Fermentazioni industriali

ACIDO LATTICO

L'acido lattico è uno dei primi acidi organici prodotti. Esso ha molti impieghi, si usa come acidulante nel settore alimentare, anche nella birra prima della fermentazione; si usa nell'alimentazione animale, nella formulazione farmaceutica e anche per produrre polimeri biodegradabili (PLA: polimero con cui si possono fare degli imballaggi alimentari).

L'acido lattico viene prodotto da batteri lattici sia omofermentanti che eterofermentanti; nel caso di quelli omofermentanti, viene prodotto solo acido lattico mentre quelli eterofermentanti producono anche acido acetico, CO2 ed etanolo. Se bisogna scegliere un microrganismo per produrre acido lattico, si sceglie quello omofermentante perché dal glucosio questo è l'unico prodotto che si può ottenere, invece gli eterofermentanti sprecano carbonio per fare prodotti non necessari.

Biochinismo: l'acido lattico deriva dal catabolismo del glucosio, attraverso la via glicolitica.

riduzione del piruvato ad opera delle lattato deidrogenasi, a dare acido lattico. Da una mole di glucosio si ottengono 2 moli di acido lattico. La resa reale è il 90% del teorico. La resa di conversione esprime il rapporto tra il prodotto ottenuto in peso e substrato utilizzato in peso. Questa resa in questo processo è altissima (0,9-0,95) e quindi vuol dire che tra il 90 e il 95% di glucosio consumato si trasforma in acido lattico. Processo: si utilizza un omofermentante che quello per eccellenza è il Lactobacillus delbruckii subspecie bulgaricus (non si usa lo Streptococcus perché è meno acido tollerante). Questo microrganismo è termofilo quindi la temperatura di processo è 40-45°C e come substrato viene usato glucosio, il quale viene fornito non puro ma ci sono in commercio degli sciroppi di glucosio (poco costosi). Se mettiamo 150g/L di glucosio, il 90-95% (resa di conversione) di questo diventa acido lattico quindi la resa di conversione è di 135-142,5g/L.

La fermentazione è 135g/L di acido lattico. Dal punto di vista biotecnologico bisogna controllare il pH, il quale viene mantenuto tra 5,5 e 6,5 in modo che il microrganismo continui a usare il substrato. L'acido lattico rimane nella parte liquida della coltura, le cellule però le utilizzo comunque per venderle.

In un fermentatore c'è un controllo del pH, ovvero c'è una sonda immersa nella coltura ed un intervallo di pH consentito; quindi se il pH rimane tra 5,5 e 6,5 non si attiva nessuna correzione mentre se il pH scende sotto il livello di 5,5 si attiva un sistema che consente l'ingresso di una base per rialzarlo; generalmente si tratta di idrato d'ammonio (ammoniaca). Non è necessario aerare la coltura perché è un microrganismo anaerobio e si ha il sistema però di agitazione per tenere omogenea la coltura ed evitare la sedimentazione delle cellule sul fondo. Se uso l'ammoniaca e si forma acido lattico,

quindi può essere recuperato. Per controllare il pH, si può anche aggiungere carbonato di calcio al terreno colturale. Il carbonato di calcio è una polvere insolubile a pH neutro, quindi quando il terreno viene formulato a pH 6-7, si forma una polvere sul fondo del fermentatore. Man mano che il pH scende a causa della produzione di acido lattico, il carbonato di calcio si dissolve e si forma il lattato di calcio insieme all'acido lattico. Se si conosce la quantità di acido lattico che si forma, è possibile calcolare le mole utilizzando il suo peso molecolare. Queste mole sono stecchiometriche rispetto a quelle di carbonato di calcio necessarie, quindi si può determinare la quantità di carbonato di calcio da aggiungere all'inizio del processo. Il lattato di calcio che si forma non è solubile e si deposita sul fondo del fermentatore, dove può essere recuperato.

questo è comodo perché alla fine del processo, si ferma il fermentatore e si lascia sedimentare e quello che precipita è già il lattato di calcio. Il tutto avviene in un arco di tempo di circa 72 ore, quindi in massimo tre giorni si ha la trasformazione del glucosio in acido lattico. La resa di conversione è molto alta (90-95%) perché è un prodotto spontaneamente accumulato dal microrganismo (di vera fermentazione) e quindi non si ha nessun problema dal punto di vista enzimatico. Le dimensioni medie del microrganismo sono a bastoncino piuttosto lungo che non si separa facilmente, quindi la coltura a fine processo deve essere centrifugata per poter separare la biomassa.

ACIDO CITRICO
Esso è un intermedio del ciclo di krebs quindi la sua produzione è più complicata. L'acido citrico è stato estratto dagli agrumi (limoni e limetta). Attualmente più del 90% dell'acido citrico viene ottenuto per via

fermentativa; essotrova grande impiego nel settore alimentare, ad esempio nelle bevande analcoliche (coca cola, fanta, succhi difrutta), nelle caramelle e viene utilizzato anche come veicolante del ferro in farmaceutica e nei detergenti sostituiscei fosfati. Dal punto di vista industriale esso viene prodotto da una muffa Aspergillus niger che è aerobia ed è statoanche sviluppato un processo con un lievito che si chiama Yarrowia lipolytica; questo però ha degli inconvenientiperché produce oltre all’acido citrico anche altri acidi che sono poi difficili da separare. È preferibile quindi l’utilizzodi Aspergillus perché la produzione è più selettiva.

