Fermentazioni industriali

Il substrato diventa limitante allo sviluppo

L'equazione è la seguente: e dice che in ogni punto della coltura la velocità specifica è data dal rapporto tra la velocità massima per la concentrazione di substrato in quel momento e Ks + S. Ks è la costante di saturazione per il substrato limitante e si ricava dal grafico ed è la concentrazione di substrato a cui il microrganismo si sviluppa a metà velocità massima, è un parametro convenzionale. Per costruire la curva bisogna allestire una serie di colture: ad esempio B. subtilis viene fatto crescere con una fonte di carbonio come il glucosio con 20 beute in cui viene posto lo stesso terreno ma con concentrazioni di glucosio diverse (20 g/L, 15, 10, 5, 1, 0,5 ecc.); nel lettore multipiastra si va a vedere la velocità massima. Si crea un grafico con la concentrazione di substrato sull'asse x e sulle ordinate la velocità μ: questo grafico si costruisce dal punto C

dalla concentrazione di substrato a metà della velocità massima.sperimentalmente. Il microrganismo nella fase esponenziale e quando decelera si trova in concentrazioni di substrato limitante e la velocità dipende dalla disponibilità di substrato. Più la biomassa cresce, più il consumo cresce e si ha una fase di consumo logaritmico. Per costruire il grafico si allestiscono quindi colture a diverse concentrazioni di substrato e si calcola la velocità massima, si costruisce la curva che scende nella parte in cui la concentrazione di substrato diventa molto bassa e si ricava Ks; il problema in queste determinazioni si ha quando si devono allestire prove a basse concentrazioni di substrato perché se si sbaglia la pesata si possono avere grandi differenze nella determinazione della Ks. Il problema si può superare linearizzando l'equazione, μ = μmax * S / (Ks + S). Ovvero la si inverte facendo i reciproci, partendo da 1/μ = (Ks / μmax) * (1/S) + 1/μmax. Si dividono poi i due membri dell'equazione per 1/μmax e si ottiene 1/μmax = (Ks / μmax) * (1/S) + 1/μmax.

termini al determinatore ottenendo: che può essere scritta come max max1 1 K= + Sμ μ μ S che equivale a un'equazione della retta y = a + bx, dove S rappresenta la x. La retta ha come intercetta sull'asse y a e b che è il coefficiente angolare; i punti saranno quindi su una retta e si valuta il coefficiente angolare e l'intercetta che è 1/μmax e si può calcolare Ks che quindi si determina sperimentalmente più facilmente linearizzando. Ks indica l'affinità del microrganismo per il substrato, quindi è un indicatore di quanto il substrato piace al microrganismo. Considerando la relazione di Monod, Ks sta al denominatore, quindi c'è una relazione inversa rispetto a μ: un alto valore di Ks corrisponde a una bassa affinità, mentre un basso valore indica alta affinità. Con substrati alti il microrganismo raggiunge μmax senza problemi, mentre con substrati limitanti il

microrganismo può avere curve diverse per diverse tipologie di substrato: nel caso della prima curva il microrganismo sta a μ max fino a quando la concentrazione di substrato non diventa troppo bassa e poi declina verso l'origine degli assi ottenendo Ks1; dal punto di vista microbico il microrganismo cresce a μ max per tanto tempo fino a che la concentrazione substrato non diventa molto bassa e poi si verifica una repentina diminuzione dello sviluppo Ks2Ks1 e questo si traduce in una fase di logaritmica molto pronunciata e poi una decelerazione repentina corta. Essendo Ks1 basso, si avrà un'alta affinità perché il microrganismo sta molto in fase esponenziale e riduce la velocità solo quando la crescita è molto limitata. Nel secondo caso invece si parte da concentrazioni alte, μ max però già a concentrazioni consistenti inizia a diminuire e decelera in maniera importante; in questo caso la μ diminuisce anche a livelli diconcentrazione elevati e quindi il microrganismo rallenta lo sviluppo già quando ancora il substrato è presente in maniera consistente. Questa fase di decelerazione sarà molto lunga e non repentina, Ks2 è più alto e quindi l'affinità sarà minore. Dal punto di vista della gestione della coltura batch bisogna scegliere un substrato che fornisca una Ks bassa perché corrisponde a un'alta affinità. Se è bassa Ks al denominatore diventa trascurabile e quindi μ = μ max e se si ha un substrato idoneo per sviluppo microbico microrganismo si sviluppa per molto tempo a μ max e non si riesce a influire sulla crescita microbica perché va al massimo e non si hanno variazioni velocità in quelle condizioni. Non è possibile influire sulla crescita e questa è una caratteristica della coltura batch. La Ks misura quanto è affine un substrato per il microrganismo. Nella curva di sviluppomicrobico si ha il tempo in ascissa, mentre sulle ordinate è riportato il log delle cellule per grammo; la prima è la fase lag di latenza, poi il microrganismo inizia a svilupparsi a velocità sempre più alta fino alla fase esponenziale in cui si ha la massima velocità possibile per le condizioni colturali; poi il substrato diminuisce o si ha l'accumulo di qualcosa di tossico e la velocità diminuisce fino alla fase stazionaria dove tante cellule crescono quante muoiono. Nelle altre fasi si hanno la diminuzione di sviluppo e di sopravvivenza che dal punto di vista industriale non sono importanti. È importante conoscere il valore della popolazione inizialmente incubata e la massima velocità di sviluppo; il valore finale è la massima popolazione raggiungibile. μ max si calcola come la tangente della curva di sviluppo o come il coefficiente angolare della parte di retta che è corrispondente alla fase logaritmica: tanto

