Fermentazioni industriali

FERMENTAZIONI INDUSTRIALI

INTRO

- L’uomo ha sfruttato la capacità fermentativa dei microrganismi da migliaia di anni

- La prima applicazione, come bevanda alcolica, risale ai Sumeri circa 6000 anni A.C

- Sono state trovate indicazioni che già gli egiziani usassero lieviti per la produzione di pane

Ha avuto così inizio lo sviluppo delle applicazioni della biotecnologia fino ai moderni processi industriali.

Il termine biotecnologia deriva da due sostantivi: biologia e tecnologia

- il primo: studio e conoscenza degli esseri viventi e delle leggi che li governano

- il secondo: applicazione e uso di strumenti tecnici applicabili per la soluzione di problemi pratici e per

l’ottimizzazione di procedure per la produzione di beni e servizi

I moderni processi microbiologici sono basati sulle biotecnologie applicate ai microrganismi ed ai parametri di

processo.

Il termine di biotecnologia identifica una scienza interdisciplinare; coinvolge molti campi della ricerca:

microbiologica, biochimica, biologia molecolare, biologia cellulare, immunologia, ingegneria delle proteine,

enzimologia, tecnologie dei bioprocessi. Può essere applicata in molti settori: alimentare, agricolo, ambientale,

diagnostico ecc.

Per biotecnologia si intendono tutti gli impieghi di sistemi biologici costituiti da singole cellule e loro componenti

per ottenere beni o servizi (depurazione, biorisanamento ecc.).

In funzione delle applicazioni distinguiamo tipologie differenti.

Biotecnologia rossa: processi biomedici e farmaceutici.

Esempi:

- individuazione di organismi in grado di sintetizzare molecole ad attività farmacologica

• statine: molecole ad attività anticolesterolemica; vengono prodotte da funghi (Aspergillus o Monascus

purpureo che è rosso); Il riso rosso è fermentato con una muffa che ha un pigmento rosso.

• insulina: è stata inserita l’informazione per ricavare l’insulina in Escherichia coli;

• antibiotici

- sviluppo di tecnologie di ingegneria genetica per la cura di patologie

editing genetico: si cercano quali sono i geni coinvolti per alcune patologie e si cerca di capire se si possono

applicare delle tecniche di editing, ovvero sostituzione di geni mutati coinvolti in patologie.

Biotecnologia bianca: processi biotecnologici di interesse industriale.

Microrganismi in grado di produrre composti e/o enzimi per specifiche reazioni in competizione con i processi

chimici tradizionali; i costi sono generalmente inferiori e si ha un minor impatto ambientale rispetto al processo

tradizionale.

Esempi:

- processi che utilizzano enzimi per la decolorazione dei jeans

- nei mangimi degli animali spesso sono presenti delle cellulasi, amilasi ecc. perché aumentano il valore

nutrizionale, ovvero scompongono in glucosio dei componenti difficili da digerire

La produzione di enzimi è un settore trainante delle biotecnologie bianche, in quanto il fatturato annuo, tra i vari

comparti industriali, risultato il più alto.

Biotecnologia verde: agricoltura-ambiente.

Tutte le applicazioni collegate all’agricoltura, come la sintesi di biofertilizzanti e bio-fitofarmaci in grado di limitare

l’impatto sull’ambiente senza ridurre la propria efficacia oppure viene utilizzata per produrre soluzioni agricole con

minor impatto ambientale rispetto ai processi agricoli classici.

Esempio: piante ingegnerizzate in grado di produrre pesticidi, eliminando la necessità di somministrazione esterna

(esempio: mais BT – tossina B. thuringiensis) ampio dibattito sull’eco-compatibilità di questi processi e sulla

à

sicurezza di impiego in agricoltura di organismi geneticamente modificati (OGM).

Biotecnologia blu: applicazioni in campo marino. Esso mira allo sviluppo di processi che prevedono l’impiego di

organismi acquatici, quindi batteri o organismi viventi che vivono in habitat marini.

Sulla base delle procedure impiegate possiamo distinguere:

- biotecnologie tradizionali: tecnologie produttive utilizzate da millenni nei settori alimentare, agricolo e

zootecnico; vi è lo sfruttamento delle attività fermentative dei microrganismi. Riguardano prodotti in cui vengono

da sempre maggiormente sfruttate le attività fermentative.

