che

sia fornita aria.

Caratteristiche visive:

1. Intorbidamento: formazione di un opacità più o meno densa

2. Sedimento: le cellule si depositano sul fondo

3. Formazione di pellicola: una piccola quantità di cellule galleggia sulla

superficie del terreno

4. Mucosità: le cellule rimangono aggregate quando risalgono dal fondo della

provetta in seguito a movimento

5. Presenza di gas disciolto: si osservano delle bolle quando il contenuto della

provetta viene mescolato.

TIPI DI TERRENI IN BASE ALLA COMPOSIZIONE CHIMICA: vengono distinti in due grandi

gruppi in chimicamente definiti e complessi. Il terreno chimicamente definito contiene

quantità precise di sostanze organiche o inorganiche altamente purificate. Quindi non

solo conosciamo le quantità esatte dei componenti ma questi sono anche definiti

chimicamente grazie alla loro formula chimica. Un terreno complesso è un terreno che

presenta degli elementi che possiamo definire solo dal punto di vista quantitativo ma

non è noto esattamente ciò che viene inserito. (es. estratto di lievito: cellule isolate

che poi vengono lisate ed è impossibile stabilire la quantità di sostanze dal momento

che non è puro).

TIPI DI TERRENI IN BASE ALLA FUNZIONE:

- Elettivi o arricchiti: permettono la crescita di microrganismi esigenti dal punto di

vista nutrizionale, spesso arricchiti con sangue di pecora o cavallo, rosso

d’uovo, albumina o miscele di vitamine o amminoacidi. Permette in maniera

specifica la crescita di microrganismi.

- Selettivi: permette di operare una selezione microbica, permettono la crescita di

uno o più gruppi microbici ma non di altri grazie alla presenza di antibiotici,

antifungini, coloranti o sali che inibiscono alcuni microrganismi. Queste sostanze

si chiamano agenti selettivi come :

1. Cristalvioletto: inibisce i batteri gram+

2. Verde brillante: inibisce i batteri gram+ e shigella

3. Antibiotici : inibiscono la crescita di batteri, favorendo quella di lieviti o muffe

4. Antifungini: inibiscono la crescita di lieviti e muffe, favorendo quella dei

batteri

5. Cloruro di sodio: a concentrazioni elevate >3 inibisce la maggior parte dei

microorganismi esclusi gli stafilococchi. Questi sono infatti alofili e amano le

alte concentrazioni saline. (es.cicloesimide, terreno MSA)

- Terreni differenziali: è quel terreno che permette la crescita simultanea di diversi

gruppi microbici che possiamo tuttavia differenziare sulla base della morfologia,

dimensione e colore della colonia. Esempi di componenti che possono essere

aggiunte per operare la discriminazione (per distinguere una colonia dall’altra)

sono

1. Indicatori di pH (rosso fenolo, blu di bromotimolo)

2. Composti cromogenici (salmon-gel eX-gel) si usano per distinguere in piastra

escherichia coli da altri coliformi usiamo in una piastra i due agenti dal

momento che salmon-gal lega il galattosio e X-gluc che lega il glucosio che usa

escherichiacoli. Tutti gli altri usano il galattosio. In questo modo escherichiacoli

libera il colore blu del X-gluc mentre gli altri liberano il colore salmone del

Salmon-gal.

- Terreni di arricchimento selettivo: sono mezzi culturali LIQUIDI che favoriscono

la crescita di alcuni microrganismi, rallentandone quella di altri. Ci permettono

quindi di arricchire la coltura di un solo determinato microrganismo e di

arricchirne il numero. ES. rappaport vassiliadis broth: terreno liquido per

l’arricchimento selettivo di salmonella da carne e latticini, feci e acque

contaminate. È un terreno tale per cui se Salmonella c’è anche in forme

stressate, o in piccolissime quantità deve creare le condizioni favorevoli alla

riproduzione di salmonella, inibendo gli altri.

CONSERVAZIONE

I terreni (o i loro ingredienti) sotto forma disidratata possono essere conservati in

ambienti non umidi anche per alcuni anni

I terreni ricostituiti e sterilizzati devono essere conservati in frigorifero a 4°C. In

questo caso, la durata della conservazione è variabile:

- Circa 2-3 settimane per i terreni contenuti in piastre Petri

- Circa 2 mesi per i terreni contenuti in bottiglie o provette con tappo a vite

I rischi associati alla conservazione dei terreni di coltura sotto forma ricostituita sono:

l’essicamento , la degradazione degli ingredienti termolabili , la possibile

contaminazione da parte di microrganismi esterni

CRESCITA MICROBICA: i microrganismi possono crescere in termine numerico o in

termine di aumento di volume della cellula. Quando parliamo di aumento del numero

ci riferiamo a un microrganismo che va incontro a gemmazione o scissione binaria.

Quando si parla di aumento di dimensioni si parla soprattutto dei microrganismi

cenocitici (vedi muffe con ife )che hanno divisioni nucleari che non sono

accompagnate da divisioni cellulari.

Quando una cellula si separa per formare due cellule distinte, si dice che è avvenuta

una GENERAZIONE, e il tempo richiesto per questo processo è detto TEMPO DI

GENERAZIONE ➢ Durante una generazione tutte le componenti cellulari aumentano in

maniera proporzionale ➢ Ciascuna cellula figlia riceve un cromosoma e un numero

sufficiente sia di ribosomi e di altre macromolecole complese, sia di monomeri e di ioni

inorganici, in modo che possa esistere come cellula indipendente

CRESCITA DELLE POPOLAZIONI MICROBICHE: per un numero di ragioni un

microrganismo che cresce in un sistema chiuso, come una provetta o beuta, una

condizione di crescita definita coltura di Bach, non può crescere indefinitamente in

maniera esponenziale.

La curva di crescita descrive un intero ciclo di crescita che inizia con la fase di latenza,

e continua con la fase esponenziale, seguita dalla fase stazionaria e da quella di

morte.

FASE DI LATENZA: quando una popolazione microbica è inoculata in un terreno fresco,

di solito la crescita inizia dopo un periodo di tempo chiamato fase di latenza. Questo

intervallo può durare più o meno a lungo