più è pendente, tanto più μmaxè alta e il microrganismo arriva alla popolazione finale in tempo breve perché ci mette poco a utilizzare il substrato; al contrario, più la pendenza della curva è piatta, più μmax è bassa. L’equazione di Monod ha μ = μmax * S / (K + S) che è la velocità specifica che in ogni punto è data dalla formula: con μmax che è la massima velocità, S è il substrato mentre Ks è la concentrazione di substrato per cui il microrganismo si sviluppa a μmax/2. Per calcolarlo si fanno tante prove partendo da un substrato a concentrazione elevata e diminuendolo; si ottengono differenti curve di sviluppo e per ognuna si calcola μ e si crea un grafico trovando una curva e due zone: una in cui μmax non varia alla concentrazione di substrato che di solito è elevata, nel momento in cui il substrato inizia a diventare limitante la μmax.

diminuisce fino a quando per S0 μ è zero. Kssi calcola da μmax e trovando ½ di quel valore e poi facendo l’intercetta e trovando il dato di Ks che è laconcentrazione di substrato a cui il microrganismo si sviluppa a ½ μmax. Ks è un’indicazione di quanto ilmicrorganismo è affine al substrato: con un’alta Ks si ha una bassa affinità, con una bassa Ks si ottiene un’altaaffinità. Se il microrganismo per concentrazioni di substrato alte diminuisce la velocità vuol dire che non èaffine al substrato e Ks è più alta rispetto alla curva in cui μmax rimane anche per concentrazione di substratobassa. Questa determinazione grafica può avere degli errori perché quando si fanno beute a bassaconcentrazione di substrato un errore può comportare grandi differenze perché Ks può avere anchedimensione di mg/L, quindi per essere più precisi si La formattazione del testo utilizzando tag html è la seguente:

diminuisce fino a quando per S0 μ è zero. Kssi calcola da μmax e trovando ½ di quel valore e poi facendo l’intercetta e trovando il dato di Ks che è laconcentrazione di substrato a cui il microrganismo si sviluppa a ½ μmax. Ks è un’indicazione di quanto ilmicrorganismo è affine al substrato: con un’alta Ks si ha una bassa affinità, con una bassa Ks si ottiene un’altaaffinità. Se il microrganismo per concentrazioni di substrato alte diminuisce la velocità vuol dire che non èaffine al substrato e Ks è più alta rispetto alla curva in cui μmax rimane anche per concentrazione di substratobassa. Questa determinazione grafica può avere degli errori perché quando si fanno beute a bassaconcentrazione di substrato un errore può comportare grandi differenze perché Ks può avere anchedimensione di mg/L, quindi per essere più precisi si

linearizza la curva come l'equazione di una retta facendogli inversi. Nella retta l'intercetta è 1/μmax e il coefficiente angolare è Ks/μmax.

Si lavora prima sulla determinazione di μmax: i dati si riferiscono alla conta totale in termini di cellule/mL di un batterio lattico Lactobacillus sakei quando viene messo in una coltura batch. Al tempo zero si ha l'inoculo e poi si valuta la conta totale ai tempi previsti. La prima cosa da fare è trasformare in log; si trasformano tutti i dati nei logaritmi. Si può quindi costruire il grafico a dispersione con presente sull'asse delle ascisse il tempo e sull'asse delle ordinate il log cellule/mL; per calcolare μmax bisogna prendere la parte lineare della curva nella fase esponenziale e calcolare il coefficiente angolare (da 2 ore a 4 ore) e si costruisce la retta e si aggiunge la linea di tendenza e l'equazione. Da quest'ultima si nota che il coefficiente angolare è

0,2978 che è quindi la μmax determinata graficamente.

Log cell/ml Determinazione μmax

8,7 8,5

8,6 y = 0,2978x + 7,2596

8,4

8,3 8,2

8,1 8

7,9 7,8

7,7 7,6

0 1 2 3 4 5

0 2 4 6 8

Ci sono dei software che lavorano sulla torbidità ed è così possibile valutare l'aumento e rendere il valore di μmax. Per calcolare la KS si devono fare tante prove e calcolare μmax e per ogni concentrazione di substrato da bassa ad alta si ottengono le μmax: dal grafico si ottiene un'area in cui μ non varia ed è alta, poi la curva inizia a scendere e si può calcolare la μmax/2 a cui corrisponde la Ks.

μ

1,2

1,0

0,6

0,4

0,2 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

Concentrazione S

Questa determinazione è scomoda 1/μ e quindi si fa la linearizzazione calcolando i reciproci 1/S e 1/μ e si fa la retta; si aggiunge la linea di tendenza e si vede l'equazione y = 0,2178x + 0,9523