Istologia

Allestimento preparati istologici

L'allestimento di un preparato istologico è un processo che richiede diversi passaggi:

Raccolta del materiale

Fissazione

È un procedimento che permette di bloccare l'autolisi cellulare, inattivando gli enzimi autolisanti, preservando così nel tempo la morfologia del tessuto o dell'organo in questione. La fissazione può essere:

• Fissazione chimica: prevede l'impiego di agenti stabilizzanti in grado di instaurare legami trasversali tra le proteine. Il tessuto viene tagliato in piccoli frammenti per facilitare la penetrazione del fissativo; se invece si vuole preservare l'organo integro si procede per perfusione, in modo tale che il circolo sanguigno dell'animale porti il fissativo a tutte le cellule. I fissativi chimici si dividono in:
  • Fissativi che coagulano le proteine (es: alcool etilico, acido acetico)
  • Fissativi che non coagulano le proteine.
• Fissazione fisica: ad esempio il congelamento in azoto liquido (-170°C).

In generale i fissativi possono essere semplici o miscela, coagulanti o gelificanti.

Disidratazione

La rimozione dell'acqua è necessaria per una buona osservazione del campione. La disidratazione si realizza immergendo il campione in una soluzione alcolica a concentrazione crescente: si parte da etanolo al 50% e si conclude con etanolo al 100%. Il processo deve essere graduale per evitare il raggrinzimento delle cellule.

Successivamente il campione viene immerso nello xilolo, un solvente organico diafanizzante (decolora) che rende il tessuto trasparente.

Inclusione

L'inclusione è un processo che permette al tessuto di ottenere la giusta consistenza per poi essere tagliato. Il mezzo di inclusione usato è la paraffina fusa, una miscela di idrocarburi saturi che diventa fluida quando viene riscaldata in stufa a 60°C e solidifica a temperatura ambiente. Una volta che il campione viene immerso in paraffina fusa, essa viene fatta solidificare a temperatura ambiente e il campione è pronto per essere tagliato in sezioni dallo spessore di 5-10 μm.

Taglio

Il taglio viene realizzato con uno strumento chiamato microtomo. Esso è dotato di una lama e di un braccio al quale viene fissato il blocchetto di paraffina contenente il campione. Successivamente al taglio, le sezioni vengono trasferite sul vetrino portaoggetti e fatte asciugare prima di passare alla colorazione.

I campioni sottoposti a fissazione fisica vengono tagliati con l'utilizzo del microtomo congelatore. Alcuni campioni istologici non richiedono l'inclusione e il taglio: un esempio è il sangue, il cui vetrino si ottiene utilizzando la tecnica a striscio.

Colorazione

La colorazione viene svolta attraverso l'aggiunta di coloranti, cioè sostanze chimiche che si legano a componenti cellulari/tessutali aumentandone il contrasto. Prima di aggiungere il colorante però il campione deve subire una serie di passaggi preliminari:

• Eliminare il mezzo di inclusione (paraffina) che potrebbe interferire con la colorazione: basta immergere il vetrino nello xilolo.
• Eliminare lo xilolo immergendo le sezioni in etanolo assoluto.
• Le sezioni vengono gradualmente idratate immergendole in una serie di alcoli a concentrazione decrescente fino ad arrivare all'acqua.

Infine, la sezione viene immersa nel colorante. I coloranti vengono suddivisi in:

• Coloranti acidi o acidofili (es: eosina)
• Coloranti basici o basofili (es: ematossilina)
• Coloranti neutri
• Mordenzanti

Ematossilina-eosina è una delle colorazioni più usate. Prevede l'uso di:

• Ematossilina basico, colora i nuclei in violetto
• Eosina acido, colora il citoplasma in rosa

Montaggio

Si procede poi al montaggio del vetrino. Il montaggio consiste nell'applicare sopra la sezione un vetrino coprioggetto, il quale viene fatto aderire tramite una resina sintetica non miscibile in acqua. Prima però il campione deve essere nuovamente disidratato (stesso procedimento di prima - vedi punto 3).

