Istologia - Introduzione ed epiteli

Introduzione all'istologia

L'istologia è la disciplina che studia i tessuti corporei. Deriva da histos, che può essere tradotto sia come tessuto sia come rete. È una scienza che coinvolge tutti gli aspetti dei tessuti biologici, focalizzandosi su come la struttura e gli arrangiamenti cellulari ottimizzino le funzioni specifiche di ciascun organo.

Un tessuto è un insieme di cellule in genere simili tra loro, e delle eventuali matrici intercellulari, che nel loro insieme costituiscono un’entità anatomicamente definibile e che cooperano per una o più funzioni in maniera integrata. In genere le cellule di un tessuto derivano da uno stesso foglietto o matrice embrionale.

Tipi di tessuto

L’istologia distingue quattro tessuti principali:

• Tessuto epiteliale: Caratterizzato da cellule a stretto contatto tra loro. Forma strati continui di rivestimento della superficie esterna e delle cavità interne del corpo. Da questi epiteli, detti di rivestimento, durante lo sviluppo embrionale, si formano strutture specializzate per la secrezione, le ghiandole, che si possono approfondare nel tessuto connettivo sottostante dell’epitelio.
• Tessuto muscolare: Formato da cellule allungate, dette fibre muscolari, contenenti complesse strutture plurimolecolari capaci di contrazione e quindi permettere il movimento dell’intero corpo e dei suoi organi viscerali.
• Tessuto connettivo: Formato da cellule sparse in un’abbondante matrice intercellulare, che appare senza strutture di livello di risoluzione del microscopio ottico, ma in cui possono organizzarsi fibre proteiche di varia natura e funzione.
• Tessuto nervoso: Formato da cellule fornite di lunghi prolungamenti che le collegano tra loro in circuiti di enorme complessità. Lungo questi prolungamenti scorrono segnali detti impulsi nervosi. Le cellule nervose, dette neuroni, insieme con una molteplicità di cellule accessorie, costituiscono il sistema nervoso centrale (SNC).

Modelli di studio di cellule e tessuti

Biochimico

• Può valutare il contenuto di cellule, ma si hanno comunque lacune morfologiche, perché non so dove sono site le cose.
• Studia le componenti chimiche.
• Dà informazioni sui rapporti qualitativi e quantitativi.
• Non dà informazioni sulle cellule.

Morfologico

• Fornisce maggiori dettagli con i microscopi elettrici.
• Osservazione diretta di cellule e tessuti viventi.
• Osservazioni di preparati standard.

Osservazione diretta di cellule viventi

È un metodo che permette di osservare i tessuti a fresco (tessuti non sottoposti a nessun tipo di trattamento che ne determini la stabilizzazione). Questo metodo presenta alcune limitazioni, quali scarso contrasto, totale trasparenza se non viene effettuata la colorazione, ridotta visualizzazione al microscopio luce dei tessuti per il loro spessore, durata limitata, poiché i tessuti o le singole cellule vanno facilmente incontro ad autolisi.

Osservazione di preparati a fresco

L'osservazione di preparati a fresco può essere condotta utilizzando stereomicroscopio, microscopio invertito, microscopio a contrasto di fase. In alcuni casi può essere anche sfruttata l’autofluorescenza di alcune strutture biologiche che, se osservate al microscopio a fluorescenza, possono essere facilmente individuate, mentre altre strutture cellulari acquisiscono fluorescenza solo se trattate. I tessuti osservati a fresco, durante l’osservazione, devono essere immersi in una idonea soluzione, in modo da non alterarne la struttura ed evitare l’essicazione. Per questo si ricorre all’uso di soluzioni fisiologiche, soluzioni saline isotoniche contenenti ioni come Mg e Ca in concentrazioni opportune.

I globuli rossi

• Tendono ad ammassarsi;
• Se devono passare nei capillari tendono a deformarsi;
• Scorrono.

Colture cellulari/tissutali/embrionali

Procedimento per le colture embrionali, con le quali posso vedere quale effetto potrebbe avere un determinato farmaco:

• Prelievo delle cellule embrionali;
• Dopo la creazione di un ambiente sterile, deposizione delle cellule su un vetrino;
• Trasferimento su un vetrino con concavità;
• Osservazione.

Procedimento per colture di cellule tissutali, con cui, per esempio, è possibile coltivare del tessuto per un'ustione:

• Prelievo delle cellule dagli organismi;
• Ripristino della temperatura, del pH e delle condizioni tipiche dell’organismo;
• Separazione mediante enzimi.