- biotecnologie innovative: sono quelle che hanno il focus sulla manipolazione dell’informazione genica (DNA,

RNA); numerose applicazioni in ricerca scientifica e settori industriali. Le innovazioni in questo settore possono

essere utilizzare anche in processi tradizionali; esempio: produzione di prodotti in cui è possibile impiegare

ceppi di microrganismi geneticamente modificati.

Prodotti ottenibili su scala industriale, in ambiti diversi: industria alimentare, chimica, produzione di enzimi,

farmaceutico, biorisanamento, ingegneria, energie alternative, agraria, tecnologie fermentative e medicina.

L’introduzione di organismi geneticamente modificati (in particolare nel settore agroalimentare) ha creato spesso

forti attriti all’interno dell’opinione pubblica di molti paesi.

I diversi aspetti:

- in che quantità devo avere i nutritili e l’inoculo? quantità e qualità

- quanto tempo mi servirà?

- di che impianto ho bisogno? il tipo di reattore, di agitazione e di aerazione ecc.

- come posso risparmiare energia? bisogna ottimizzare tutte le risorse

- quanto prodotto otterrò? si parla di aziende quindi di profitto; il processo deve essere economicamente

sostenibile

Sviluppi possibili

- Dall’attività di ricerca in funzione delle richieste del sistema produttivo

- con il coinvolgimento delle imprese progettazione e realizzazione dell’innovazione

à

- creazione di condizioni favorevoli per gli investimenti industriali nei settori emergenti

Situazione attuale: processi biotecnologici e chimici

Processi chimici Zona di competizione Processi biotecnologici

petrolio carburanti microrganismi

carbone prodotti energetici

gas naturale

p.e etilene p.e acidi organici, solventi p.e amminoacidi, peptidi proteine

propilene antibiotici

….. vaccini

p.e elastomeri enzimi …

fibre ….

Quali sono i prodotti della biotecnologia?

La biotecnologia presuppone l’impiego di organismi (cellule animali, vegetali, funghi, lieviti, batteri ecc.) e quindi il

processo è una lotta tra quello che l’organismo vorrebbe e fare e quello che noi vorremmo che facesse. Ad esempio

l’utilizzo di funghi è interessante perché essi hanno un metabolismo variegato ma hanno dei cicli vegetativi che sono

correlati alle stagioni.

Requisiti per l’ottenimento di un bioprodotto

Al fine di ottenere l’attività metabolica ottimale si effettua un controllo rigoroso della composizione del terreno

colturale, della temperatura di processo e del pH; solitamente non vengono utilizzati i terreni colturali perché molto

costosi ma si utilizzano degli ingredienti che siano degli scarti o residui di altri processi alimentari (melassa, destrine,

siero di latte ecc.).

La temperatura accelera i processi biochimici e quindi il metabolismo del microrganismo però ad un certo punto

la temperatura diventa limitante; in un processo industriale la temperatura tende a crescere sia per il metabolismo

del microrganismo, sia per l’effetto dell’attrito che l’agitazione genera all’interno della coltura tramite giranti.

Generalmente i fermentatori sono dotati di una camicia di termostatazione, ovvero una doppia parete intorno in cui

circola acqua fredda oppure esiste un sistema di serpentini interni, ovvero all’interno vi sono dei tubi dove circola

acqua fredda.

Il pH nel corso di un processo microbiologico invece tende a scendere perché se il microrganismo è aerobio, dalla

fonte di carbonio si ottiene l’acido piruvico, il quale entra nel ciclo di krebs e quelli che si formano e si smontano

sono acidi organici; se il microrganismo è anaerobio il sistema produce un acido organico alla fine come lattico,

propionico, butirrico, acetico ecc. Il microrganismo ha un range di sopravvivenza nell’ambito del proprio pH, quindi

tollera un po’ la riduzione del pH fino ad un certo punto in cui la tolleranza finisce e il microrganismo si blocca.

È fondamentale poi il mantenimento della sterilità che rappresenta l’assenza assoluta di microrganismi e nel

momento in cui si inocula nel fermentatore il microrganismo, deve crescere solo esso. Questo mantenimento è un

punto critico soprattutto nei fermentatori grossi dove il reattore ha volumi importanti dove ci sono ingressi e uscite

regolate da valvole, se le guarnizioni non sono mantenute in maniera corretta rappresentano un punto critico; se il

processo si inquina ovvero entrano altri microrganismi e trovano le condizioni per svilupparsi, si dovrà eliminare

tutto ciò che è stato preparato.

