Fermentazioni industriali

Fermentazioni industriali

Esercitazione da fine di ottobre, iscrizione da UNIMIA.

Esame 3 domande:

• Produzione di un acido organico: lattico, citrico ecc.
• Metodo per coltura: coltura batch, feed-batch o continua.
• Altro argomento: immobilizzazione, coltura non convenzionale ecc.

Turni laboratorio: martedì (14-16), mercoledì (10.30-12.30), giovedì (9-11).

Introduzione

I microrganismi sono noti da molti anni ma il loro contribuito nel settore alimentare è stato sfruttato in modo inconsapevole fino alla nascita del microscopio; l’uomo ha sfruttato i microrganismi fin dai tempi degli Egizi ma fino a che non si è inventato il microscopio non si sapeva quale fosse il microrganismo che causava le diverse trasformazioni. La biotecnologia nasce dopo la comprensione del mondo dei microrganismi.

Il termine biotecnologia è la congiunzione di due termini: la biologia è lo studio degli esseri viventi in generale e delle leggi che li governano, mentre la tecnologia riguarda l’applicazione di tecniche, procedure e strumenti per la soluzione di problemi pratici e l’ottimizzazione delle procedure. La biotecnologia tiene insieme le procedure tecniche che vengono applicate al settore della biologia; si aggiunge poi il termine “microbica” perché con questa si ha l’applicazione delle biotecnologie direttamente sul microrganismo e sul processo di sviluppo. In particolare, nel caso del processo l’applicazione è fatta sui parametri di processo per le fermentazioni industriali, mentre nel caso del microrganismo si utilizzano tecniche genetico-molecolari.

Questi due campi sono entrambi importanti e nel caso del microrganismo la tecnica è più raffinata, mentre nel caso dei parametri di processo si ha la parte più applicata in campo industriale. In un processo biotecnologico si può usare una cellula microbica o animale o vegetale o un componente di queste (enzima, mitocondri) per ottenere beni (acido citrico, antibiotico, lievito da pane) o servizi (depurazione effluenti, decolorazione). In funzione del campo di applicazione si hanno diversi tipi di biotecnologie:

• Si parla di biotecnologia rossa quando si fa riferimento all’ambito farmaceutico-biomedico, quindi ad esempio quando si fa uno screening dei microrganismi in grado di sintetizzare molecole ad alta attività farmacologica, come nel caso delle statine che sono dei farmaci usati per abbassare i livelli di colesterolo nel sangue e che vengono prodotte da Aspergillus, o la produzione di insulina che è un peptide che ha la capacità di abbassare il glucosio ematico, o quando si usano tecniche di ingegneria genetica per sostituire geni mutati per farli ritornare nella condizione iniziale.
• La biotecnologia bianca si riferisce alla messa a punto di microrganismi in grado di produrre molecole o enzimi che hanno ricaduta a livello industriale per specifiche reazioni, come l’enzima che facilita la decolorazione di alcuni tessuti, oppure le pectinasi che sono in grado di ridurre la viscosità dei succhi di frutta, oppure i composti come polisaccaridi che hanno attività addensante; la biotecnologia bianca è molto in competizione con i processi chimici tradizionali: la differenza tra un processo condotto con una biotecnologia o con la sintesi chimica è il minor impatto ambientale perché con i microrganismi non si utilizza una temperatura elevata o una pressione elevata o solventi quindi si ha un impatto minore e i costi potrebbero essere inferiori (non sempre). La produzione consiste nella messa a punto di enzimi, quindi catene di amminoacidi, che hanno una strutturazione tridimensionale fondamentale per essere utilizzati come catalizzatori di reazioni. La produzione di enzimi per via biotecnologica è uno dei comparti di più di notevole interesse.
• La biotecnologia verde si occupa degli aspetti applicati al settore della produzione primaria (agricoltura, ambiente) e una delle produzioni più importanti è la produzione di fertilizzanti e fitofarmaci che hanno un minor impatto sull’ambiente rispetto a quelli ottenuti per sintesi chimica, quindi si ottiene un processo vegetale a minore impatto ambientale. Queste biotecnologie servono per migliorare alcune caratteristiche della pianta o del frutto che produce selezionando ad esempio una pianta che produce pomodori che hanno una maggiore conservazione oppure un tipo di mais che resiste meglio ai parassiti. Una delle applicazioni riguarda il mais BT: Bacillus thuringensis è un batterio gram positivo in grado di produrre una tossina che agisce contro l’esoscheletro di alcuni parassiti che attaccano le piante quindi si fanno colture, si estrae la tossina che viene usata come fitofarmaco; inoltre, sono anche state messe a punto delle piante che hanno la capacità di produrre la tossina senza avere il bisogno di un bioreattore e di un trattamento sulla pianta ma il parassita viene direttamente a contatto con la tossina prodotta (geneticamente modificata). C’è quindi un ampio dibattitto sulla compatibilità di questi processi e la sicurezza di impiego di questi microrganismi. Il dibattito sullo sfruttamento delle biotecnologie è importante e c’è ancora molto da discutere.
• La biotecnologia blu riguarda lo sfruttamento di organismi (anche micro) che normalmente risiedono nelle acque per sviluppare nuovi prodotti o prodotti con caratteristiche diverse; le acque possono essere di lago, fiume, mare, oceano, fosse sottomarine, acque termali ecc. I microrganismi che abitano in habitat particolari possono avere caratteristiche particolari, ad esempio se si fanno dei prelievi nella zona delle solfatare, i microrganismi isolati sono più resistenti al calore, quindi sono termostabili e i prodotti che vengono sintetizzati possono avere una termostabilità che a livello industriale può servire: una proteasi che disgrega le proteine in un detersivo può essere prodotta da un microrganismo e se è più termostabile rimane anche a temperature più elevate.