Osservazione al microscopio

Due tipi di microscopio:

• Microscopio ottico (a luce)
• Microscopio elettronico (fasci di elettroni)

Tessuti epiteliali

Caratteristiche tessuti epiteliali

• Cellule a mutuo contatto
• Poggiano sulla membrana basale
• Assenza di vascolarizzazione, presenza di terminazioni nervose. Dato che è assente la vascolarizzazione, gli epiteli sono associati a un tessuto connettivo che provvede al loro nutrimento, tramite la diffusione delle sostanze nutritive contenute nei capillari sanguigni (contenuti del tessuto connettivo).
• Dotati di attività mitotica
• Numerose giunzioni intercellulari come barriera e resistenza meccanica.

Funzioni dei tessuti epiteliali

• Rivestimento della superficie esterna e cavità interne
• Scambi metabolici (secrezione, escrezione, assorbimento)
• Scambi gassosi
• Ricezione di stimoli
• Protezione da disidratazione, danni meccanici e fisici.

Classificazione degli epiteli

In base alla funzione:

• Epiteli di rivestimento: della cute, delle tonache mucose, delle membrane sierose e dei vasi sanguigni e linfatici (endoteliali).
• Epiteli ghiandolari o secernenti: costituiscono il parenchima delle ghiandole esocrine ed endocrine.

In base alla forma delle cellule:

• Pavimentoso: cellule appiattite, nucleo schiacciato.
• Cubico: cellule cubiche, nucleo tondo e al centro.
• Cilindrico: cellule più allungate, nucleo ovale e posto nella zona basale (verso il basso). Per riconoscere gli epiteli in base alla forma delle cellule, guardo la forma del nucleo!

In base al numero di strati di cellule:

• Semplice o monostratificato: formato da un singolo strato di cellule
• Composto o pluristratificato: con 2 o più strati di cellule (un solo strato di cellule poggia sulla membrana basale).
• Pseudostratificato: si tratta di una modificazione dell'epitelio semplice. Le cellule sono di diverse altezze e non tutte raggiungono la superficie libera, i nuclei appaiono a diverse altezze, ma tutte le cellule poggiano sulla membrana basale.
• Di transizione: si tratta di una modificazione dell'epitelio pluristratificato.

Epitelio semplice

L'epitelio semplice si differenzia in:

• Epitelio pavimentoso semplice: idoneo a svolgere funzioni di filtrazione, diffusione e scambio.
  • Alveoli polmonari
  • Foglietto parietale della Capsula di Bowman
  • Segmento sottile dell'ansa di Henle
  • Labirinto membranoso e superficie interna della membrana del timpano (orecchio)
  • Superficie posteriore della cornea
  • Testicoli (rete testis)
  • Mesotelio (costituisce le tonache sierose che rivestono cavità pleurica, peritoneale e pericardica)
  • Endotelio (riveste il lume dei vasi sanguigni e linfatici)
• Epitelio cubico semplice
  • Superficie dell'ovaio (va a costituire l'epitelio germinativo)
  • Alcuni tratti del nefrone, nei dotti collettori del rene
  • Nei dotti escretori delle ghiandole esocrine
  • Bronchioli respiratori
  • Tiroide (parete follicolare)
  • Retina (epitelio pigmentato)
  • Alcuni tratti dell'apparato genitale maschile.
• Epitelio cilindrico semplice è il più diffuso
  • Cigliato: funzione di trasporto di particelle sulla sua superficie grazie alla presenza di ciglia vibratili poste sulla superficie apicale delle cellule.
  • Con microvilli: funzione assorbente.
  • Assenza di ciglia o microvilli

Dove si localizza:

• Tratti del tubo digerente: nell'intestino tenue presenta microvilli, che aiutano nella funzione di assorbimento.
• Parete della cistifellea
• Nei dotti escretori delle ghiandole esocrine
• Nei bronchi: in alcuni tratti dell'albero respiratorio è cigliato (ciliato nei Mammiferi, non ciliato negli Uccelli).
• Tuba uterina: cigliato
• Utero: cigliato.

Epitelio pseudostratificato

Questo epitelio si trova in:

• Mucose respiratorie (laringe, faringe, trachea, bronchi): cigliato
• Uretra maschile e dotto deferente (con stereociglia)
• Epididimo (con stereociglia)
• Grossi condotti escretori ghiandolari: non cigliato.