Studio delle linee cellulari

Le cellule, in generale, vanno incontro alla morte; tuttavia, in laboratorio, esiste la possibilità di coltivare cellule neoplastiche, che sono linee cellulari di cui è possibile controllare crescita e sviluppo. Le cellule vive sono visibili al microscopio a contrasto di fase; le nostre cellule sono composte per l’80% di acqua. NB: Solo con contrasto di fase.

Lo scarso contrasto dovuto alla trasparenza delle cellule può essere risolto utilizzando particolari coloranti, detti vitali, che hanno la proprietà di essere assorbiti dalle cellule viventi senza risultare eccessivamente tossici e quindi colorarne le strutture rendendole visibili. Questo tipo di colorazione si adatta a quei tipi di cellule, spesso contenenti i vacuoli, in cui si concentra il colorante (cellula ad attività granulopessica) o anche per colorazioni in toto in embrioni in sviluppo.

È importante tener presente che solo frammenti molto sottili di tessuto ed organo o cellule isolate possono essere mantenute vive per breve tempo durante l’osservazione.

Colorazione vitale e sopravitale

I coloranti vitali, iniettati nell’animale intero, raggiungono i tessuti tramite la circolazione colorandoli. In questo caso si parla di colorazione vitale o intra vitam. Si parla di colorazione sopravitale quando un pezzo di tessuto od organo appena prelevato dall’animale viene immerso nella soluzione colorante.

Preparati stabili

La seconda possibilità che si ha per svolgere delle indagini morfologiche è quella di osservare dei preparati stabili, che possono essere visti al microscopio luce o ottico, da cui saranno ricavabili alcune informazioni. Poiché di solito i tessuti e gli organi sono troppo spessi per essere attraversati da un fascio di luce, sono state messe a punto varie tecniche che consentono di ottenere sezioni sottili e traslucide che sono depositate su vetrini prima di essere esaminate, questo procedimento è detto allestimento dei vetrini istologici. Trattandoli così sarà possibile osservare il tutto con microscopi elettronici a trasmissione o a scansione, microscopi estremamente complessi, in grado di dare informazione ultrastrutturale.

Fasi fondamentali per ottenere preparati stabili

1. Prelievo del tessuto: Il tessuto prelevato deve avere dimensioni ragionevoli per poter passare poi a fasi successive.
2. Fissazione: È necessaria per ottenere preparati istologici permanenti. Per funzionare richiede fissanti chimici o fisici e deve essere svolta immediatamente dopo il prelievo, in tal modo svolge la sua funzione, che è di evitare quelle trasformazioni post mortem che avvengono normalmente nella cellula. Tra queste trasformazioni si può avere la rottura dei lisosomi o vescicole idrolasiche, che provoca la digestione della cellula, che si autodigerisce a pH acido e, se tutto ciò avviene, si ha l’alterazione del preparato rispetto a quella reale; altre alterazioni post mortem sono quelle provocate da batteri putrefattivi o da quelli che si possono trovare nell’ambiente e da muffe.

È allora necessario preservare la struttura del protoplasma (cioè la materia vivente), in modo tale che sia il più vicino possibile alla realtà e, per farlo, si utilizza appunto un fissante chimico o fisico che, oltre a essere incompatibile con la vita, è in grado di immobilizzare ciò che c’è nella cellula e di rendere le strutture molto resistenti a tutti quegli stress (chimici, causati da prodotti impiegati e fisici, come il taglio, che è uno stress meccanico) a cui sarà sottoposto il campione nelle fasi successive.

È bene sapere che esistono anche fissazioni meno drastiche, in grado di garantire ancora l’efficacia di alcuni enzimi; tuttavia questo tipo di fissazione è impiegato solo per indagini ben precise.

Fissazioni di tipo fisico

• La fissazione più facile da realizzare, ma non è applicabile a tutti i tessuti.
• Fissazione ottenuta per congelamento (in azoto liquido, -170°) è una fissazione che blocca di per sé le attività vitali della cellula, ma impedisce la formazione di cristalli, che romperebbero la cellula. Il campione ottenuto per congelamento è un campione adatto a indagini immuno-istochimiche, nelle quali si ricercano enzimi o marker tumorali dal momento che, essendo una fissazione dovuta a un processo chimico, alcune funzionalità della cellula non sono state eliminate.