Biotecnologie tradizionali e innovative

Le biotecnologie sono suddivise in due categorie: tradizionali e innovative; quelle innovative sono quelle più recenti e che prevedono la manipolazione del DNA aprendo la catena, mentre quelle tradizionali sono più legate ai processi fermentativi come produrre insilati di mais, la fermentazione alcolica o la lievitazione di un impasto quindi sono tecnologie già usate in maniera inconsapevole e sono relative al settore dell’agricoltura, della zootecnia, dei biogas e delle trasformazioni biologiche come la produzione di yogurt, kefir ecc. Le biotecnologie innovative sono quelle che prevedono la manipolazione del materiale genetico e possono avere ricadute su quelle tradizionali e in genere si mette a punto una manipolazione genetica per avere un microrganismo che, ad esempio, produce elevati livelli di enzimi fermentativi che poi vengono usati per la fermentazione alcolica, quindi sono biotecnologie sono strettamente connesse e interdipendenti. Sulla scala industriale le biotecnologie trovano applicazione in tanti ambiti: industria alimentare, chimica (biopolimeri per fare bioplastiche), negli enzimi che vengono usati per la formulazione di detersivi o mangimi animali per aumentarne il valore nutrizionale, medicina, farmaceutico, biorisanamento (batterio in grado di eliminare croste nere che si sedimentano sui monumenti), ingegneria soprattutto in campo ambientale per utilizzare al meglio i reflui per produrre altra energia, energie alternative, agrario.

Le biotecnologie possono essere un rischio se vengono applicate senza delle regole: da questo è nato un dibattito, da cui si è convenuto che è fondamentale divulgare la scienza in modo tale che la popolazione capisca le potenzialità e i rischi ed è importante avere un confronto aperto e democratico. È fondamentale applicare le biotecnologie in modo da tutelare i diritti individuali, evitare la discriminazione sociale, rispettare l’ambiente e la biodiversità, valorizzare le ricadute economiche ma anche tutelare l’etica della salute mondiale. Nell’ultimo periodo è nato un dibattito riguardo il termine “biodiplomazia” che mette a fuoco una serie di problemi che la società affronta: il cambiamento climatico e le ricadute nel settore alimentare, la food security quindi la produzione di alimenti sicuri, la crescita della popolazione, lo sviluppo dell’umanità, il mantenimento degli ecosistemi, garantire l’energia per produrre per tutti. È fondamentale un approccio olistico (comprensivo da più punti) che serva a migliorare la gestione globale delle risorse naturali del pianeta. La biotecnologia serve quindi per favorire lo sviluppo del pianeta con un migliore sfruttamento delle risorse naturali e una promozione di circuiti di economia sostenibile. Ciò che può fare la biotecnologia per facilitare lo sviluppo sostenibile è partire da un’economia circolare: si parte da una risorsa e si producono beni o servizi che possono essere ricircolati. Ad esempio, la biotecnologia con una fonte rinnovabile come la cellulosa (di carbonio glucosio beta) molto diffusa sul pianeta che non è tanto sfruttata può migliorarne l’utilizzo cercando microrganismi in grado di degradarla a dei monomeri che poi vengono utilizzati per sostituire parzialmente le plastiche, quindi per produrre bioplastiche evitando l’utilizzo di plastiche non rinnovabili; poi la biotecnologia può servire anche a ottimizzare o disegnare meglio il prodotto finito in modo che abbia un uso più efficiente da parte delle persone quindi i monomeri possono essere usati per la creazione di tessuti che hanno una durata più elevata, o plastiche durevoli, più riciclabili o più biodegradabili. Bisogna sempre facilitare la degradazione di quello che rimane dal processo produttiva: se si arriva a fonti rinnovabili si completa il ciclo.