Epiteli composti

Possiedono diversi strati di cellule di varia forma:

• Cubiche o cilindriche allo strato basale
• Poliedriche nello strato intermedio
• Variabile a seconda del tipo di epitelio nello strato più esterno: la classificazione di un epitelio pluristratificato si basa solo sullo strato più superficiale (in base al tipo di cellule da cui è costituito).

Gli strati più profondi presentano un'intensa attività proliferativa che diminuisce fino a scomparire negli strati più superficiali.

Epitelio pavimentoso pluristratificato

Presenta creste epiteliali, che spingono nel tessuto connettivo sottostante, e papille connettivali. Funzione: aumentare la superficie di scambio tra epitelio e tessuto connettivo.

• Epitelio pavimentoso pluristratificato non cheratinizzato
  • Cornea
  • Cavità orale (labbro, lingua)
  • Laringe, faringe ed esofago
  • Vagina
  • Retto
  • Uretra.
• Epitelio pavimentoso pluristratificato cheratinizzato
  • Epidermide della cute.
• Epitelio cilindrico e cubico pluristratificato: quello cubico è raro nell'uomo
  • Mucosa della faringe
  • Congiuntiva dell'occhio
  • Uretra maschile
  • Condotti escretori ghiandolari voluminosi
  • Mucosa della laringe: può essere provvisto di ciglia
  • Mucosa della faccia posteriore dell'epiglottide: può essere provvisto di ciglia.

Epitelio di transizione

Le cellule di questo epitelio sono organizzate in più strati:

• Cellule a cupola: superficie. Spesso sono binucleate.
• Cellule piriformi (o clavate): intermedie
• Cellule cubiche: strato basale.

L'epitelio di transizione si trova in vescica e uretere. Come cambia la morfologia delle cellule nell'epitelio di transizione. Ci sono due casi:

1. Organo rilassato: l'epitelio è più alto e presenta cellule cubiche nello strato basale, di forma clavatanello strato intermedio e a cupola nello strato superficiale.
2. Organo in tensione: numero di strati diminuisce, organo meno spesso. Cellule cubiche nello strato basale, poliedriche nello strato intermedio e appiattite nello strato superficiale. Le cellule superficiali sono distese e possono ricoprire anche 3-4 cellule dello strato sottostante.

Cute

L'epidermide della cute è costituita da epitelio pavimento pluristratificato corneificato (cheratinizzato). L'epidermide ha lo spessore di circa 50 micron, ma può raggiungere lo spessore di 2 mm sul palmo delle mani e sulla pianta dei piedi. È costituita da 5 strati:

1. Strato germinativo (basale): formato da cellule di forma cubica o cilindrica. Chiamato "germinativo" poiché possiede cheratinociti, cellule responsabili del rinnovamento continuo dell'epidermide.
2. Strato spinoso: formato da 4-8 strati di cellule poliedriche unite da desmosomi. Qui i cheratinociti sintetizzano l'involucrina, ovvero una proteina che contribuisce alla formazione dell'involucro cellulare cheratinizzato.
3. Strato granuloso: formato da 3-6 strati di cellule ricche di granulazioni, dette granuli di cheratoialina. Contengono filaggrina, una proteina che favorisce l'aggregazione dei filamenti di cheratina in fasci paralleli fra loro. Contengono anche la proteina loricrina, che contribuisce alla formazione dell'involucro cellulare corneificato (sul lato citoplasmatico della membrana cellulare).
4. Strato lucido: formato da 1-2 strati di cellule con membrana cellulare ispessita e prive di organuli. È presente SOLO su palmo della mano e pianta del piede.
5. Strato corneo: formato da cellule pavimentose corneificate, cioè trasformate in lamelle cornee. Non contengono nucleo e non contengono organuli; il citoplasma è ripieno di filamenti di cheratina + involucri, filaggrina e loricrina. Questo strato svolge la funzione di protezione contro stimoli meccanici e chimici, contro agenti patogeni e funzione di termoregolazione.