Il controllo dell’idrodinamica del bioreattore: se un microrganismo cresce in un terreno colturale liquido, esso

può aumentare la viscosità della coltura e questo può essere un problema perché il sistema sarà più difficilmente

agitato e aerato se vengono mantenute le stesse condizioni di agitazione e aerazione dell’inizio. Una coltura viscosa

è una coltura dove avvengono meno scambi tra le bolle d’aria che immettiamo e il microrganismo; l’ossigeno deve

disciogliersi nella coltura e se essa è viscosa fa fatica. Bisogna capire se è necessario aumentare l’agitazione e

l’aerazione per permettere che la crescita del microrganismo sia uguale all’inizio.

Alla fine del processo è necessario effettuare il recupero del prodotto, ovvero bisogna cercare una procedura

applicando la quale si ottengono mediamente gli stessi risultati; il problema è il fatto che a fine processo si hanno

volumi elevati di brodocoltura da cui bisogna estrarre centinaia di componenti (polisaccaridi ecc.) e bisogna

separare tutto ciò che c’è dentro; la procedura è rigorosa e deve essere ripetibile. Una volta che il prodotto è stato

isolato da tutto il resto che rappresenta lo scarto, bisogna purificarlo alla % che mi interessa. Dopo la purificazione

del prodotto, esso deve essere stabile e trasportabile. Bisogna mettere a punto un processo che mi consenta ad

esempio di essiccare il mio composto, liofilizzarlo, congelarlo oppure farne solo una forma liquida concentrata ecc.

Nella messa a punto di un processo biotecnologico dall’inizio alla fine, bisogna tener conto anche della parte

economica, ovvero fare un’analisi dei costi partendo dalla formulazione del terreno colturale alla gestione del

processo in termini di energia, stipendi per il personale e costo di immissione sul mercato. Tutto il processo che

deve essere messo in piedi deve avere il minor rischio sia per il personale che per l’impianto, ovvero per l’ambiente

in cui si trova.

Processi biotecnologici

Con un processo biotecnologico è possibile aumentare e amplificare il numero di una biomassa, ovvero serve per

vendere cellule. Un esempio è il processo di produzione del lievito da pane.

In alternativa alla biomassa è possibile vendere qualcosa che effettua il microrganismo, ovvero molecole che il

microrganismo può fare ed accumulare nel corso del processo e le può trattenere all’interno di sé (composti

intracellulari) oppure può lasciarli andare al di fuori di sé (extra-cellulari), ovvero si ritrovano nella parte liquida della

coltura e non nelle cellule.

Una terza categoria di prodotti viene classificata come prodotti di biotrasformazione; in questi processi il

microrganismo fa una reazione chimica su una parte di una molecola che gli do e la trasforma in un'altra che mi

serve. In questo caso il microrganismo agisce come un biocatalizzatore, cioè si sfrutta un’attività enzimatica che ha il

microrganismo per trasformare una molecola in un’altra (esempio: produzione di acido gluconico, il quale è un

acidulante usato molto per veicolare il ferro nelle preparazioni farmaceutiche; esso deriva dal glucosio; se

producessi l’acido gluconico tramite un’ossidazione con catalizzatore come il permanganato si avrebbe una reazione

incontrollata non riuscendo ad essere selettivi sul C1, mentre Aspergillus è in grado di effettuare questa reazione

selettiva senza toccare il resto della molecola). Quindi in queste reazioni bisogna far crescere il microrganismo, poi

lo si mette in contatto con il composto che deve essere trasformato.

Schema generalizzato di un processo di fermentazione industriale

downstream

upstream

Lo schema di un processo di fermentazione rappresenta inizialmente lo stoccaggio degli ingredienti, come le fonti

di C, di N, minerali e acqua (nel caso di microrganismi anaerobi) e successivamente avviene la preparazione del

terreno colturale. Esso viene sterilizzato e arriva poi nel fermentatore che deve essere sterile.

Se il microrganismo è aerobio, bisogna inoltre attivare la linea dell’aria in quanto questi microrganismi necessitano

di ossigeno disciolto nella coltura. Non è possibile offrirgli ossigeno puro perché sono esplosive e infestate, quindi

bisogna utilizzare l’aria che contiene solo il 20%. L’aria deve essere sterile per entrare nel fermentatore e la

sterilizzazione viene effettuata tramite passaggio in filtri sterilizzanti con dei pori tali da trattenere anche le più piccole

impurità.