Processi fermentativi e confronto con la sintesi chimica

Nel caso della biotecnologia applicata ai processi fermentativi bisogna tenere conto di diversi aspetti: il tipo di reattore, di coltura, di terreno, il tempo necessario, come risparmiare energia e cercare di migliorare la resa di prodotto ottenuto. La ricerca è un punto cardine e coinvolge università, per cercare di migliorare le condizioni favorevoli per migliorare il processo ed ottimizzare ciò che si sta facendo o per la messa a punto di un processo nuovo. L’applicazione del risultato di una ricerca che migliora un processo fermentativo è importante per decidere che investimenti fare. È possibile fare un confronto tra biotecnologia e sintesi chimica: quest’ultima è conveniente per fare molecole semplici come etilene, propilene che possono servire come monomeri per fare fibre ecc. Non si hanno microrganismi che fanno questi composti quindi la sintesi chimica è conveniente in questo caso. Quando si hanno processi di produzione di molecole complesse strutturalmente e funzionalmente, come proteine, antibiotici ed enzimi, conviene la biotecnologia perché il microrganismo produce l’enzima legando gli amminoacidi di solito la produzione dell’enzima avviene accumulandolo all’interno o all’esterno, mentre per via chimica è molto più complesso in quanto è necessario legare gli amminoacidi. Questi processi sono difficili per sintesi chimica quindi le biotecnologie vengono sempre preferite per la produzione di molecole complesse. Si ha una competizione nel caso di molecole non complicate strutturalmente in quanto sono possibili due vie: nel caso di molecole come acido lattico, amminoacidi singoli (glutammico), piccoli peptidi il processo dipende da quanto costa la fonte di carbonio, di energia ecc.

La biotecnologia non è sempre semplice, il processo biotecnologico va rigorosamente controllato. Il controllo è possibile gestendo la composizione del terreno colturale, della temperatura, del pH e bisogna mantenere sempre la sterilità in quanto non si possono perdere prodotti perché risultano inquinato. È fondamentale mantenere l’idrodinamica del bioreattore controllando la viscosità e l’aspetto della coltura (funghi), quindi bisogna mantenere lo stesso livello di agitazione, aereazione, di disponibilità di nutriliti. Quando si recupera per vendere un prodotto bisogna anche mettere a punto una procedura rigorosa di purificazione che sia efficace perché spesso il terreno di coltura contiene tanti prodotti a fine processo (anche tossici) ed è necessario purificarlo secondo il grado richiesto. È poi fondamentale avere un prodotto stabile nel tempo, il processo deve essere economico perché in un’industria è fondamentale avere un profitto e quindi devono essere economici la produzione, il recupero e l’immissione del prodotto sul mercato; tutto il processo deve essere fatto con il minor rischio possibile per il personale e per l’impianto. L’ambiente deve rimanere isolato dai microrganismi che vengono utilizzati nell’azienda.

Metaboliti primari e secondari e rapporti con lo sviluppo microbico

Un’azienda che fa fermentazioni è dotata di bioreattori, una collezione di microrganismi e allestisce un processo fermentativo: si formula il terreno colturale (substrato con ricetta), si inserisce l’inoculo e nel corso del processo il microrganismo cresce e può accumulare dei componenti primari o secondari. Un metabolita primario è sintetizzato nel corso dello sviluppo microbico mentre cresce, invece quello secondario viene prodotto dai microrganismi dopo che è finito lo sviluppo microbico quando finiscono di crescere. Questi metaboliti secondari hanno struttura chimica complessa, mentre quelli primari sono molecole più semplici. I microrganismi sono in grado di produrre tantissimi composti e più sono voluti, più le strutture sono caratterizzate da una complessità crescente: un lievito rispetto a un batterio fa molecole più complesse e i funghi superiori composti ancora più complessi.