Il tessuto congelato viene sezionato nel criostato, una macchina per sezionare che possiede un impianto di raffreddamento al suo interno, in modo tale da prevenire lo scioglimento. Vantaggio: ha tempi di risposte molto brevi, poche decine di minuti. Svantaggio: la morfologia non viene preservata al 100%.

Fissazione ottenuta per essicamento e colorazione

È un tipo di fissazione per cellule separate tra loro e per questo, per esempio, è applicabile anche agli spirati bronchiali. È un metodo utilizzabile, per esempio, sul sangue. Viene prelevata una goccia di sangue, è fatta strisciare su di un vetrino e viene poi stemperata con l’utilizzo di un secondo vetrino; in questo modo gli elementi corpuscolati non saranno più ammassati come nella goccia, bensì saranno ben spansi sul vetrino. Dopo ciò, il tutto è banalmente fatto asciugare all’aria o passato leggermente vicino a una fiamma ed è, in un secondo momento, colorato tramite immersione in miscele di coloranti e fatto nuovamente asciugare per essere osservato al microscopio ottico. (NB: il sangue non è sezionabile, così come derivati da lavaggi bronchiali, liquidi pleurici, peritoneali e pericardici, materiale ottenuto per ago-aspirazione.)

L’allestimento del preparato può, oppure, avvenire per apposizione, ovvero premendo il vetrino portaoggetto sulla superficie del tessuto fresco (come masse tumorali o tessuti bioptici); c’è poi la tecnica dei preparati per erosione che si applica a campioni di tessuto osseo compatto non decalcificato che, dopo essere stato tagliato, viene assottigliato mediante abrasione con un disco rotante di carta smeriglio.

Al microscopio sarà possibile osservare i globuli rossi, che sono sprovvisti di nucleo e sarà possibile vedere che hanno una porzione più chiara al loro interno. Sarà possibile individuare poi elementi più piccoli, le piastrine, elementi provvisti di nucleo ed elementi sprovvisti di nucleo. Altre caratteristiche emergeranno dalla cinematografia. Far essiccare significa quindi uccidere le cellule. Una volta essiccato il campione viene poi applicata una colorazione.

Fissazione di tipo chimico

Viene effettuata tramite sostanze chimiche, che uccidono il preparato e che sono pericolose e/o tossiche per chi le utilizza. Esistono varie possibilità, nelle quali si hanno contemporaneamente dei vantaggi e degli svantaggi e la scelta viene fatta in base a ciò che si sta cercando.

Fissativi coagulanti

• Sono rapidi; vengono utilizzati qualora bisogna impedire processi putrefattivi o paralizzare la situazione in un certo stato.
• Si utilizzano: alcol etilico, alcol acetico, acido picrico.
• Sono rapidi, ma hanno lo svantaggio di portare alla precipitazione delle proteine e, quando questo avviene, significa che si è agito sulla loro struttura a loro sfavore.

Fissativi non coagulanti

• Sono quelli più tossici.
• Comprendono la famiglia delle aldeidi, tra cui l’aldeide formica, da cui deriva la formalina, una soluzione isotonica tamponata di formaldeide al 37%, ed è comunemente utilizzata per conservare i tessuti e gli organi proprio come la gluteraldeide o aldeide glutarrica. Entrambe reagiscono con i gruppi amminici (NH₂) delle proteine dei tessuti.

Si ha poi il tetrossido di osmio o acido osmico, un fissativo utilizzato per una seconda fissazione, che ha la caratteristica di far precipitare in maniera molto fine le proteine, conservando quindi la struttura delle cellule. È in grado di preservare e colorare i lipidi e le proteine; tuttavia ha però il problema di non riuscire a penetrare nei tessuti in quanto entra molto lentamente.

È utilizzato per la microscopia elettronica, che utilizza campioni di tessuto nell’ordine di 0,5 mm, mentre per altri campioni, come l’intestino, possono impiegare 2-3 cm. La fissazione di tipo chimico è di due tipi:

• Fissazione per immersione: È svolta su tessuti precedentemente prelevati.
• Fissazione per perfusione: È svolta in modo tale da iniettare in vena il fissativo, passando attraverso il cuore, che, battendo, distribuisce il fissativo in tutto l’organismo; in tal caso l’animale sotto anestesia muore in quanto il sangue è gradualmente sostituito dal fissativo. Da questo tipo di fissazione sono ottenuti i migliori preparati, ma è una tecnica poco usata.