La cute è formata da diversi tipi di cellule:

• Cheratinociti: nello strato basale sono responsabili del rinnovamento continuo dell'epidermide.
• Melanociti: responsabili della pigmentazione cutanea.
• Cellule di Langerhans: coinvolte nella risposta immunitaria.
• Cellule di Merkel: recettori sensitivi.

Caratteristiche citologiche delle cellule epiteliali

Le cellule epiteliali sono polarizzate, poiché è possibile distinguere:

• Versante apicale: guarda verso la superficie libera.
• Versante basale: rivolto verso la lamina basale.

La polarità è riferita anche al posizionamento degli organuli e del nucleo. Le cellule epiteliali si differenziano in base alle specializzazioni:

• Specializzazioni apicali
  • Microvilli: estroflessioni citoplasmatiche digitiformi, lunghezza 1-2 micrometri, rivestite dalla membrana citoplasmatica. Sono molto vicini tra loro e formano l'orletto a spazzola. Presenti sugli epiteli cilindrici con funzione assorbente, epitelio intestinale ed epitelio renale.
  • Ciglia vibratili: estroflessioni, lunghezza 5-10 micrometri, contengono l'assonema (=struttura costituita da microtubuli) che consente loro di muoversi con movimento oscillatorio. Ricoprono gli epiteli delle vie genitali femminili e delle vie respiratorie.
  • Stereociglia: estroflessioni citoplasmatiche, lunghezza 30 micrometri, sottili e irregolari. Si trovano su cellule definite cellule a pennacchio. Presenti sull’epitelio che riveste l’epididimo, coinvolte in funzioni di secrezione e riassorbimento.
• Specializzazioni laterali: sono le giunzioni cellulari. In base alla funzione svolta si differenziano in 3 tipi:
  • Giunzioni occludenti: sigillano gli spazi tra le cellule adiacenti mediante punti di fusione della membrana plasmatica, estese lungo l’intero perimetro cellulare (zone occludenti).
  • Giunzioni ancoranti (o aderenti): consentono il mantenimento dell’adesività intercellulare grazie alla presenza di proteine transmembrana. Il dominio extracellulare permette l’ancoraggio di 2 cellule contigue; il dominio intracellulare si rapporta con il citoscheletro. Possono percorrere l’intero perimetro cellulare con una disposizione “a cintura” formando la zona aderente, oppure possono distribuirsi in alcuni punti precisi formando il desmosoma.
  • Giunzioni comunicanti: consentono l’adesione e il passaggio di ioni e piccole molecole tra cellule adiacenti solo in alcuni punti, dette gap junctions.

Tessuto connettivo

Il tessuto connettivo si divide in:

• Tessuto connettivo propriamente detto:
  • Tessuto connettivo fibrillare lasso (es. tonaca sottomucosa di organi cavi).
  • Tessuto connettivo fibrillare denso: può essere a fasci paralleli (es. in tendini e legamenti) o a fasci intrecciati (es. nel derma profondo).
  • Tessuto connettivo reticolare (es. stroma della milza).
  • Tessuto connettivo elastico (es. parete dell'aorta).
  • Tessuto adiposo: può essere primario (bruno) o secondario (bianco).
• Tessuto connettivale di sostegno:
  • Cartilagineo
  • Osseo
• Tessuto connettivale a funzione trofica:
  • Sangue
  • Linfa

Funzione

Tessuto a funzione trofo-meccanica:

• Funzione di sostegno, connessione e protezione di altri tessuti od organi
• Funzione trofica
• Funzione di difesa
• Funzione di accumulo (lipidi energetici)
• Funzione di isolamento termico e produzione di calore

Composizione

1. Cellule
2. Sostanza intercellulare o matrice extracellulare:
   • Fibre: collagene, reticolari, elastiche.
   • Sostanza amorfa o sostanza fondamentale.

Cellule

• Fibroblasti/fibrociti: sono lo stesso tipo cellulare, ma i fibroblasti rappresentano le cellule giovani e attive, mentre i fibrociti costituiscono la forma adulta e matura. Sono cellule fisse, fusiformi, prive di attività fagocitaria, capaci di produrre i costituenti macromolecolari delle fibre.