Biochinismo: l’acido citrico è il primo intermedio del ciclo di krebs: il glucosio arriva a piruvato tramite la glicolisi eil piruvato che ha 3C perde un atomo di C, si lega al CoA e diventa acetil-CoA, si combina con l’ossalacetato ediventa citrato.

citrato viene subito trasformato in cis-aconitato dall'enzima aconitasi. Se quello che ci interessa è un intermedio bisogna cercare di bloccare l'enzima a valle della produzione della molecola che ci interessa. Se viene bloccata l'aconitasi si ha l'accumulo del citrato, ma il metabolismo microbico è finemente regolato quindi quando l'acido citrico raggiunge un certo livello (concentrazione) arriva ad inibire uno dei primi enzimi della via metabolica. Questo enzima che viene inibito è la PFK (fosfofruttochinasi) che trasforma il fruttosio-6-fosfato in fruttosio-1,6-bifosfato nella via glicolitica che sta a monte. Questa rimozione dell'inibizione si ottiene togliendo il manganese nel terreno colturale e aumentando invece gli ioni ammonio. Questa modifica al terreno colturale è una modifica dei cofattori degli enzimi. Il manganese è uno ione che tende a bloccare la PFK, mentre l'ammonio è un attivatore di questo enzima.

In questo modo si antagonizza l'inibizione per far lavorare in modo migliore la PFK. Successivamente bisogna bloccare l'attività dell'aconitasi, la quale lavora avendo come cofattori importanti il ferro e il manganese. Per bloccare l'enzima questi vengono tolti dal terreno in modo che l'enzima lavori male e si mette il rame che compete con il sito attivo in cui c'è il ferro e si lega al sito ma questo non funziona. Questi metalli sono principalmente presenti nell'acqua di rete che viene utilizzata per diluire tutti gli ingredienti, i quali non si sciolgono in acqua distillata ed è per questo che si usa l'acqua di rete. L'acqua di rete a seconda delle zone può contenere diversi metalli in quanto le tubature sono costituite da ferro. L'altro componente che può avere questi metalli è il melasso che è l'ingrediente principale che si usa come fonte di C; i melassi sono dei

concentrati di zuccheri (saccarosio) che derivano o dalla barbabietola o dalla canna da zucchero; sono vegetali quindi nella loro formulazione può esserci qualche componente che deriva dal suolo. In questi impianti l'acqua viene rigorosamente controllata e trattata per eliminare ferro e manganese ed eliminare il rame, anche il melasso viene trattato. Processo Per fare acido citrico da Aspergillus niger esistono due tipi di processi industriali: uno prevede l'allestimento di colture di superficie liquide statiche e l'altro prevede l'allestimento di colture sommerse. Storicamente è nata prima la coltura di superficie. Attualmente più dell'80% dell'acido citrico viene prodotto in colture sommerse. Aspergillus niger si mostra come dei conidi neri e delle ife color crema in piastra. Il processo di superficie prevede la formulazione di un terreno liquido e invece di riempire il fermentatore, si riempiono dei vassoi, i quali hanno

Un' altezza di 20-25cm. Il terreno viene preparato in un tank e viene aliquotato nei vari vassoi, i quali vengono impilati uno sopra l'altro in camere chiuse. Il terreno contiene la fonte di carbonio ad una concentrazione di 160g/L, che può essere il melasso. Successivamente bisogna aggiungere ferro e manganese in bassa concentrazione (max 0,5mg/L), ferrocianuro e nitrato di ammonio. Il pH iniziale è lievemente acido (max 6,5). Una volta costituito il terreno colturale, esso viene messo nei vassoi impilati in queste camere chiuse e i vassoi vengono sterilizzati. Una volta che la camera ha finito la sterilizzazione, si inietta uno spray di spore, le quali si diffondono nell'aria della camera e si depositano sulla superficie dei vassoi. La temperatura viene settata intorno ai 30°C in quanto la muffa è aerobia mesofila. Le spore si depositano sul terreno preparato e pian piano iniziano a colonizzare il liquido sui vassoi che sono in condizioni statiche (fermi).

Il micelio inizia a crescere, fa uno strato superficiale dovuto alle ife che si aprono e colonizzano tutto il vassoio e pian piano si formano i conidi neri. In circa 2 giorni il micelio copre la superficie dei vassoi. Questa può essere definita trofofase, ovvero la fase di sviluppo del micelio. Successivamente il micelio inizia ad accumulare l'acido citrico e il processo può durare fino a 14 giorni. A fine processo si avrà un vassoio coperto da un tappeto di muffa che assume una pigmentazione nera completa e sotto rimane il liquido, nel quale viene accumulato l'acido citrico. Quando si ha l'accumulo di un intermedio di una via metabolica, non possiamo bloccarla totalmente altrimenti si ferma tutto il metabolismo quindi l'aconitasi lavora ancora un po', la quale permette di terminare il ciclo di krebs. Quindi la resa di conversione non è molto alta perché una quota di acido citrico viene trasformata; infatti questa resa è 0,7-0,8%.

ovvero il 70-80% viene trasformato in acido citrico. La resa di fermentazione si esprime in kg di acido citrico per metri quadro di superficie colonizzata ed è circa 1,2-1,5kg/m quindi è molto alta. Per recuperare la parte liquida dove è presente l'acido citrico, si prendono i vassoi e si inc