L’aria entra nel fermentatore nella parte bassa sotto forma di bollicine tramite lo sparger e dopo risale nella coltura,

le bolle creano turbolenza insieme al sistema di agitazione e si ha quindi una coltura movimentata. SI forma la

schiuma e le bolle d’aria nella fase di risalita perdono l’ossigeno e si arricchiscono di anidride carbonica che è lo

scarto metabolico dei microrganismi. Le bolle arrivano in superficie e a causa della schiuma che si è formata è

necessario in testa al fermentatore uno sfiato dove escono i gas che avranno poco ossigeno ma più CO rispetto

2

all’aria che immettiamo.

Questo sistema di preparazione, sterilizzazione e fermentazione fino a quando si spegne il fermentatore prende il

nome di upstream compreso lo sviluppo del microrganismo e la produzione di biomassa.

Una volta spento il fermentatore bisogna recuperare ciò che ci interessa; tutte le operazioni di recupero del prodotto

vengono chiamate downstream. Queste operazioni sono meno simili e replicabili tra di loro perché dipendono da

quello che devo mettere sul mercato; generalmente si ha una fase di separazione del microrganismo dalla parte

liquida e poi in funzione di quello che mi interessa si applicano una serie di passaggi di natura chimica e biochimica,

come estrazione, essiccazione ecc. fino ad avere il prodotto finito.

Gli elementi essenziali da tener conto nella messa a punto di un processo sono il fatto che la mia procedura deve

essere ripetibile, che il microrganismo di partenza sia sempre lo stesso quindi bisogna controllare le colture di

partenza che non devono essere contaminate e nel caso bisogna pensare a degli sviluppi di processo come

aumentare le rese, diminuire i costi.

Bisogna considerare le operazioni a fine processo che sono quelle energeticamente più dispendiose.

Bisogna capire se il prodotto che mi serve è extracellulare o intracellulare; nel caso sia extracellulare bisogna

separare la biomassa che rappresenterà il residuo e lavorare il liquido (generalmente molti composti come l’acido

citrico, lattico e antibiotici sono extracellulari); se invece è intracellulare bisogna allontanare la parte liquida che

rappresenterà il residuo e lavorare le cellule (trovare un sistema per allargare le cellule ecc.). Quindi il downstream

va in funzione di cosa devo mettere sul mercato.

A fine processo si ha sempre un sistema che è bifasico, cioè la brodocoltura contiene una fase solida che sono le

cellule, le quali sono disperse in una fase liquida che contiene i residui e più tutto ciò che produce il microrganismo.

Per separare la biomassa dal surnatante, ci sono processi costosi e altri meno; il processo più semplice è la

sedimentazione ovvero si spegne il fermentatore e si aspetta che la biomassa di depositi sul fondo. Questo però è

un processo lento perché bisogna aspettare che il microrganismo sedimenti; un’alternativa consiste nella filtrazione

convenzionale dove bisogna filtrare la brodocoltura su un filtro dove si impone una pressione dall’alto

perpendicolare al filtro in modo da permettere la spinta sul filtro. La filtrazione però non si può applicare a tutte le

biomasse, ad esempio i batteri sono piccoli e dopo un po’ che la coltura viene filtrata essi si dispongono a formare

uno strato sul filtro da bloccare la filtrazione e bisogna quindi cambiare il filtro; invece i microrganismi miceliari

(muffe e funghi) vengono filtrati bene perché formano i pellet: le muffe quando vengono messe in una coltura liquida

non riescono a tenere le ife aperte e quindi riavvolgono l’ifa a formare il pellet che è una struttura come una pallina

cava all’interno con le ife intorno. Mentre i batteri e i lieviti spesso si centrifugano. Le centrifughe sono dei sistemi

che consentono di separare in funzione della massa, quindi generalmente si ritrova la biomassa legata alle pareti; la

centrifugazione però è un sistema energeticamente molto costoso quindi la filtrazione è preferita.

Questa separazione è una procedura costosa e difficile, quindi ci sono altre strategie. In alcuni casi quando serve un

filtrato colturale, le cellule che vengono separate possono venire reimmesse nel reattore, come ad esempio durante

la produzione di bioetanolo con lievito in cui dal bioreattore esce la coltura e il filtrato che contiene l’etanolo viene

espulso, le cellule vengono reimmesse.

In alcuni casi non si separa subito la biomassa dalla parte liquida:

Esempio 1: il prodotto è associato alle cellule, ovvero ciò che mi serve è attaccato un po’ al micelio (tra la parete e

la membrana); questo è il caso delle statine, in particolare della lovastatina. Il microrganismo è un aspergillus che in

coltura liquida fa lovastatina dove un po’ la trattiene