Le capacità biochimiche dei microrganismi sono vastissime e quindi si ha un’ampia gamma di molecole che possono essere prodotte dai processi metabolici, che si distinguono principalmente in aerobi e anaerobi. Il metabolismo microbico è dato da due fasi: una catabolica che avviene sempre prima e poi segue quella anabolica; il microrganismo viene inoculato in un terreno e poi degrada i costituenti per produrre dell’energia. Successivamente dopo aver prodotto energia e intermedi inizia la fase anabolica di biosintesi e quindi di creazione di nuove cellule; tutte queste reazioni sono finemente regolate perché il microrganismo non spreca energia, indirizza le reazioni verso ciò che gli serve al momento.

• Il metabolismo anaerobico è tipico batteri lattici, non serve ossigeno in quanto i microrganismi riescono ad accumulare spontaneamente alcuni acidi, come l’acido lattico, butirrico, propionico; hanno un metabolismo semplice. I batteri lattici con il metabolismo anaerobio dal substrato arrivano a degli intermedi, producono energia e potere riducente NADH; nel metabolismo anaerobio si ha poca ATP prodotta (ad esempio 2 ATP ogni volta che glucosio diventa acido lattico). Se una cellula recupera poca ATP cresce poco perché non ha tanta energia per costruire nuove molecole, quindi il substrato viene usato per fare il catabolismo ma guadagnando poca energia come ATP per far crescere le cellule. Ad esempio, nella via dei batteri lattici omo-fermentanti si hanno 2ATP prodotte dal glucosio all’acido lattico e il NADH viene rigenerato a NAD+. In questi microrganismi si accumulano spontaneamente tanti metaboliti finali, come l’acido lattico che viene prodotto in grandi quantità perché il ciclo viene fatto tante volte per produrre ATP; il NADH deve essere rigenerato perché altrimenti il metabolismo si blocca. Questo consente di trasferire gli elettroni dal NADH al piruvato che diventa acido lattico.
• I microrganismi aerobi hanno un metabolismo più complesso perché hanno la glicolisi è comune, ma poi l’acido piruvico viene trasformato in acetil-COA e va nel ciclo di Krebs che è molto complesso e produce molecole che vengono usate per produrre amminoacidi, proteine, acidi organici e intervenendo nel metabolismo è possibile ottenere degli accumuli. I microrganismi aerobi sono molto diversi, utilizzano il substrato e producono energia, potere riducente, intermedi e in questa fase si ha il glucosio che diventa piruvato, poi seguono il ciclo di Krebs e la catena di trasporto degli elettroni; queste parti sono fondamentali perché consentono di produrre molta più ATP e il ciclo di Krebs produce tantissimi intermedi con la possibilità di avere un anabolismo molto importante (costruzione di materiale). L’energia che recupera un microrganismo aerobio da una molecola di glucosio è molto più alta rispetto a microrganismo anaerobio e facendo il bilancio si arriva a 38 ATP per ogni molecola di glucosio, con tutti gli intermedi del ciclo di Krebs. Il NADH si rigenera a NAD+ trasferendo gli elettroni all’ossigeno formando H2O e non l’acido organico corrispondente. Il ciclo di Krebs è anfibolico perché molti composti servono come base strutturale per costruire parti importanti delle cellule: ad esempio, il citrato è la base per gli acidi grassi e il colesterolo, quindi tutte strutture che stanno nelle membrane; l’alfa-cheto glutarato è utilizzato per la sintesi di molti amminoacidi, neurotrasmettitori e basi puriniche; il succinnil-COA è usato per produrre le porfirine, l’ossalacetato per gli amminoacidi e le basi primidiniche. Dagli amminoacidi si riescono a costruire quindi le proteine e gli enzimi che sono deputati alle reazioni che servono al microrganismo.

Se si hanno microrganismi aerobi o anaerobi nel processo tecnologico si lavora in modo diverso. Gli anaerobi sono utilizzati per sfruttare il microrganismo per produrre metaboliti finali accumulati alla fine e di solito sono primari come l’acido lattico; questi recuperano il substrato dal terreno, producono tanto prodotto, poca ATP e cellule. I microrganismi aerobi hanno un metabol