Disidratazione e diafanizzazione

Per poter utilizzare i mezzi di inclusione è necessario disidratare i campioni; per farlo l’acqua viene tolta tramite immersione in acqua e alcoli, come l’etanolo, in percentuale diversa, da un 70% fino al massimo di 100% (alcol assoluto). Man mano che i campioni vengono impregnati di solvente, diventano di solito trasparenti (diafanizzazione).

Inclusione

Una volta che il tessuto è stato impregnato di solvente è posto in paraffina fusa dentro una stufa, tipicamente 52-60°, che penetra nel campione gradualmente e, una volta raffreddato il tutto è possibile sezionare il campione. La paraffina è la comune cera, ed è una sostanza liquida ad alte temperature e solida a basse temperature.

Si possono utilizzare, al posto della paraffina, anche delle resine plastiche. In questo caso i campioni vengono sempre disidratati in soluzioni di etanolo e poi infiltrati con solventi plastici. L’etanolo o i solventi sono in seguito sostituiti da soluzioni plastiche indurite mediante l’aggiunta di agenti polimerizzanti che formano legami trasversali (cross-linking) tra molecole diverse. L’inclusione in materiale plastico evita l’effetto restringente delle temperature elevate richieste dall’inclusione in paraffina e comporta una piccola o nessuna distorsione delle cellule.

Il terzo mezzo di inclusione utilizzabile è la celloidina.

Taglio

I blocchetti induriti contenenti i tessuti sono qui di montati su uno strumento chiamato microtomo, una piccola affettatrice con piccola lama a manovella, che a ogni giro imposta uno spessore prestabilito. Lo spessore impostato è di 3-10 micrometri, che è quello necessario alla luce per attraversare il campione.

Un modo alternativo per preparare le sezioni di tessuto è sottoporre i campioni a congelamento rapido; nell’eventualità di questo metodo i tessuto sono fissati dal freddo e nello stesso tempo si induriscono, pronti per essere sezionati. Per attuare questo metodo si utilizza un microtomo congelatore, il criostato.

Colorazione

Poiché la maggior parte dei tessuti è incolore, le sezioni necessitano di essere colorate per poter essere studiate al microscopio, pertanto sono stati messi a punto molteplici metodi di colorazione, che hanno lo scopo di rendere ben visibili e distinguibili i campioni. La microscopia ottica comprende una vasta gamma di coloranti e sono utilizzati quasi tutti in soluzione acquosa ma, avendo a questo punto del procedimento la paraffina nel campione, è necessario rimuoverla; per farlo la sezione viene appoggiata su un vetrino precedentemente trattato che è in grado di far restare la sezione incollatavi sopra. Viene poi immerso in un contenitore dove c’è il solvente della paraffina, lo xilolo, che la fa allontanare.

La cellula deve essere reidratata e per farlo vengono riutilizzati gli alcoli più acquosi. Una volta reidratato il campione, vengono utilizzati i coloranti, che sono in grado, per la maggior parte, di formare legami elettrostatici (salini) ben saldi nelle strutture cellulari con i radicali ionizzabili dei tessuti. I componenti tissutali con una carica negativa, detti anionici, si colorano più facilmente con coloranti basici e sono chiamati basofili; i componenti cationici, invece, mostrano un’affinità per i coloranti acidi e sono denominati acidofili.

Coloranti utilizzabili

• Coloranti naturali: Rosso carminio (ottenuto dalle cocciniglie) e ematossilina (ottenuta da un albero).
• Coloranti artificiali: Sono molti di più e si legano in maniera stabile ai costituenti della cellula.

La colorazione tende a formare una sorta di sale, che fa legami elettrostatici/salini con le strutture cellulari, che saranno allora acidofile o basofile. Un esempio di struttura acidofila è la componente intercellulare. Un esempio di struttura basofila sono gli acidi nucleici. Normalmente quindi vengono utilizzate miscele di colorante acido-base, in modo tale che tutto si colori. Coloranti acidi sono l’alizarina, il blu pirrolo. Coloranti basici sono il blu di metilene, l’ematossilina, l’azzurro B, il blu di toluidina. Coloranti neutri sono il rosso neutro e il verde janus.

Esistono poi i mordenzanti, che agiscono da intermediari tra il colorante e il tessuto. La maggior parte di mordenzanti impiegati nelle tecniche istologiche sono ioni metallici e/o ossidanti, come l’acido cromico. La miscela di due coloranti più utilizzata è quella di ematossilina (basica) e eosina (acida) (E&E): è una miscela che permette di colorare il nucleo di rosso/viola/bordeaux; il citoplasma invece è rosa chiaro, così come la sostanza intercellulare.